СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ В ПРОБЕ ПАТОГЕННОГО ПОДВИДА FUSOBACTERIUM NECROPHORUM SUBSPECIES NECROPHORUM С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/68 C12N15/31 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ДНК-технологиям, и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и биопромышленности для выявления в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

До настоящего времени выявление патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum проводили на основании сравнения морфологии клеток и колоний на агаре, энзиматических свойств, способности гемолизировать и гемагглютинировать эритроциты, образовывать абсцессы на печени крупного рогатого скота и патогенности на мышах (Recongnition of Biovar С Fusobacterium necrophorum (Fluge) Moore and Holdeman as Fusobacterium pseudonecrophorum sp. nov., nom. rev. ex Prevot 1940) T.Shinjo, K.Hiraiwa and S. Miyazato // International Journal of Systematic Bacteriology, Jan. 1990, p.71-73; Proposal of Two Subspecies of Fusobacterium necrophorum (Fluge) Moore and Holdeman: Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum subsp. nov., nom. rev. (ex Fluge 1886), and Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme subsp. nov. nom. rev. (ex Halle 1898) T.Shinjo, T. Fujisawa and S., Miyazato // International Journal of Systematic Bacteriology, Juli. 1991, p.395-397; Phylogenetic Relationship of Fusobacterium necrophorum A, AB, and В Biotypes Based upon 16S rRNA Gene Sequence Analysis. L.A. Nicholson, C.J. Morrow, L.A. Comer and L.M.Hodgson // International Journal of Systematic Bacteriology, Apr. 1994, p.315-319). Однако эти способы дифференциации имеют свои минусы. Так, диаметр колоний на агаре колеблется от 2 до 4 мм и от 1 до 2 мм, а длина клеток от 30-70 μm до 0,5-20 μm. Оба подвида гемолизируют эритроциты, а агглютинировать их может только Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. К недостаткам реакции гемагглютинации можно отнести то, что 18-20-ти часовая культура Fusobacterium necrophorum, как правило, находится в виде рыхлого осадка, состоящего в основном из нитчатых форм возбудителя. Это не позволяет проводить данную реакцию. По этой же причине приходится выдерживать культуру при комнатной температуре в течение 2-4 суток. Это в свою очередь приводит в ряде случаев к ложноотрицительным реакциям.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выявления патогенного вида Fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции, включающий синтез двух пар олигонуклеотидных праймеров: наружные №1 и №2 для синтеза большего фрагмента ДНК в 546 нуклеотидных пар (нп) и внутренние (гнездовые) №01 и №02, матрицей для которых является больший фрагмент, для синтеза фрагмента в 187 нп с целью повышения специфичности и чувствительности реакции, имеющих нуклеотидные последовательности:

№1 5'-AGT АТС TGA ТТТ ТСТ ACG СС-3', №2 5'-CAG ААТ СТА АТА TTG ТАС АС-3', №01 5'-CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3', №02 5'-ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3' (см. патент РФ N2203951, кл. С 12 Q 1/68, С 12 P 19/30, С 07 Н 21/04 от 10.05.2003). Однако этот способ не позволяет проводить обнаружение более патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum, обладающего дополнительным патогенным свойством - это агглютинировать эритроциты.

Задачей заявляемого изобретения является выявление в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

Поставленная техническая задача осуществляется тем, что способ определения наличия в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице геномной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом размера продуктов ПЦР в 1%-ном геле агарозы, отличающийся тем, что синтезируют пару олигонуклеотидных праймеров: №180 и №190 для синтеза фрагмента ДНК в 537 нуклеотидные пары, наличие которого говорит о присутствии в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum, при этом праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

№180 5'-GCA ACC TCA АТС GGA AGC-3'

№190 5'-CGA TTA CAA GTA CAG GTG G-3'

Праймеры выбираются в области ДНК, характерной для патогенного штамма Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. Праймер №180 используют для синтеза первой цепи комплементарной ДНК гена ompH, кодирующего гемагглютинин, присущий только для Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. Праймер №190 - для синтеза второй цепи кДНК с помощью Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации выбранного участка ДНК в полимеразной цепной реакции. Полимеразную цепную реакцию проводили в течение 27 циклов в следующем режиме: предварительный нагрев ДНК при 95°С в течение 3.0 мин - 1 цикл; далее 25 циклов по три сегмента в каждом: денатурация ДНК при 94°С в течение 0,3 мин, гибридизация при 56°С в течение 0,4 мин, элонгация при 72°С в течение 0.5 мин и 1 цикл - досинтез при 72°С в течение 1.2 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигрирующего в 1.0% геле агарозы.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример. Операция 1. Выделение ДНК Fusobacterium necrophorum из 1-2-х суточной культуры. Культуру Fusobacterium necrophorum, выращенную на среде Кит-Тароцци без кусочков печени, осаждают центрифугированием в течение 6 минут при 8000 об/мин. Среду удаляют. Осадок ресуспендируют в 500 мкл 0,9% NaCl и центрифугируют в течение 6 минут при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 300 мкл 0,9% NaCl.

Операция 2. В пробирку с 300 мкл суспензии исследуемого материала добавляют 80 мкл лизоцима (20 мг/мл), плавно перемешивают и помещают на лед на 25 минут. Затем вносят 40 мкл 10% SDS и 40 мкл протеиназы К (10 мг/мл), перемешивают и выдерживают при +55°С в течение 15-18 часов. Затем вносят 300 мкл смеси: фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:25:0.5), плавно пипетируют и центрифугируют 6 минут при 8000 об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и к ней приливают 1/2 объема смеси хлороформ/изоамиловый спирт (25:0,5), центрифугируют и водную фазу переносят в другую пробирку. К водной фазе прибавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия рН 4,8, 2 объема этанола и выдерживают 40 минут или ночь при -20°С. Пробу центрифугируют 15 мин при 14 тыс.об/мин, к осадку по стенке пробирки приливают 100 мкл 70% этанола, центрифугируют 10 сек, спирт удаляют, а осадок высушивают при +37°С в течение 25-30 мин. Затем растворяют в 20-30 мкл бидистиллированной воды или 10 мМ ТЕ-буфере рН 8,0.

Операция 3. Полимеразная цепная реакция. 1.5 мкл раствора, содержащего ДНК Fusobacterium necrophorum, добавляют к 23.5 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 15 мМ (NH₄)₂SO₄, 3 мМ MgCl₂, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2,5 единицы Taq-полимеразы и по 200 нг праймеров №180 и №190. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 27 циклов: предварительный нагрев ДНК при 95°С в течение 3.0 мин - 1 цикл; далее 25 циклов по три сегмента в каждом: денатурация ДНК при 94°С в течение 0,3 мин, гибридизация при 56°С в течение 0,4 мин, элонгация при 72°С в течение 0.5 мин и затем 1 цикл - досинтез при 72°С в течение 1.2 мин.

Операция 4. Определение размера продуктов ПЦР. 12.5 мкл раствора продуктов полимеразной цепной реакции смешивают с 3 мкл раствора бромфенолового синего и наносят в "карман" 1.0%-ного геля агарозы. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов гидролиза ДНК плазмиды pQPR эндонуклеазой HaeIII. Анализ считают положительным, если продукты ПЦР соответствуют 537 нуклеотидным парам.

Таким образом, способ определения наличия в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице геномной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом размера продукта ПЦР в 1,0%-ном геле агарозы, отличающийся тем, что синтезируют пару олигонуклеотидных праймеров: №180 и №190 для синтеза фрагмента ДНК в 537 нуклеотидных пар, наличие которого говорит о присутствии в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum, при этом, праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

№180 5'-GCA АСС ТСА АТС GGA AGC-3'

№190 5'-CGA TTA CAA GTA CAG GTG G-3'

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биопромышленности. Предложен способ определения наличия в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. Способ предусматривает синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице геномной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции. При этом используют олигонуклеотидные праймеры №180 и №190, а анализ размера продукта ПЦР проводят в 1,0%-ном геле агарозы. Способ может быть использован в ветеринарии.

Способ определения наличия в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum с помощью полимеразной цепной реакции, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице геномной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом размера продукта ПЦР в 1,0%-ном геле агарозы, отличающийся тем, что синтезируют пару олигонуклеотидных праймеров № 180 и № 190 для синтеза фрагмента ДНК в 537 нуклеотидных пар, наличие которого говорит о присутствии в пробе патогенного подвида Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum, при этом праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:

№ 180 5'-GCA ACC TCA АТС GGA AGC-3';

№ 190 5'-CGA TTA CAA GTA CAG GTG G-3'.