СПОСОБ ПРЕЗЕНТАЦИИ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЕ ХОЗЯИНА, ОСНОВАННЫЙ НА ПРОТЕАСОМООПОСРЕДОВАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ Российский патент 2006 года по МПК A61K48/00 A61K39/12 C12N15/52 A61P31/12 

Изобретение относится к области иммунологии.

Изобретение может быть использовано в иммунологических, серологических и вирусологических исследованиях по изучению и оценке защитных свойств препаратов нового поколения против вирусных инфекционных заболеваний, а также для разработки методов биологической защиты.

Достижения молекулярной биологии, генетической инженерии, иммунологии и биотехнологии открыли принципиально новые перспективные подходы конструирования различных типов вакцин. Практическую реализацию получили два направления: создание искусственных вакцин путем химического синтеза пептидов, имитирующих протективные антигены патогенов, и путем генно-инженерной технологии. Причем последнее направление получило наибольшее развитие и практическую реализацию. К вакцинам, полученным с помощью генно-инженерных технологий, относятся: векторные рекомбинантные вакцины, ДНК-вакцины, химерные вакцины, трансгенные вакцины.

В начале 90-х годов был предложен принципиально новый подход конструирования вакцин, при котором в качестве вакцинного препарата используется плазмида, содержащая ген(ы), кодирующий чужеродный целевой белок (протективные антигены патогена), так называемая полинуклеотидная вакцина, или ДНК-вакцина [1]. При создании ДНК-вакцин чаще всего используются плазмиды E.coli pUC типа, поскольку последние обеспечивают высокий выход и чистоту ДНК. Для достижения максимальной экспрессии клонированных генов в клетках млекопитающих используются вирусные промоторы, чаще всего цитомегаловирусный.

В настоящее время сконструированы и апробированы на различных экспериментальных моделях полинуклеотидные вакцины против ряда вирусных, бактериальных и паразитарных инфекций [2].

Интенсивная работа ведется по конструированию ДНК-вакцин против флавивирусных инфекций, включая лихорадку Денге и энцефалиты (клещевой, японский, Западного Нила, Сент Луис, долины Муррей) [3, 4].

В рамках международного сотрудничества по борьбе с малярией проводится работа по созданию ДНК-вакцины против малярии, вызываемой Plasmodium falciparum [5].

В ряде экспериментов доказана возможность успешного применения полинуклеотидных вакцин для лечения аллергических болезней [6].

Недавно обнаружено, что полинуклеотидные вакцины могут индуцировать толерантность к экспрессируемым аутоантигенам и, следовательно, использоваться для лечения аутоиммунных заболеваний, в частности диабета [7, 8].

Полинуклеотидные вакцины могут оказаться весьма эффективными не только как средства профилактики, но и в качестве лечебных препаратов при терапии хронических персистентных инфекций, так как они индуцируют сильный клеточноопосредованный иммунный ответ (цитотоксические Т-лимфоциты, Th-1-клетки), который приводит к элиминации патогенов.

Параллельно развитию методов конструирования вакцинных препаратов появляются новые данные о механизмах презентации антигенов иммунной системе хозяина. Так, в настоящее время сформировалось мнение о том, что клеточные органеллы животных - протеасомы - участвуют в процессинге антигенов, представляемых молекулами первого класса главного комплекса гистосовместимости. Реализуется данный процесс в непосредственной связи с убиквитинконъюгирующей системой [9]. Совместно с убиквитином потенциальной специфичностью к протеасомному комплексу обладает и ряд других конститутивных пептидов млекопитающих, что связано с наличием в их последовательностях сочетаний некоторых аминокислотных остатков, являющихся сильными сигналами деградации. К числу последних относится фермент орнитиндекарбоксилаза (ODC).

К основным клеточным процессам, регулируемым протеасомной системой, относятся: клеточный цикл и деление, дифференцировка, эмбриогенез, апоптоз, сигнальная трансдукция, репарация ДНК, трансмембранный и везикулярный транспорт, реакция на стрессовые воздействия, в том числе на патогены. Многообразие процессов, регулируемых протеасомной системой, позволяет сделать вывод о ее главенствующей роли в такой кооперативной реакции организма, как иммунный ответ [10]. Использование протеасомоузнающих сигналов, обуславливающих антигенный процессинг и ускоренную презентацию иммунокомпетентным клеткам при конструировании вакцин нового поколения, может позволить получать высокоэффективные защитные препараты с повышенной иммуногенностью.

На сегодняшний день в научной литературе имеются данные об экспериментальной оценке пептидных вакцин, полученных при использовании протеасомной деградации in vitro, против ряда инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии [11, 12]. Однако использование технологии ДНК-вакцинации при реализации механизма направленного протеасомоопосредованного процессинга антигенов не описано.

Способ ДНК-вакцинации при реализации механизма направленного протеасомоопосредованного процессинга антигенов не имеет аналогов в Российской Федерации.

В качестве модельного возбудителя инфекционного заболевания, против которого разрабатываются профилактические средства, выбирают хорошо изученный возбудитель.

Вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) является одним из наиболее полно изученных как структурно, так и с точки зрения иммуно- и патогенеза возбудителей вирусных инфекций. Структурно возбудитель содержит одну молекулу РНК, ковалентно связанную с белком капсида и окруженную димером гликопротеинов оболочки Е1 и Е2, однако в условиях высокой множественности заражения возможно формирование полиплоидных вирионов, содержащих под одним суперкапсидом несколько нуклеокапсидов.

Оба гликопротеина оболочки (Е1 и Е2) имеют значение для сохранения инфекционности и патогенности вируса, однако если Е1 в большей степени определяет этап связывания вируса с рецепторами клеточной оболочки и последующий виропексис, то Е2 преимущественно индуцирует иммунный ответ организма на вирусную инфекцию, что показано в исследованиях с сыворотками реконвалесцентов.

При клонировании фрагментов структурных пептидов вирусов, имеющих антигенные детерминанты, необходимым условием является сохранение наиболее актуальных эпитопов. К настоящему времени антигенная структура гликопротеина Е2 (фиг.1) достаточно хорошо изучена, а эпитопы на его поверхности картированы как американскими, так и отечественными специалистами [13]. Иммунодоминантное положение занимает высоко консервативный участок, в состав которого входят фрагменты гена белка Е2 - М вируса ВЭЛ (фиг.1), расположенный в центральной зоне белка Е2 на небольшом удалении от сайта гликозилирования.

Целью настоящего изобретения является разработка способа ДНК-вакцинации, основанного на протеасомоопосредованной технологии (на примере вируса ВЭЛ) с использованием рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате молекулярно-биологических и иммунологических исследований разработан способ ДНК-вакцинации, основанный на протеасомоопосредованной технологии, с использованием рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP I, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M. Рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M получены в результате последовательного клонирования ген-эквивалентов неструктурного белка nsP1, фрагментов L, М структурного белка Е2 вируса ВЭЛ соответственно в составе гена орнитиндекарбоксилазы сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo.

В качестве контроля используются плазмиды pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, полученные в результате последовательного клонирования гена ODC и фрагмента М гена Е2 вируса ВЭЛ соответственно сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo. Рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М депонированы в Специализированную коллекцию рекомбинантных плазмид Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №№02/1, 02/2, 02/3, 02/4 и 02/5 соответственно.

Характеристика и молекулярно-биологические свойства рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и рС1-neo-Е2-М представлены в таблицах 1, 2.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена диаграмма конформационных эпитопов белка Е2 вируса ВЭЛ, проецированных на клонируемые фрагменты пептида в составе векторных плазмид рЕТ-23b и pCI-neo.

На фиг.2 показана схема ДНК-иммунизации внутримышечно белых мышей-самцов линии BALB/c (8-10 г) рекомбинантными плазмидами pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M и их комбинацией.

Пример выполнения

Пробирки с культурами Е.coli, содержащими рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, извлекают из холодильника, температура хранения минус (20,0±2,0)°С. Проводят культивирование на среде LB с добавлением 25 мкг/мл ампициллина. Продолжительность культивирования составляет от 12 до 18 часов при температуре (37,0±0,5)°С.

Лизис бактериальных клеток осуществляют лизоцимом (10 мг/мл в 0,25 М Трис-HCl, рН 8,0) в присутствии 10%-ного SDS. Хромосомную ДНК удаляют высокоскоростным центрифугированием с последующей двойной экстракцией смесью фенол/хлороформ и одной экстракцией хлороформом. Остатки РНК удаляют методом гель-фильтрации на колонках с сефарозой 2В и осаждают двойным объемом перегнанного холодного 70%-ного этилового спирта. Концентрацию выделенной плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически, учитывая тот факт, что одна оптическая единица при 260 нм соответствует 50 мкг ДНК в 1 мл [14]. После осаждения центрифугированием осадок плазмидной ДНК растворяют в буфере ТЕ до концентрации 1 мг/мл.

Выделенные и очищенные препараты оценивают затем электрофоретически в 0,8% агарозном геле. Электрофорез проводят при температуре (20,0±2,0)°С в течение 18 часов при напряженности электрического поля 1-2 В/см. Размер пластины 20×20 см².

Полученные препараты представляют собой очищенные препараты ДНК рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, pCI-neo-ODC и pCI-neo-Е2-М, которые используются в качестве ДНК-вакцин против вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

Для иммунизации (фиг.2) используют белых мышей BALB/c массой 7-8 г. Водные растворы плазмидных ДНК (концентрация ДНК 1 мг/мл) вводят однократно в мышцу бедра задней лапы белой мыши (-100 мкг ДНК/мышь).

В качестве положительного контроля служат белые мыши, иммунизированные подкожно в холку суспензией желточных мешков, инфицированных вакцинным штаммом вируса ВЭЛ (иммунизирующая доза - 3,7 lg ED₅₀/мышь). Отрицательными контрольными группами при ДНК-вакцинации являются животные, иммунизированные плазмидами, содержащими ген-эквиваленты ODC и пептида М, а также интактные мыши. Использование этих плазмид необходимо для оценки возможного неспецифического действия орнитиндекарбоксилазы и специфического фрагмента белка Е2 на иммунитет лабораторных животных.

Иммунизацию животных проводят трехкратно. Бустерные иммунизации проводят через 4 и 3 недели соответственно. У 50% мышей на 14 сутки отбирают кровь для анализа методом ТФИФА. Остальных животных инфицируют смертельной дозой вирулентного штамма вируса ВЭЛ (100 LD₅₀/мышь). После заражения срок наблюдения за грызунами составляет 14 суток.

С целью изучения иммуногенного и протективного эффекта комбинированной вакцинации лабораторным животным одновременно вводят смесь изучаемых препаратов плазмидной ДНК с ген-эквивалентами фрагмента белка Е2-L и М (pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M).

Иммуногенную активность рекомбинантных плазмид, несущих фрагменты генома вируса ВЭЛ, инъецированных как по отдельности, так и в комбинации, определяют по титру гуморальных антител в сыворотке крови иммунизированных белых мышей с помощью метода ТФИФА. Оцениваемые препараты, их комбинация, группы животных и титры антител представлены в таблице 3.

У всех животных, иммунизированных вакцинным штаммом вируса ВЭЛ (положительный контроль), выявляются специфические антитела к вирусу (в разведении не меньшем, чем 1:100). В то же время у большей части мышей, иммунизированных смесью плазмид pCI-neo-ODC-E2-L+pCI-neo-ODC-E2-M (83%) и плазмидой pCI-neo-ODC-nsP1 (78%) также отмечается положительная сероконверсия (таблица 4).

Протективную эффективность рекомбинантных плазмид рассчитывают, определяя разницу величины процента выживших (после заражения вирулентным вирусом ВЭЛ) мышей в группе, иммунизированной вакцинным штаммом вируса ВЭЛ, и в группе животных, инъецированных рекомбинантной плазмидой или смесью плазмид (при 100% гибели неиммунизированных мышей).

Комбинированная внутримышечная иммунизация плазмидной ДНК со встроенными ген-эквивалентами пептидов L и М белка Е2 вируса ВЭЛ индуцирует у большей части белых мышей выработку специфических антител и защиту от гибели при заражении летальной дозой вирулентного штамма возбудителя (таблица 4).

Таблица 3Доля положительных антисывороток к вирусу ВЭЛ в группах белых мышей BALB/c, иммунизированных плазмидной ДНК совстроенным геном ОДК и фрагментами генома вируса ВЭЛ, определенных с помощью ТФИФА Группа животных, иммунизированныхПоказательПодкожно суспензией вакцинного штамма вируса ВЭЛ (3,7 ЕД _50/мл)внутримышечно (100 мкг/мышь)внутрикожно, методом "генного ружья" (1 мкг/мышь)pCI-neo-ODCpCI-neo-E2-MpCI-neo-ODC-E2-MpCI-neo-ODC-E2-LpCI-neo-ODC-E2-M+ pCI-neo-ODC-E2-LpCI-neo-ODC-nsP1pCI-neo-ODCpCI-neo-E2-MpCI-neo-ODC-E2-MpCI-neo-ODC-E2-LpCI-neo-ODC-nsP1Количество мышей в группе666656765557Отношение средней величины флуоресценции (ВФ) в сыворотке животного контрольной группы к средней ВФ в сыворотках интактных белых мышей9,81,61,11,01,52,11,11,51,31,43,11,39,41,42,11,62,23,31,41,51,51,61,01,98,71,52,32,10,93,92,41,51,51,31,51,16,60,90,81,61,41,51,60,91,01,81,02,211,40,61,11,10,94,31,20,61,21,51,21,09,11,41,21,2-2,71,01,4---1,0------1,2----1,6Процент животных с положительной сероконверсией (%)100-170+1733±2117±1720±2083±1714±140+170+200+2020±2014±14Примечания: 1) белые мыши иммунизировались трехкратно. Бустерные иммунизации проводились через 4 и 3 неделисоответственно. Кровь отбирали через 14 дней после последней иммунизации;2) ответ антител считается положительным, если отношение ВФ_опыт/ВФ_{контроль} равно или более величины 2,1;3) Разведение сывороток 1:10; разведение сывороток мышей, иммунизированных антигеном вируса ВЭЛ - 1:100;4) средняя ВФ и ее ошибка (±δ_х) в сыворотках интактных животных равна 84,9±9,6;5) "-" - нет данных.

Таблица 4Доля белых мышей BALB/c с положительной сероконверсией и выживших после заражения вирусом ВЭЛ в результате иммунизации плазмидной ДНК со встроенным геном ODC и участками генома вируса ВЭЛСпособ иммунизацииДоля животных (%)Группа животных, иммунизированныхИнтактные мышиплазмидойсуспензией вакцинного штамма 238 вируса ВЭЛpCI-neo-ODCpCI-neo-Е2-МpCI-neo-ODC-Е2-МpCI-neo-ODC-E2-LpCI-neo-ODC-E2-L+pCI-neo-ODC-E2-MpCI-neo-ODC-nsP1внутримышечныйс положительной сероконверсией0+1733±2117±1720±2083±1714±14--выживших40±2433±2188±1283±1783±1778±14--внутрикожный («генное ружье»)с положительной сероконверсией0+170+200+2020±20-14±14--выживших43±2033±2140±2438±18-71±18--подкожныйс положительной сероконверсией------100-17-выживших------100-12-нет иммунизациис положительной сероконверсией-------0+17выживших-------0+14Примечания: 1) «-» - нет данных;2) средняя величина показателя и ее ошибка () определялись по таблице B.C.Генеса [15];3) заражающая доза вирулентного штамма вируса ВЭЛ равна 100 LD₅₀/мышь;4) срок наблюдения за животными после заражения 14 суток.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Donnelly J.J., Liu M.A., Ulmer J.B. Antigen presentation and DNA vaccines // Amer. J.Respir. Crit Care Med. - 2000. - Vol.162. - P.190-193.

2. Robinson H.L., Boyle C.A., Feltquate D.M. et al. DNA immunization for influenza virus: studies using hemagglutinin - and nucleoprotein - expressing DNAs vaccine // J. Inf. Dis. - 1997. - Vol.176. - P.50-55.

3. Chang G.J., Davis B.S., Hunt A.R. et al. Flavivirus DNA vaccines: current status and potential // Arm. N.-Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol.951. - P.272-285.

4. Kinney R.M., Huang C.Y.H. Development of new vaccines against dengue fever and Japanese encephalitis // Intervirology. - 2001. - Vol.44, №2/3. -P.176-197.

5. Kumar S., Epstein J.E., Richie T.L. et al. A multilateral effort to develop DNA vaccines against falciparum malaria // Trends Parasitol. - 2002. - Vol.18, №3. - P.129-135.

6. Von Herrath M.G., Whitton J.L. DNA vaccination of treatment autoimmune diabetes // Ann. Med. - 2000. - Vol.32, №5. - P.285-292.

7. Hsu C.H., Chua K.Y., Tao M.N. et al. Immunoprophylaxis of allergen-induced immunoglobulin E and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization // Nat. Med. - 1996. - Vol.2. - P.540-544.

8. Robinson W.H., Garren H., Utz P.J. et al. Proteomics for the development of DNA tolerising vaccines to treatment to immune disease // Clin. Immunol - 2002. - Vol.103, №1. - P.7-12.

9. Hochshtrasser M. Ubiquitin-dependent protein degradation // J. Annu. Rev. Genetics. - 1996. - Vol.30. - P.405-439.

10. Tanaka К. Molecular biology of proteasomes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998. - Vol.247. - P.537-541.

11. Yang Y., Ahn К., Petrson P.A. In vivo assembly of the proteasomal complexes, implications for antigen processing // J.Biol. Chem. - 1995. - Vol.270. - P.27687-27694.

12. Salter R.D., Howell D.N., Cresswell P. Genes regulating HLA class I antigen expression in T-B Lymphoblastoid hybrids // Immunogenetics. - 1995. - Vol.21. - P.235-246.

13. Fields Virology. Edited by B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley et al. - Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers. - 1996. - 480 p.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук ДЖ. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ. под ред. А.А.Баева, К.Г.Скрябина. - М.: Мир, 1984. - 479 с.

15. Генес B.C. Некоторые простые методы кибернетической обработки данных диагностических и физиологических исследований. - М.: Наука, 1998. - 208 с.

Изобретение относится к области иммунологии, а именно к способу презентации вирусных антигенов иммунной системе хозяина, основанный на протеасомоопосредованной технологии, предназначенному для разработки методов биологической защиты. Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате молекулярно-биологических и иммунологических исследований разработан способ ДНК-вакцинации, основанный на протеасомоопосредованной технологии, с использованием рекомбинантных плазмид pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M. Рекомбинантные плазмиды pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M получены в результате последовательного клонирования ген-эквивалентов неструктурного белка nsP1, фрагментов L, М структурного белка Е2 вируса ВЭЛ соответственно в составе гена орнитиндекарбоксилазы сначала в прокариотический плазмидный вектор рЕТ-23b, а затем в эукариотический плазмидный вектор pCI-neo. Преимущество изобретения заключается в разработке полинуклеотидных вакцин, индуцирующих клеточноопосредованный иммунный ответ. 4 табл., 2 ил.

Способ презентации антигенов вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей иммунной системе хозяина, основанный на протеасомоопосредованной технологии, характеризующийся тем, что ДНК-вакцинацию осуществляют с использованием рекомбинантных плазмид, содержащих ген орнитиндекарбоксилазы и ген-эквивалент неструктурного белка nsP1, или ген-эквивалент фрагмента L, или ген-эквивалент фрагмента М гликопротеина оболочки Е2 вируса ВЭЛ, выбранных из группы: соответственно pCI-neo-ODC-nsP1, pCI-neo-ODC-E2-L, pCI-neo-ODC-E2-M, имеющих номера №№02/1, 02/2, 02/3, зарегистрированных в коллекции Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации или сочетанием плазмид pCI-neo-ООС-Е2-L, pCI-neo-ODC-E2-М.