СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ (БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК) КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ В ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2000 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 A61K39/15 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии и биопромышленности для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (вирусной диареи телят) (ВД КРС), а также контаминации культур клеток и животных этим вирусом при производстве вакцин против классической чумы свиней в виду серологического родства этих вирусов.

До настоящего времени основным способом диагностики болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, вызываемой вирусом вирусной диареи, является длительная процедура, основанная на постановке реакций нейтрализации на культуре клеток МДВК с парными пробами сывороток. Пробы сывороток берутся с интервалом 3-4 недели от одних и тех же животных и исследуются одновременно.

К недостаткам данного способа можно отнести то, что этот метод исследования не позволяет различать вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), от вируса классической чумы свиней.

Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выявления вируса вирусной диареи КРС, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение РНК из инфицированных тканей, обратно-транскрибирование РНК обратной транскриптазой AMV, амплифицирование полученной комплементарной ДНК с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух специфичных для ВД КРС штамма NADL праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (Detection of bovine viral diarrhea (BVD) virus using the polymerase chain reaction. C.Hertig, U. Pauli, R. Zanoni and E.Peterhans//Veterinary Microbiology, 1991, v.26.- p. 65-76).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, циркулирующих среди животных, так как олигонуклеотидные праймеры синтезируются по нуклеотидной последовательности одного штамма NADL, что вызывает недостаточную специфичность при выявлении других штаммов вируса вирусной диареи. Дифференциация вируса вирусной диареи крупного рогатого скота от вируса классической чумы свиней (КЧС) для этого способа не проводилась.

Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможности дифференцировать вирус ВД КРС от близкородственного вируса КЧС при сохранении чувствительности и быстроты проведения анализов.

Сущность изобретения заключается в том, что на первом этапе выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры комплементарные консервативной области наибольшего сходства геномов различных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, которая имеет наибольшие отличия от нуклеотидных последовательностей РНК штаммов вируса классической чумы свиней. Затем синтезируется комплементарная ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и проводится амплификация синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомянутых праймеров.

Способ осуществляется следующим образом.

Выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, например: N 1- 5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC- 3' и N 2 - 5'-GGA AGG GAT АСА ACG GGC - 3'. Праймеры выбираются в консервативной области геномов различных штаммов вируса болезни слизистых оболочек (ВД КРС) так, чтобы они имели наибольшее сходство между соответствующими участками вирусной РНК штаммов болезни слизистых оболочек и различия с нуклеотидными последовательностями РНК вируса классической чумы свиней. Первый праймер используют для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК ВД КРС, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса вирусной диареи КРС и отличающиеся от последовательностей РНК вируса КЧС. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Новые признаки технического решения по совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется большее число штаммов вируса вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота и их дифференциация от серологически родственного вируса классической чумы свиней.

Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможность дифференцировать два вида вирусов без снижения чувствительности способа выявления вируса вирусной диареи крупного рогатого скота.

Поставленная цель достигается выбором и синтезом олигонуклеотидных праймеров: N 1-5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC-3' и N 2-5'-GGA AGG GAT АСА ACG GGC-3'. Праймеры были выбраны в консервативной области геномов различных штаммов вируса вирусной диареи крупного рогатого скота так, что имели 100% сходство между собой и соответствующими участками вирусной РНК вирусной диареи КРС и различия с нуклеотидными последовательностями вирусной РНК классической чумы свиней. Первый праймер использовали для синтеза первой цепи ДНК, комплементарной вирусной РНК ВД КРС, в реакции обратной транскрипции. Второй праймер - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера использовали для амплификации участка генома вируса в полимеразной цепной реакции, проведя 30 циклов при следующем режиме: денатурация при 95^oC в течение 1 мин, гибридизация - при 60^oC в течение 1 мин и синтез - при 73^oC в течение 2 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК, мигрирующего в 1% геле агарозы.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства штаммов вируса ВД КРС и имеющие наибольшие отличия от последовательностей РНК вируса КЧС.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример. Операция 1. Выделение РНК вируса ВД КРС из патологического материала. Образец патологического материала (300-500 мг) растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мг) и добавляют 1000 мкл 4 М гуанидинтиоционата, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем 600 мкл лизата переносят в пробирку объемом 1,5 мл и добавляют 60 мкл 3 М ацетата натрия рН 5,0 и 300 мкл смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:25:0,5). Содержимое перемешивают и выдерживают на льду или при -15^oC в течение 15-20 мин. Затем образец центрифугируют на центрифуге T23D в угловом роторе при 8500 об/мин в течение 20 мин. Водную фазу собирают и к полученному объему добавляют равный объем охлажденного изопропанола, перемешивают и ставят на 30 мин при -45^oC или на 2 ч при -20^oC. Затем пробу центрифугируют 10 мин при 13000 об/мин на центрифуге. Осадок растворяют в 300 мкл 4 М гуанидинтиоционата и, добавив 30 мкл 3 М натрия ацетата pH 5,0 и 750 мкл этилового спирта, выдерживают в течение 2-3 ч при -20^oC или 30-40 мин при -45^oC. После этого образец центрифугируют на центрифуге MPW 310 при 14000 об/мин в течение 15 мин. Осадок промывают холодным этиловым спиртом и, высушив при 37^o, растворяют в 15-20 мкл бидистиллированной воды.

Операция 2. Выделение РНК вируса ВД КРС из культуры клеток MDBK, зараженных вакцинным штаммом вируса ВК-1. 400 мл суспензии клеток центрифугируют на центрифуге T23D в бакет-роторе при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку клеток добавляют 1,5-2 мл 4 М гуанидинтиоционата и проводят последующие операции, как описано выше в операции 1.

Операция 3. Выделение вирусной РНК из сухой живой культуральной вакцины ЛК-ВНИИВВиМ против КЧС. Во флакон с содержанием 500 прививочных доз добавляют 1500 мкл 4 М гуанидинтиоционата, выдерживают 10-15 мин при комнатной температуре и проводят последующие операции, как описано выше в операции 1.

Операция 5. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК ВД КРС. Выделенную вирусную РНК добавляют к 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 8,3; 10 мМ MgC1₂; 140 mM KCl; 20 mM b-меркаптоэтанола; 100 мкг/мл праймера N 1; 1 мМ dATF, dTTF, dCTF, dGTF, 1 мкл обратной транскриптазы (37 ед./мкл). Реакцию проводят в течение 1 ч и 30 мин при +37^oC. После этого содержимое пробирки прогревают в течение 3 мин при 95^oC.

Операция 6. Синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК КЧС. Обратную транскрипцию проводят, как описано в операции 5.

Операция 7. Полимеразная цепная реакция. 5 мкл раствора, содержащего кДНК вируса ВД КРС, добавляют к 45 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, pH 8,8; 1,5 мM MgCl₂, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2 единицы Taq-полимеразы и по 200 нг праймеров N 1 и N 2. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 30 циклов: 95^oC в течение 1 мин, 60^oC в течение 1 мин, 73^oC в течение 2 мин. В конце реакции проводят завершающий синтез при 73^oC в течение 4 мин.

После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования в центрифуге MPW 310 при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДНК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды.

Операция 8. Полимеразную цепную реакцию с кДНК вируса КЧС проводят в тех же условиях, что и с кДНК вируса ВД КРС (операция N 7).

Операция 9. Определение размера продуктов ПЦР. 15 мкл раствора продукта полимеразной цепной реакции смешивают с 5 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин, бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 1%-го агарозного геля. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pDR322 рестрикционной эндонуклеазой Alul. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 997 нуклеотидные пары.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют кДНК вируса вирусной диареи КРС. Анализы были отрицательными, когда использовали кДНК вируса классической чумы свиней. Чувствительность предлагаемого способа выявления вируса КЧС достаточно высока и составляет 0.1 пг вирусной РНК, что соответствует 10000 вирусных частиц. Результаты испытаний различных пар праймеров в ПЦР приведены в таблице 1.

Способ предназначен для выявления вирусной диареи крупного рогатого скота. Способ включает синтез олигонуклеотидных праймеров 5'-ТАG АТТ ССА GАC СGА ССС-3' и 5'-GGА АGG GАТ АСА АCG GGC-3', синтез комплементарной ДНК на матрице ДНК. Затем осуществляют амплификацию синтезированной ДНК методом полимеразной цепной реакции и анализируют размер продуктов полимеразной цепной реакции. Предложенный способ обладает высокой специфичностью и позволяет дифференцировать вирус вирусной диареи крупного рогатого скота от близкородственного вируса классической чумы свиней. 1 табл.

Способ выявления вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице вирусной РНК в реакции обратной транскрипции и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием олигонуклеотидных праймеров, анализ размера продуктов полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что синтезированные праймеры имеют нуклеотидные последовательности: 5'-TAG ATT CCA GAC CGA CCC-3' и 5'-GGA AGG GAT ACA ACG GGC-3'.