СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ FUSOBACTERIUM NECROPHORUM В ГНЕЗДОВОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2003 года по МПК C12P19/30 C12Q1/68 C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной микробиологии и биопромышленности для выявления заболевания сельскохозяйственных животных. До настоящего времени основным способом диагностики некробактериоза крупного и мелкого рогатого скота является бактериологическое исследование (микроскопия мазка, посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных) [Методические указания по лабораторной диагностике некробактериоза. - М., 1987].

Этот метод диагностики имеет свои минусы. Так, из очагов поражения, наряду с Fusobacterium necrophorum, обладающих вирулентностью, выделяют атипичные формы Fusobacterium pseudonecrophorum, которые никогда не вызывают заболевание, а по морфологическим и биохимическим признакам очень схожи, а также сопутствующую микрофлору, такую как стафилококки, стрептококки, микрококки, картофельная, кишечная палочки и другие микроорганизмы, поэтому выделить чистую культуру достаточно сложно. Лабораторные животные (кролики, белые мыши), наряду с возбудителем некробактериоза, также чувствительны и к сопутствующей микрофлоре. В целом на установление диагноза затрачивается 12-16 суток, а в случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой срок диагностики увеличивается на 6-10 дней и при этом снижается достоверность диагноза. Наиболее близким решением, принятым за прототип, является способ выявления Fusobacterium necrophorum, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение хромосомной ДНК из инфицированных тканей, амплифицирование с помощью Taq-полимеразы ДНК в присутствии двух специфичных для F. necrophorum праймеров, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле (Electrophoretic mobility anomalies associated with PCR amplification of the intergenic spacer region between 16S and 23S ribosomal RNA genes of Fusobacterium necrophorum. SK.Narayanan, TG.Nagaraja, MM.Chengappa, GC.Stewart//J.Microbiol.Methods.-2001 (aug).-v.46.-.N2.-p.l65-169; Unexpected Cross-Reaction with Fusobacterium necrophorum in a PCR for Detection of Mycoplasmas: J.S.Jenson, B. Bruun, B. Gahrn-Hansen//J.Clin.Micob.-1999 (Маrt).-V.37.- 3.-Р.828-829).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет обнаруживать значительную часть вирулентных штаммов возбудителя Fusobacterium necrophorum, циркулирующих среди животных, так как используется только одна пара праймеров. Технической задачей нашего изобретения является повышение специфичности, чувствительности и возможности дифференцировать от F. pseudonecrophorum и другой грамотрицательной микрофлоры, присутствующей в очагах поражения. Сущность изобретения заключается в том, что на первом этапе выбираются и синтезируются олигонуклеотидные праймеры, комплементарные области наибольшего сходства геномов различных штаммов F. necrophorum, обладающих вирулентностью и имеющих отличия от нуклеотидных последовательностей ДНК других сопутствующих микроорганизмов. Затем проводится амплификация хромосомной ДНК методом полимеразной цепной реакции с использованием вышеупомянутых праймеров. Для повышения чувствительности синтезируются внутренние (вложенные, гнездовые) праймеры и с ними и продуктом первой амплификации проводится вторая полимеразная цепная реакция.

Способ осуществляется следующим образом.

Выбираются и синтезируются две олигонуклеотидные пары праймеров, например: наружные 1 5'- AGT ATC TGA ТТГ ТСТ ACG СС-3' и 2- 5' CAG ААТ СТА АТA TTG ТАС АС-3' и внутренние 01 5'- CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3' и 02 5'- АТТ ТСА AGA GTC CTT CCG-3.

Праймеры выбираются в области хромосомной ДНК, характерной для вирулентных штаммов F. necrophorum и отсутствующей в F. pseudonecrophorum и сопутствующей микрофлоре, такой как стафилококки, стрептококки, микрококки, картофельная, кишечная палочки. Праймер 1 используют для синтеза первой цепи комплементарной хромосомной ДНК F. necrophorum, праймер 2 - для синтеза второй цепи кДНК с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации выбранного участка хромосомной ДНК в полимеразной цепной реакции. Далее для повышения чувствительности проводят реамплификацию, где праймер 01 используют для синтеза первой цепи комплементарной ДНК фрагмента синтезированного с помощью праймеров 1 и 2, а праймер 02 - для синтеза второй цепи внутреннего фрагмента с помощью фермента Tag-полимеразы. Затем оба праймера используют для амплификации внутреннего фрагмента.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства вирулентных штаммов F. necrophorum и отличающиеся от последовательностей F. pseudonecrophorum, кишечной, сенной палочек, стафило-, стрептококков, протея и другой сопутствующей микрофлоры. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна". Новые признаки технического решения по совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения: выявляется большее число штаммов F. necrophorum и осуществляется их дифференциация. Следовательно, можно считать заявляемое техническое решение соответствующим критерию "изобретательный уровень".

Технической задачей изобретения является повышение специфичности и возможность дифференцировать F. necrophorom от F. pseudonecrophorum и других микроорганизмов без снижения чувствительности способа выявления.

Поставленная цель достигается выбором и синтезом двух паролигонуклеотидных праймеров: наружных 1 5'- AGT ATC TGA TTTTCT ACG СС-3' и 2 5'- CAG AAT СТА АТА TTG ТАС АС-3', синтезирующих фрагмент в 546 нп. и внутренних 01 5'- САТ GTA GAT GTC ATT GCG-3' и 02 5'- ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3', синтезирующих фрагмент внутри первого в 187 нп. Праймеры были выбраны в общей области для геномов вирулентных штаммов F. necrophorum, но отличающейся с нуклеотидными последовательностями хромосомной ДНК F. pseudonecrophorum и сопутствующей микрофлоры. Первую пару праймеров использовали для синтеза и амплификации большего участка генома бактерии в полимеразной цепной реакции, проведя 29 циклов при следующем режиме: денатурация при 95^oС в течение 0,8 мин, гибридизация при 56^oС в течение 0,8 мин и синтез при 73^oС в течение 1 мин и один цикл (досинтез) при 73^oС в течение 4 мин. Вторую пару для синтеза меньшего фрагмента, структурно входящего в больший, и его амплификацию в полимеразной цепной реакции в режиме: денатурация при 95^oС в течение 0,8 мин, гибридизацию - при 48^oС в течение 0,8 мин, синтеза - при 73^oС в течение 1 мин, всего 29 циклов плюс 1 цикл досинтеза при 73^oС в течение 4 мин. О положительном результате анализа судили по размеру синтезированного фрагмента кДНК, мигрирующего в 0,8% геле агарозы.

Существенным отличием заявляемого способа от известного прототипа является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности, одинаковые для большинства вирулентных штаммов F. necrophorum и имеющих наибольшие отличия от последовательностей ДНК F. pseudonecrophorum и других микроорганизмов.

Сущность технического решения раскрыта в примерах конкретного осуществления способа.

Пример. Операция 1. Выделение возбудителя из патологического материала. Образец патологического материала 500-600 мкг растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мкг) и добавляют 1000 мкл 0,9% NaCl, перемешивают и центрифугируют 8000 об/мин 8 мин на центрифуге T23D в угловом роторе. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 500 мкл ТЕ-буфера и переносят в другую пробирку объемом на 2 мл.

Операция 2. Выделение возбудителя из патологического материала. Делают суспензию 1: 10 образца патологического материала с МПБ или 0,9% NaCl, осуществляют посев в МПБ с добавлением 10% аминокровина, культивируют в термостате при 37^oС в течение 1 суток. 10 мл суточной культуры центрифугируют на центрифуге T23D в угловом роторе при 8000 об/мин в течение 8 минут. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 500 мкл ТЕ-буфера и переносят в другую пробирку объемом на 2 мл.

Операция 3. В пробирку после операции 1 или 2 добавляют 150 мкл лизоцима (20 мг/мл), перемешивают и помещают на лед на 25 мин. Затем добавляют 65 мкл 10% SDS и 100 мкл проназы (20 мг/мл), перемешивают и выдерживают при +55^oС 15-18 часов. Далее прибавляют равный объем смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25: 25:0,5), плавно пипетируют и центрифугируют 10 минут при 14 тыс. об/мин. Водную фазу переносят в другую пробирку и приливают к ней 1/2 объема смеси хлороформ: изоамиловый спирт (25:0,5), центрифугируют и водную фазу переносят в другую пробирку. К водной фазе прибавляют 1/10 объема 3 М ацетата натрия рН 4,8 и 2 объема этанола и помещают на 23 часа на 20^oС. Центрифугируют 15 мин при 14 тыс. об/мин на центрифуге MPW 310, осадок промывают 70% этанолом, высушивают при наклонном положении пробирки при +56^oС в течение 30-35 мин, растворяют в 20-30 мкл стерильной бидистиллированной воды или ТЕ-буфере рН 8,0.

Операция 4. Полимеразная цепная реакция. 1 мкл раствора, содержащего хромосомную ДНК F. necrophorum, добавляют к 24 мкл раствора, содержащего 67 мМ трис-HCl, рН 8,8; 15 мМ (NH)SO, 3 мМ MgCL, 0,01% TWeen-20; 0,2 мМ каждого из четырех дезокситрифосфатов, 2 единицы Taq-полимеразы и по 200 нг праймеров 1 и 2. Поверх реакционной смеси наслаивают 30 мкл вазелинового масла. ПЦР состоит из 29 циклов: 95^oС в течение 0,8 мин, 56^oС в течение 0,8 мин, 73^oС в течение 1 мин и завершающего синтеза при 73^oС в течение 4 мин.

Операция 5. Определение размера продуктов ПЦР. 12,5 мкл раствора продуктов полимеразной цепной реакции смешивают с 3 мкл раствора, содержащего 50%-ный глицерин и бромфеноловый синий, и наносят в "карман" 0,8%-ного агарозного геля. Маркер молекулярной массы состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC18 рестрикционной эндонуклеазой Alul. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 546 нуклеотидных пар. В случае отсутствия расчетного фрагмента проводится операция 6.

Операция 6. При отсутствии расчетного фрагмента в 546 нп. забираем 1-2 мкл реакционной смеси и проводим реамплификацию со второй парой праймеров 01- 02. Состав реакционной смеси и режим амплификации описан в пункте 3, необходимо только снизить температуру гибридизации праймера с матрицей с 56 до 48^oС. Анализ считают положительным, если продукт ПЦР соответствует ожидаемому размеру фрагмента в 187 нуклеотидные пары.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получают только тогда, когда в качестве матрицы используют ДНК возбудителя некробактериоза. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК F. pseudonecrophorum и других бактерий (стафилококк, стрептококк, кишечная, сенная палочки, протей). Чувствительность предлагаемого способа выявления хромосомной ДНК F. necrophorum достаточно высока и составляет 1 пг (см. таблицу).

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии животных, и может быть использовано в ветеринарной микробиологии для выявления возбудителя некробактериоза жвачных животных Fusobacterium necrophorum и дифференциации его от атипичных форм Fusobacterium pseudonecrophorum и другой микрофлоры. Способ включает синтез наружных 1 5'- AGT ATC TGA TTT ТСТ ACG СС-3', 2 5' - CAG ААТ СТА АТА TTG ТАС АС-3' и внутренних 01 5' - CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3', 02 5' - ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3' олигонуклеотидных праймеров, синтез комплиментарной ДНК на матрице хромосомной ДНК, затем синтез наружного и затем внутреннего фрагментов. Амплификацию синтезированной ДНК осуществляют методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализируют размер продуктов полимеразной цепной реакции. Предложенный способ обладает высокими специфичностью и чувствительностью и позволяет дифференцировать Fusobacterium necrophorum, выделенную из очагов поражения, от атипичных форм и сопутствующей микрофлоры. 1 табл.

Способ выявления Fusobacterium necrophorum в гнездовой полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, синтез комплементарной ДНК на матрице хромосомной ДНК и амплификацию синтезированной комплементарной ДНК методом ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров с последующим анализом размера продуктов ПЦР, отличающийся тем, что синтезируют две пары олигонуклеотидных праймеров - наружные 1 и 2 для синтеза фрагмента ДНК в 546 нуклеотидные пары и внутренние (гнездовые) 01 и 02 для синтеза фрагмента в 187 нуклеотидные пары, имеющие следующие нуклеотидные последовательности:
1 5'-AGT АТС TGA TTT ТСТ ACG СС-3';
2 5' -CAG ААТ СТА АТА TTG ТАС АС-3';
01 5'-CAT GTA GAT GTC ATT GCG-3';
02 5'-ATT TCA AGA GTC CTT CCG-3';
и выявляют Fusobacterium necrophorum, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 546 или 187 нуклеотидные пары.