МИКРОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2007 года по МПК A61K9/107 A61K48/00 

Техническая область

Настоящее изобретение в общем относится к фармацевтическим композициям. В частности, изобретение относится к полимерным микрочастицам или субмикронным эмульсиям, обладающим адсорбционными поверхностями, на которых адсорбируются биологически активные средства, в частности нуклеиновые кислоты, такие, как плазмидная ДНК, системы инициации эукариотического многоуровневого вектора (Eukaryotic Layered Vector Initiation Systems; векторы ELVIS) или конструкции РНК-векторов, к способам получения таких микрочастиц и субмикронных эмульсий и к способам их применения, включая индукцию иммунного ответа, вакцины и доставку гетерологичных нуклеотидных последовательностей в эукариотические клетки и животным.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Носители на основе частиц использовали для достижения контролируемой парентеральной доставки лекарственных соединений. Такие носители сконструированы для поддержания активного средства в системе доставки в течение длительного периода времени. Примеры носителей на основе частиц включают в себя те, что происходят из полимеров полиметилметакрилата, а также микрочастицы, происходящие из поли(лактидов) (см., например, патент США № 3773919), поли(лактидкогликолидов), известных как PLG (см., например, патент США № 4767628), и полиэтиленгликоля, известного как PEG (см., например, патент США № 5648095).

Полимеры полиметилметакрилата не подлежат деградации, тогда как частицы PLG деградируют в биологических условиях за счет случайного неферментативного гидролиза сложноэфирных связей до молочной и гликолевой кислот, которые экскретируются по обычным метаболическим путям.

Например, в патенте США № 5648095 описано применение микросфер с инкапсулированными фармацевтическими средствами в качестве систем доставки лекарственных средств для назальной, пероральной и пульмональной доставки.

Также описаны препараты замедленного высвобождения, содержащие различные полипептидные факторы роста. См, например, International Publication № WO 94/12158, патент США 5134122 и International Publication № WO 96/37216.

Fattal et al., Journal of Controlled Release 53: 137-143 (1998), описывают наночастицы, полученные из полиалкилцианоакрилатов (PACA), содержащих адсорбированные олигонуклеотиды.

Носители на основе частиц, таких как микрочастицы, также использовали с адсорбированными или захваченными антигенами, пытаясь вызывать адекватный иммунный ответ. Такие носители представляют иммунной системе множественные копии выбранного антигена и способствуют захвату и удержанию антигенов в региональных лимфатических узлах. Данные частицы могут фагоцитироваться макрофагами и могут усиливать презентацию антигена за счет высвобождения цитокинов. В принадлежащей настоящему заявителю совместно рассматриваемой заявке на выдачу патента № 09/015652, поданной 29 января 1998 г., описано применение микрочастиц с адсорбированным или инкапсулированным антигеном для стимуляции клеточно-опосредованного иммунного ответа, а также способы получения таких микрочастиц.

В совместной заявке на выдачу патента № 09/015652 описан, например, способ образования микрочастиц, включающий в себя объединение полимера с органическим растворителем с последующим добавлением стабилизатора эмульсии, такого как поливиниловый спирт (PVA), после чего органический растворитель упаривают, формируя таким образом микрочастицы. Поверхность микрочастиц содержит полимер и стабилизатор. Затем на данные поверхности могут адсорбироваться макромолекулы, такие как векторы ELVIS, другие нуклеотиды (ДНК или РНК), полипептиды и антигены.

Адъюванты представляют собой соединения, способные усиливать иммунный ответ на антигены. Адъюванты могут усиливать как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Однако при борьбе с некоторыми патогенными микроорганизмами предпочтительно стимулировать клеточный иммунитет, в частности, Th1-клетки. Во многих случаях применяемые в настоящее время адъюванты не индуцируют адекватный ответ Th1-клеток и/или характеризуются вредоносными побочными эффектами.

В настоящее время единственным адъювантом, разрешенным в Соединенных Штатах к использованию у человека, являются соли алюминия (квасцы). Данные адъюванты используются в некоторых вакцинах, включая вакцины против гепатита В, дифтерии, полиомиелита, бешенства и гриппа, но не подлежат использованию в других. Так, сообщалось о том, что квасцы не улучшали эффективность вакцин против коклюша и брюшного тифа и обеспечивали лишь незначительный эффект в вакцинах против аденовирусов. Кроме того, возникали такие проблемы, как индукция гранулем в месте инъекции и вариация препаратов квасцов от партии к партии.

Было показано, что микрочастицы из подлежащих деградации в биологических условиях и биологически совместимых полимеров, известных как поли(лактидкогликолиды) (PLG), являлись эффективными носителями для некоторого количества антигенов. Кроме того, микрочастицы PLG могут контролировать скорость высвобождения захваченных антигенов и, таким образом, обладают потенциалом для применения в вакцинах однократного введения. Более того, показано, что введение полимеров, подлежащих деградации в биологических условиях, с захваченными антигенами индуцирует у некоторых экспериментальных животных мощный иммунный ответ. O'Hagan et al., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998,32,225-246 и Singh et al., Advanced Drug Deliv. Rev., 1998, 34, 285-304, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки.

Показано, что эмульсия, содержащая сквален, сорбитантриолеат (Span85™) и полисорбат 80 (Tween 80™), микрофлуидизированная с образованием микрокапель одинаковых размеров, т.е. MF59, также индуцировала мощный иммунный ответ. Препараты MF59, как показано, индуцируют образование титров антител, в 5 до >100 раз больших, чем полученные с адъювантами на основе солей алюминия. Показано, что MF59 усиливал иммунный ответ на антигены из многих источников, включая, например, вирус простого герпеса (HSV), вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гриппа, вирус гепатита C (HCV), цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита B (HBV), вирус папилломы человека (HPV) и возбудитель малярии. Ott et al., Vaccine Design: The Subunit и Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell и M. J. Newman, Eds., Plenum Press, New York, p. 277-296; Singh et al., Vaccine, 1998,16,1822-1827; Ott et al., Vaccine, 1995,13,1557-1562; O'Hagan et al., Mol. Medicine Today, 1997, February, 69-75; и Taquina et al., J Infect. Dis., 1996,174, 1168-75, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки. Адъювант на основе MF59 усиливает иммуногенность субъединичных антигенов, хотя при этом сохраняется профиль безопасности и переносимости адъювантов на основе квасцов. Van Nest et al., Vaccines 92,1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 57-62 и Valensi et al., J. Immunol., 1994,153,4029-39; описания этих публикаций включены полностью в качестве ссылки. MF59 далее описан в совместно поданной заявке на выдачу патента США № 08/434512, поданной 4 мая 1995 г., переуступленной правопреемнику настоящего изобретения, описание которой включено полностью в качестве ссылки. В исследованиях на животных не было обнаружено, что MF59 является генотоксичным, тератогенным и также он не вызывал сенсибилизации. Оказалось, что механизм действия MF59 зависит от генерирования мощного ответа CD4+ T-клеток, т.е. от ответа Th2-клеток. Однако адъюванты на основе MF59 слабо, если вообще стимулируют, ответы Th1-клеток или ответы цитотоксических T-лимфоцитов (CTL).

Было продемонстрировано, что олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотивы, в смеси с антигеном индуцируют мощный иммунный ответ Th1-клеток. Roman et al., Nat. Med., 1997,3,849-854; Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94,10833-10837 ; Davis et al., J. Immunol., 1998,160,870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997,186,1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997,27, 2340-2344; и Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, описания этих публикаций включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки. Неметилированные CpG-динуклеотиды относительно распространены в бактериальной ДНК, но слабо представлены и метилированы в ДНК позвоночных. Bird, Trends Genet, 1987, 3, 342-347. Известно, что бактериальная ДНК или синтетические олигонуклеотиды, содержащие неметилированные CpG-мотивы также индуцируют иммунный ответ, включая, например, пролиферацию B-клеток, секрецию интерлейкина-6 иммуноглобулина, и устойчивость к апоптозу. Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549; Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; Ballas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996,167,72-78; Yamamoto et al., Jpn. J Cancer Res., 1988,79,866-873; Stacey et al., J. Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; и Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 5898-5906; PCT Publication WO 96/02555 ; PCT Publication WO 98/16247; PCT Publication WO 98/18810; PCT Publication WO 98/40100; PCT Publication WO 98/55495; PCT Publication WO 98/37919; и PCT Publication WO 98/52581, описания этих публикаций включены в данное описание полностью в качестве ссылки.

Также показано, что эмульсии, основанные на катионных липидах, могут использоваться в качестве носителей для генов. См., например, Yi et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 24: 653-654 (1997); Kim et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 25: 344-345 (1998); Kim et al., Proc. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 26; #5438 (1999). Вначале было показано, что катионные субмикронные эмульсии, представляющие собой лишь недавно использованный подход для фармацевтической доставки, обладают несущей активностью в отношении низкомолекулярных лекарственных средств (Elbaz et al. 1993 Int. J. Pharm. 96 R1-R6). Применение заряженной поверхности для стабилизации связывания и защиты олигонуклеотидов в сыворотке было продемонстрировано и для низкомолекулярных олигомеров (Teixera et al (1999) Pharm Res 16 30-36) и для плазмидной ДНК (Yi et al. (2000) Pharm Res 17 314320.) Показано, что эмульсии на основе DOTAP усиливают трансфекцию in vitro и in vivo (Kim et al., supra).

Таким образом, требуется адъювант, стимулирующий ответ Th1-клеток, который может иметь профилактическое и терапевтическое применение. Такой ответ может быть полезным, например, при лечении вирусных инфекций, а также при иммунизации субъектов, восприимчивых к вирусным инфекциям.

В патентах США 5814482 и 6015686 описаны системы инициации эукариотического многоуровневого вектора (Eukaryotic Layered Vector Initiation Systems; векторы ELVIS), в частности, те из них, что происходят и конструируются из геномов альфавирусов (таких, как вирус Sindbis), которые применяют, среди прочих способов использования, для стимуляции иммунного ответа на антиген, для способов ингибирования патогенных агентов и для доставки гетерологичных нуклеотидных последовательностей в эукариотические клетки и в организм животных.

В совместной Международной заявке PCT/US99/17308 и заявке на выдачу патента США 09/715902 описаны способы получения микрочастиц с адсорбированными макромолекулами, такими как фармацевтические средства, полинуклеотид, полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант или их комбинации, и тому подобное.

В совместной заявке на выдачу Международного патента PCT/USOO/03331 описаны способы получения субмикронных эмульсий с адсорбированными макромолекулами, такими как фармацевтическое средства, полинуклеотид, полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант или их комбинации, и тому подобное.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что эффективность различных способов применения нуклеиновых кислот, в частности, векторных конструкций, способных обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и, более конкретно, векторных конструкций, включающих в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, таких как векторы pCMV, векторы, ELVIS, или векторных РНК-конструкций, может быть усилена за счет адсорбции данных векторных конструкций на полимерных микрочастицах или субмикронных эмульсиях с адсорбционными поверхностями, что облегчает введение векторных конструкций и гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты, включенных в векторные конструкции, в клетки животного.

Как раскрыто в описанной выше Международной патентной заявке PCT/US99/17308, был изобретен способ образования микрочастиц с адсорбционными поверхностями, способными адсорбировать очень разнообразные макромолекулы. В одном из осуществлений данные микрочастицы состоят как из полимера, так и из детергента. Микрочастицы согласно изобретению адсорбируют такие макромолекулы более эффективно, чем другие доступные в настоящее время микрочастицы.

В некоторых осуществлениях настоящего изобретения используются микрочастицы, происходящие из такого полимера, как поли-(α-гидроксикислота), полигидроксимасляная кислота, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид, полиалкилцианоакрилат, полицианоакрилат и тому подобных, и они образуются с участием детергентов, таких как катионные, анионные и неионные детергенты, причем данные детергенты могут использоваться в комбинации. Авторами настоящего изобретения обнаружено, что данные микрочастицы способствуют улучшенной адсорбции векторных конструкций (например, векторов ELVIS, векторных РНК-конструкций), а также вирусных антигенов и обеспечивают более высокий иммунный ответ.

Как раскрыто в описанной выше Международной патентной заявке PCT/US00/03331, был изобретен препарат микрочастиц, содержащий масляно-капельные субмикронные эмульсии с ионными поверхностно-активными веществами. Такие композиции легко адсорбируют макромолекулы, такие как ДНК, белок и другие антигенные молекулы. В некоторых осуществлениях настоящего изобретения применяются микрочастицы, происходящие из масляно-капельной эмульсии, предпочтительно включающей в себя метаболизирующееся масло и эмульгирующий агент, которые предпочтительно присутствуют в виде эмульсии масла-в-воде, содержащей капельки масла, по существу все составляющие в диаметре менее 1 микрона, предпочтительно менее 250 нм. Предпочтительно, композиция существует в отсутствие каких-либо полиоксипропилен-полиоксиэтиленовых блок-сополимеров. Масло предпочтительно представляет собой животное масло, ненасыщенный углеводород, терпеноид, например, такой как сквален, или растительное масло. Композиция предпочтительно включает в себя по объему от 0,5 до 20% масла в водной среде. Эмульгирующий агент предпочтительно представляет собой неионный детергент, такой как полиоксиэтиленсорбитановый моно-, ди- или триэфир, или сорбитановый моно-, ди- или триэфир. Предпочтительно, композиция включает в себя по массе примерно от 0,01 до 5% эмульгирующего агента.

Таким образом, в некоторых осуществлениях часть композиции согласно изобретению, относящаяся к частицам, представлена микрочастицей с адсорбционной поверхностью, где микрочастица включает в себя полимер, выбранный из группы, включающей поли-(α-гидроксикислоту), полигидроксимасляную кислоту, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид и полицианоакрилат.

В другом осуществлении часть композиции согласно изобретению, относящаяся к частицам, представлена субмикронной эмульсией, включающей в себя масляно-капельную эмульсию, составленную с ионным детергентом.

В других осуществлениях микрочастица дополнительно включает векторные конструкции, способные обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, например, выбранные из вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции, адсорбированные на поверхности микрочастиц, при этом векторная конструкция включает гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант, или их комбинации и тому подобное.

В других осуществлениях данное изобретение относится к композиции микрочастиц, включающей в себя нуклеиновую кислоту, предпочтительно векторные конструкции, способные обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такие как вектор pCMV, вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция, адсорбированные на микрочастицах согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый наполнитель.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу получения микрочастиц с адсорбированной нуклеиновой кислотой, предпочтительно, с векторными конструкциями, способными обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такими как вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция, причем данный способ включает в себя:

(a) объединение раствора полимера, содержащего полимер, выбранный из группы, состоящий из поли-(α-гидроксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона, полиортоэфира, полиангидрида и полицианоакрилата, где данный полимер присутствует в концентрации, составляющей примерно от 1% до 30%, в органическом растворителе, с анионным, катионным или неионным детергентом, где детергент присутствует в соотношении между детергентом и полимером, равном от 0,001 до 10 (мас./мас.), с образованием смеси детергент/полимер;

(b) диспергирование смеси детергент/полимер;

(c) удаление органического растворителя;

(d) образование микрочастицы;

(f) адсорбцию вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции на поверхности микрочастицы, где вектор ELVIS или векторная РНК-конструкция содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, белок, гормон, фермент, медиатор транскрипции или трансляции, промежуточный продукт метаболического пути, иммуномодулятор, антиген, адъювант, или их комбинации и тому подобное.

Предпочтительно, смесь полимер/детергент эмульгируют в форму эмульсии перед удалением органического растворителя.

В других осуществлениях данное изобретение относится к вышеописанным способам. Более предпочтительно, продуцируют композицию микрочастиц, которая также включает в себя фармацевтически приемлемый наполнитель.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу доставки гетерологичной нуклеотидной последовательности, относящемуся к позвоночным субъекту, который включает в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту любой из описанных выше композиций.

В дополнительных осуществлениях данное изобретение относится к способу индукции у относящегося к позвоночным субъекта клеточного иммунного ответа, включающему в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту терапевтически эффективного количества выбранной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты, адсорбированной на микрочастицах согласно изобретению.

В других осуществлениях данное изобретение относится к способу иммунизации, включающему в себя введение относящемуся к позвоночным субъекту терапевтически эффективного количества любой из описанных выше композиций микрочастиц. Данная композиция может необязательно содержать несвязанные макромолекулы и также может необязательно содержать адъюванты, включая соли алюминия, такие как фосфат алюминия, или олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив.

В некоторых предпочтительных осуществлениях микрочастицы образуют из поли-(α-гидроксикислоты), более предпочтительно из поли-(D,L-лактидкогликолида), и, наиболее предпочтительно, из поли-(D,L-лактидкогликолида).

Каждый из неограничивающих примеров ранее описанных адсорбционных микрочастиц может также необязательно содержать макромолекулы, захваченные внутри них или находящиеся в свободном растворе. Таким образом, данное изобретение относится к разнообразным комбинациям, в которых молекулы нуклеиновой кислоты адсорбированы на микрочастицах, и другие молекулы нуклеиновой кислоты захвачены или адсорбированы. Более того, микрочастицы согласно изобретению могут содержать адсорбированными более одного вида нуклеиновой кислоты, а также другие адсорбированные антигенные макромолекулы. Кроме того, микрочастицы могут содержать захваченными внутри себя различные виды нуклеиновой кислоты и/или другие антигенные макромолекулы.

В других предпочтительных осуществлениях микрочастицы получают в виде субмикронных эмульсий, как описано выше.

Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, включающим в себя иммуностимуляторное количество нуклеиновой кислоты (например, векторную конструкцию, способную обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такую как выбранные вектор ELVIS или векторную РНК-конструкцию, где гетерологичная часть нуклеотидной последовательности вектора ELVIS или векторной РНК-конструкции может кодировать антиген), и иммуностимуляторное количество описанной здесь композиции адъюванта. В некоторых осуществлениях изобретения иммуногенная композиция включает в себя CpG-олигонуклеотид в комбинации с микрочастицами с адсорбированной нуклеиновой кислотой. Адсорбированная макромолекула, как таковая, предпочтительно представляет собой вектор ELVIS или векторную РНК-конструкцию, кодирующие антигенный полипептид.

В некоторых предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит из вируса, такого, например, как вирус гепатита C (HCV), вирус гепатита B (HBV), вирус простого герпеса (HSV), вирус иммунодефицита человека (HIV), цитомегаловирус (CMV), вирус гриппа (грипп) и вирус бешенства. Предпочтительно, антигенный полипептид выбран из группы, состоящей из гликопротеина gD HSV, гликопротеина gp120 HIV, гликопротеина gp140 HIV, p55 gag и полипептидов из регионов pol и tat HIV. В других предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит из бактерии, такой, например, как возбудители холеры, дифтерии, столбняка, стрептококк (например, стрептококк B), возбудитель коклюша, Neisseria meningitidis (например, менингит B), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori и Haemophilus influenza. В других предпочтительных осуществлениях изобретения антигенный полипептид происходит, например, из такого паразита, как малярийный паразит.

Композиции адъюванта могут включать в себя, например, соли алюминия. Альтернативно, композиции адъюванта могут содержать олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив. Композиция адъюванта также может содержать необязательный компонент, который приведет к образованию положительно заряженной эмульсии. Олигонуклеотид предпочтительно включает в себя по меньшей мере одну связь фосфоротиокислоты или связь пептидной нуклеиновой кислоты. В предпочтительном осуществлении изобретения олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-28. В других предпочтительных осуществлениях изобретения олигонуклеотид содержит CpG-мотив, фланкированный двумя остатками пурина непосредственно в 5'-направлении от мотива, и двумя остатками пиримидина непосредственно в 3'-направлении от него. В других предпочтительных осуществлениях изобретения олигонуклеотид включает в себя нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19-28. Наиболее предпочтительной является SEQ ID NO: 28. В некоторых предпочтительных осуществлениях изобретения композиция адъюванта, кроме того, включает в себя отдельное иммуностимулирующее средство, которое предпочтительно выбрано из группы, состоящей из квасцов, компонента бактериальной клеточной стенки и мурамилпептида. Композиция адъюванта, как таковая, может находиться в виде второй микрочастицы. Вторая микрочастица может содержать адсорбированными и/или захваченными разнообразные нуклеиновые кислоты и/или антигенные полипептиды, или другие антигенные макромолекулы. Кроме того, иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать в себя свободную нуклеиновую кислоту в растворе.

Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции у животного-хозяина иммунного ответа, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Животное-хозяин преимущественно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака резус и еще более предпочтительно человека.

Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации животного-хозяина против вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции протективного ответа. Животное-хозяин предпочтительно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака резус, и еще более предпочтительно, человека.

Настоящее изобретение также относится к способам повышения иммунного ответа Th1, или ответа CTL, или лимфопролиферации, или продукции цитокинов в организме животного-хозяина, включающим в себя введение животному описанной здесь иммуногенной композиции в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа Th1, или ответа CTL, или лимфопролиферации, или продукции цитокинов. Животное предпочтительно представляет собой млекопитающее, более предпочтительно, макака-резус, и еще более предпочтительно, человека.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции у животного-хозяина иммунного ответа, согласно которым животному вначале вводят адсобированные на микрочастицах макромолекулы, содержащие гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антиген (например, плазмидную ДНК, такую как вектор pCMV или ELVIS, или векторную РНК-конструкцию), в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Впоследствии животному вводят второй антиген.

Первый антиген и второй антиген в данных осуществлениях могут быть одинаковыми или разными и, предпочтительно, являются одинаковыми. Предпочтительные антигены включают в себя бактериальные и вирусные антигены, такие как антигены ВИЧ (например, gp120, gp140, gp160, p24gag или p55gag), антигены вируса гепатита C, антигены вируса гриппа A, антигены бактерии менингита B и бактериальные антигены стрептококка B. Второй антиген предпочтительно адсорбируют на описанных здесь микрочастицах или вводят совместно с адъювантом, таким как MF59. Указанная макромолекула также может, если требуется, вводиться совместно с адъювантом. В некоторых предпочтительных осуществлениях макромолекулу вводят два или три раза до введения второго антигена, который также может вводиться два или более раз.

Согласно одному конкретному осуществлению, (1) макромолекулу вводят: (a) во время инициального введения, (b) в период времени от 1 до 8 недель после инициального введения и (c) в период времени от 4 до 32 недель после инициального введения, и (2) второй антиген вводят: (a) в период времени от 8 до 50 недель после инициального введения и (b) в период времени от 8 до 100 недель после инициального введения.

Доставка композиций микрочастиц согласно изобретению может выполняться любым из известных способов, включая непосредственную инъекцию (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно), и такая доставка также может усиливаться применением электропорации (см., например, заявку на патент США 09/499023, описание которой включено в данное описание полностью в качестве ссылки). Электропорация представляет собой воздействие на клетки краткосрочными электрическими импульсами для усиления проницаемости клеточных мембран, облегчая, таким образом, захват ДНК клетками. Недавно было обнаружено, что воздействие на ткани in vivo электрическим полем значительно усиливает захват ДНК и генную экспрессию (Mathiesen, I., 1999, Gene Therapy 6: 508). Примерами тканей, подвергавшихся электропорации in vivo, являются кожа, печень, опухоли и мышцы. По применению ДНК-вакцины Widera et al. показали, что электропорация in vivo существенно усиливает действие ДНК-вакцины у мышей, морских свинок и кроликов (Widera, G., et al., 2000, J. Immunol. 164: 4635).

Векторы ELVIS по описанным выше осуществлениям, в общем, представляют собой молекулы ДНК, содержащие промотор, который функционирует в эукариотической клетке, последовательность кДНК, транскрипционным продуктом которой является векторная РНК-конструкция (например, векторный РНК-репликон альфавируса), и 3'-терминаторный регион. Векторные РНК-конструкции предпочтительно включают в себя РНК-геном из пикорнавируса, тогавируса, флавивируса, коронавируса, парамиксовируса, вируса желтой лихорадки или альфавируса (например, вируса Синдбис, вируса Леса Семлики, вируса венесуэльского лошадиного энцефалита или вируса Росс-Ривер) и, более предпочтительно, геном альфавируса, модифицированный путем замены одного или нескольких генов структурных белков на выбранные гетерологичные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие интересующий генный продукт. Векторные РНК-конструкции согласно изобретению получают главным образом путем транскрипции in vitro из ДНК-матрицы.

Эти и другие аспекты и осуществления настоящего изобретения будут хорошо понятны рядовым специалистам в данной области в свете приведенного здесь описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 63), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.2 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 64), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.3 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 65), кодирующая модифицированный оболочечный полипептид HIV-1.

На фиг.4 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 66), кодирующая модифицированный оболочечный полипептид HIV-1.

На фиг.5 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 67), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

На фиг.6 представлена последовательность ДНК (SEQ ID NO: 68), кодирующая модифицированный полипептид p55gag HIV-1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что микрочастицы с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты, предпочтительно векторными конструкциями, способными обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и более предпочтительно векторными конструкциями, включающими в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген, такими как векторы pCMV, векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции, вызывают усиленный иммунный ответ. Кроме того, комбинация микрочастиц с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты (например, микрочастиц с адсорбированными векторами pCMV, векторами ELVIS или векторными РНК-конструкциями) и адъювантов может применяться для индукции усиленного иммунного ответа.

Данное изобретение также основано на неожиданном обнаружении того, что векторные конструкции, содержащие кодирующие антиген последовательности нуклеиновой кислоты, такие как векторы pCMV, векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции, в сочетании с последующем введением антигена, вызывают усиленный иммунный ответ.

В практическом осуществлении настоящего изобретения используются общепринятые методы химии, химии полимеров, биохимии, молекулярной биологии, иммунологии и фармакологии, лежащие в пределах данной области, если не оговорено специально. Такие способы полно освещены в литературе. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick и N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir и C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications) ; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989) ; Handbook of Surface и Colloidal Chemistry (Birdi, KS., ed, CRC Press, 1997) и Seymour/Carraher's Polymer Chemistry (4th edition, Marcel Dekker Inc., 1996).

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки, приведены ли они выше или ниже, включены полностью в качестве ссылки.

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя ссылки на множественное число, кроме случаев, когда контекст ясно указывает иначе. Так, например термин «микрочастица» относится к одной или нескольким микрочастицам, и тому подобное.

A. Определения

При описании настоящего изобретения применяются следующие термины, и они подразумевают указанные ниже определения.

Если не указано иначе, все процентные доли и отношения приведены здесь на основе массы.

Применяемый здесь термин «микрочастица» относится к частице, составляющей примерно от 10 нм до 150 мкм в диаметре, более предпочтительно примерно от 200 нм до 30 мкм в диаметре и, наиболее предпочтительно примерно от 500 нм до 10 мкм в диаметре. Предпочтительно, микрочастицы характеризуются диаметром, позволяющим осуществлять парентеральное введение и введение в слизистые без окклюзии игл и капилляров.

Размер микрочастиц легко определяется способами, хорошо известными в данной области, такими как фотонная корреляционная микроскопия, лазерная дифрактометрия и/или сканирующая электронная микроскопия. Термин «частица» также может использоваться для обозначения определенной выше микрочастицы.

Используемые здесь полимерные микрочастицы формируются из материалов, которые подлежат стерилизации и биодеградации, а также нетоксичны. Такие материалы без ограничения включают в себя поли-(α-гидроксикислоту), полигидроксимасляную кислоту, поликапролактон, полиортоэфир, полиангидрид, PACA и полицианоакрилат. Предпочтительно, микрочастицы для применения согласно изобретению представляют собой полимерные микрочастицы, происходящие из поли-(α-гидроксикислоты), в частности из поли(лактида) («PLA») или сополимера D,L-лактида и гликолида или гликолевой кислоты, такого как поли-(D,L-лактидкогликолид) («PLG» или «PLGA»), или сополимера D,L-лактида и капронолактона. Полимерные микрочастицы могут происходить от любого из разнообразных полимерных исходных материалов, обладающих различными молекулярными массами и, в случае сополимеров, таких как PLG, различными соотношениями лактид:гликолид, причем их селекция может во многом быть предметом выбора, частично зависящим от совместно вводимой макромолекулы. Данные параметры более полно обсуждаются ниже. Альтернативно, микрочастицы согласно изобретению включены в субмикронные эмульсии.

Применяемое здесь выражение «капельно-масляная эмульсия» относится к эмульсии, включающей в себя метаболизирующее масло или эмульгирующий агент. Применяемый здесь термин «субмикронная эмульсия» относится к капельно-масляной эмульсии согласно изобретению, содержащей капли, варьирующие по размеру примерно от 10 нм до 1000 нм.

Применяемый здесь термин «микрочастица» может относиться к описанной здесь полимерной микрочастице или описанной здесь композиции субмикронной эмульсии.

Используемый здесь термин «детергент» включает в себя поверхностно-активные вещества, диспергирующие средства, суспендирующие средства и стабилизаторы эмульсии. Анионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров SDS (додецилсульфат натрия), SLS (лаурилсульфат натрия), DSS (дисульфосукцинат), сульфатированные жирные спирты и тому подобное. Катионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров цетримид (цетилтриметиламмония бромид, или «CTAB»), бензалкония хлорид, DDA (диметилдиоктодециламмония бромид), DOTAP (диолеил-3-триметиламинопропан) и тому подобные. Неионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров PVA, повидон (также известный как поливинилпирролидон или PVP), сорбитановые сложные эфиры, полисорбаты, полиоксиэтилированные моноэфиры гликоля, полиоксиэтилированные алкилфенолы, полоксамеры и тому подобные.

Используемый здесь термин «электрокинетический потенциал» относится к электрическому потенциалу, который существует между поверхностью раздела твердых веществ и жидкостей, т.е. потенциалу между диффузным слоем ионов, окружающим заряженную коллоидную частицу. Электрокинетический потенциал может рассчитываться из электрофоретической подвижности, т.е. из скоростей, с которыми коллоидные частицы перемещаются между заряженными электродами, размещенными в контакте с подлежащим измерению веществом, с использованием хорошо известных в данной области способов.

Применяемый здесь термин «макромолекула» без ограничения относится к фармацевтическому средству, полинуклеотиду, полипептиду, гормону, ферменту, промежуточному продукту метаболического пути, иммуномодулятору, антигену, адъюванту или их комбинациям. Конкретные макромолекулы для применения согласно изобретению более подробно описаны ниже.

Термин «фармацевтическое средство» относится к биологически активным соединениям, таким как антибиотики, противовирусные средства, факторы роста, гормоны и тому подобные, более подробно описанным ниже.

Термин «адъювант» относится к любому веществу, которое способствует или модулирует действие фармацевтического средства, включая в качестве неограничивающих примеров адъюванты, которые усиливают иммунный ответ на антиген или делают его разнообразнее

«Полинуклеотид» представляет собой полимер нуклеиновой кислоты, обычно кодирующий биологически активный (например, иммуногенный или терапевтический) белок или полипептид. В зависимости от природы полипептида, кодируемого полинуклеотидом, полинуклеотид может включать в себя только 10 нуклеотидов, например, в случае, когда полинуклеотид кодирует антиген. Более того, «полинуклеотид» может включать в себя как двух-, так и одноцепочечные последовательности, и относится в качестве неограничивающих примеров к кДНК из вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномным последовательностям РНК и ДНК из вирусной (например, из РНК- и ДНК-вирусов, и ретровирусов) или прокариотической ДНК, и особенно к синтетическим последовательностям ДНК. Данный термин также относится к последовательностям, содержащим любые из известных основных аналогов ДНК и РНК. Данный термин, кроме того, включает в себя модификации нативной последовательности, такие как делеции, добавления и замены (в основном консервативные в природе), предпочтительно такие, что молекула нуклеиновой кислоты кодирует терапевтический или антигенный белок. Данные модификации могут быть намеренными, такими как осуществленные путем сайт-специфического мутагенеза, или могут быть случайными, такими как осуществленными за счет мутаций хозяев, продуцирующих антиген.

Термины «полипептид» и «белок» относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной продукта. Таким образом, пептиды, олигопетиды, димеры, мультимеры и тому подобное включены в данное определение. Данным определением охвачены как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Данные термины также включают в себя модификации, такие как делеции, добавления и замены (в основном консервативные в природе), предпочтительно такие, что белок сохраняет способность вызывать иммунный ответ или терапевтический эффект в отношении субъекта, которому вводят данный белок.

Под «антигеном» понимают молекулу, содержащую один или несколько эпитопов, способных стимулировать иммунную систему хозяина на осуществление специфичного для клеточного антигена иммунного антигена, где антиген представлен согласно изобретению, или гуморального ответа антител. Антиген может быть способным вызывать клеточный или гуморальный ответ сам по себе или когда присутствует в комбинации с другой молекулой. Обычно эпитоп включает в себя примерно 3-15 аминокислот, предпочтительно примерно 5-15 аминокислот, и более предпочтительно примерно 7-15 аминокислот. Эпитопы конкретного белка могут идентифицироваться с использованием любого количества способов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Например, линейные эпитопы могут определяться посредством одновременного твердофазного синтеза большого количества пептидов, причем данные пептиды должны соответствовать частям белковой молекулы, и путем взаимодействия данных пептидов с антителами, при том, что пептиды связаны с подложками. Такие способы хорошо известны в данной области и описаны, например, в патенте США № 4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данную публикацию полностью в качестве ссылки. Сходным образом легко идентифицировать конформационные эпитопы путем определения пространственной конформации аминокислот, как, например, путем рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерно-магнитного резонанса. См., например, Epitope Mapping Protocols.

Используемый здесь термин «антиген» означает как субъединичные антигены, т.е. антигены, которые отделены и обособлены от целого организма, с которым данный антиген ассоциирован в природе, так и убитые, аттенуированные или инактивированные бактерии, вирусы и паразиты, или другие микробы. Антитела, такие как антиидиотипические антитела или их фрагменты, и синтетические пептидные мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту, также подпадают под используемое здесь определение антигена. Сходным образом, олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует in vivo терапевтический или иммуногенный белок, или антигенную детерминанту, как в применениях генной терапии и иммунизации нуклеиновой кислотой, также включены здесь в определение антигена.

Кроме того, для целей настоящего изобретения антигены могут происходить от любых известных вирусов, бактерий, паразитов и грибов, а также из различных опухолевых антигенов. Более того, для целей настоящего изобретения «антиген» относится к белку, который содержит модификации нативной последовательности, такие как делеции, добавления и замены (в основном, консервативные в природе), при условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Данные модификации могут быть намеренными, такими как осуществленные путем сайт-специфического мутагенеза, или могут быть случайными, такими как осуществленными за счет мутаций хозяев, продуцирующих антиген.

«Иммунологический ответ» и «иммунный ответ» на антиген или композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в интересующей композиции. Для целей настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител, в то время как «клеточный иммунный ответ» представляет собой тот, что опосредован T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. Один из важных аспектов клеточного иммунитета включает в себя антигенспецифический ответ цитотоксических T-клеток («CTL»). CTL специфичны в отношении пептидных антигенов, которые презентируются в ассоциации с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (MHC) и эспрессируются на поверхности клетки. CTL способствуют индукции и развитию внутриклеточной деструкции внутриклеточных микробов, или лизису клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает в себя антигенспецифический ответ хелперных T-клеток. Хелперные Т-клетки способствуют стимуляции функционирования неспецифических эффекторных клеток и направлению их активности против клеток, экспрессирующих пептидные антигены в ассоциации с молекулами MHC на их поверхности. «Клеточный иммунный ответ» также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными T-клетками и/или другими лейкоцитами, включая те, что происходят от CD4+ или CD8+ T-клеток.

Композиция, такая как иммуногенная композиция или вакцина, вызывающая клеточный иммунный ответ, может служить для сенсибилизации субъекта, относящегося к позвоночным, путем презентации антигена в ассоциации с молекулами MHC на клеточной поверхности. Клеточно-опосредованный иммунный ответ направлен на клетки, презентирующие антиген на их поверхности, или близко к этому. Кроме того, антигенспецифические T-лимфоциты могут быть образованы для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина.

Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточно-опосредованный иммунный ответ может быть определена несколькими способами анализа, такими как способы анализа лимфопролиферации (активации лимфоцитов), способами анализа цитотоксических клеток CTL, путем определения у сенсибилизированного субъекта T-лимфоцитов, специфичных к данному антигену, или путем измерения продукции цитокинов Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие способы анализа хорошо известны в данной области. См., например, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199 ; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376, и приведенные ниже примеры.

Таким образом, используемый здесь термин «иммунный ответ», может быть одним из ответов, которые стимулируют продукцию CTL, и/или продукцию или активацию хелперных Т-клеток. Интересующий антиген может также вызывать опосредованный антителами иммунный ответ. Следовательно, иммунный ответ может включать в себя один или несколько из следующих эффектов: продукцию антител В-клетками и/или активацию супрессорных Т-клеток и/или γδ-T-клеток, специфичных в отношении антигена или антигенов, присутствующих в интересующей композиции или вакцине. Данные реакции могут способствовать нейтрализации инфекции и/или опосредовать взаимодействие антитела с комплементом или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) для обеспечения защиты иммунизируемого хозяина. Такие реакции могут определяться с использованием стандартных способов иммунологического анализа и способов анализа нейтрализации, хорошо известных в данной области.

Композиция, содержащая выбранный антиген, адсорбированный на микрочастице, проявляет «повышенную иммуногенность», когда она обладает способностью вызывать более мощный иммунный ответ по сравнению с иммунным ответом, который вызывается эквивалентным количеством антигена, когда тот доставляется без ассоциации с микрочастицей. Таким образом, композиция может проявлять «повышенную иммуногенность», поскольку антиген становится более иммуногенным за счет адсорбции на микрочастице или поскольку требуется более низкая доза антигена для достижения иммунного ответа у субъекта, которому она вводится. Такая повышенная иммуногенность может определяться путем введения животным композиции микрочастица/антиген и антигенных контролей и сравнения титров антител в этих двух случаях, с использованием стандартных способов анализа, таких как радиоиммунный анализ и способы ELISA, хорошо известные в данной области.

Используемые здесь термины «эффективное количество» или «фармацевтически эффективное количество» данной композиции относятся нетоксичному количеству композиции, но достаточному для обеспечения требуемого ответа, такого как иммунный ответ, и соответствующего терапевтического эффекта, или, в случае доставки терапевтического белка, к количеству, достаточному для эффективного лечения субъекта, как это определено ниже. Как будет показано ниже, точное требуемое количество варьирует от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и основных условий жизни субъекта, тяжести подлежащего лечению состояния и конкретной интересующей макромолекулы, способа введения и тому подобного. Подходящее «эффективное количество» в любом индивидуальном случае может быть определено путем рутинного экспериментирования рядовым специалистом в данной области.

Под «субъектом, относящимся к позвоночным» подразумевается любой представитель подтипа хордовых, включая, без ограничения, млекопитающих, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы, лошади и люди; домашних животных, таких как собаки и кошки; и птиц, включая домашних, диких и промысловых птиц, таких как обоеполые особи кур, индеек и других курообразных птиц. Данный термин не означает конкретный возраст. Таким образом, подразумевается, что термином охвачены как взрослые, так и новорожденные животные.

Под «фармацевтически приемлемым» или «фармакологически приемлемым» подразумевают материал, который не является неподходящим в биологическом или ином смысле, т.е. данный материал может вводиться субъекту в составе препарата микрочастиц без причинения ему каких-либо нежелательных биологических эффектов или без неблагоприятного взаимодействия с любым другим компонентом композиции, в состав которой он входит.

Термин «наполнитель» относится к веществам, которые обычно предоставляются с законченными дозированными формами, и включает в себя носители, связующие вещества, разрыхлители, наполнители (растворители), смазки, агенты скольжения (вещества для улучшения текучести), уплотняющие средства, красители, подсластители, консерванты, суспендирующие/диспергирующие средства, пленкообразователи/покрытия, вкусовые добавки и печатные краски.

Под «физиологическим pH» или «pH в физиологических пределах» подразумевают pH в приблизительных пределах от 7,2 до 8,0 включительно, обычно в приблизительных пределах от 7,2 до 7,6 включительно.

Применяемый здесь термин «лечение» (включая его вариации, например «лечить» или «подвергавшийся лечению») относится к любому из перечисленного: (i) к профилактике инфекции или повторной инфекции, как в случае традиционной вакцины, (ii) к снижению или элиминации симптомов, (iii) к существенной или полной элиминации рассматриваемого патогенного микроорганизма или нарушения. Лечение может осуществляться пофилактически (до инфекции) или терапевтически (после инфекции).

Применяемое здесь выражение «нуклеиновая кислота» относится к ДНК, РНК или образованным на их основе химерным молекулам.

Применяемое здесь выражение «олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив» относится к полинуклеотиду, включающему в себя по меньшей мере один динуклеотид CpG. Олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один CpG-мотив, могут включать в себя множественные CpG-мотивы. Данные олигонуклеотиды также известны в данной области как «CpG-олигонуклеотиды». Применяемое здесь выражение «CpG-мотив» относится к динуклеотидной части олигонуклеотида, который включает в себя нуклеотид цитозин с последующим нуклеотидом-гуанозином. Вместо цитозина также может быть использован 5-метилцитозин.

Применяемый здесь термин «альфавирусный векторный РНК-репликон», «векторный РНК-репликон», «векторный РНК-репликон» и «репликон» относится к молекуле РНК, способной направлять собственную амплификацию или саморепликацию in vivo внутри клетки-мишени. Векторный РНК-репликон альфавирусного происхождения должен содержать следующие упорядоченные элементы: 5'-концевые вирусные последовательности, требуемые в цис-положении для репликации (также обозначенные как 5'-CSE), которые при экспрессии кодируют биологически активные неструктурные белки альфавируса (например, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), 3'-концевые вирусные последовательности, требуемые в цис-положении для репликации (также обозначенные как 3'-CSE), и полиаденилатный участок. Векторный РНК-репликон альфавирусного происхождения также может содержать вирусный субгеномный промотор «региона сращения», последовательности одного или нескольких генов структурных белков или их части, внешнюю(-ие) молекулу(-ы) нуклеиновой кислоты, достаточного размера для обеспечения продукции жизнеспособного вируса, а также подлежащую(-ие) экспрессии гетерологичную(-ые) последовательность(-и).

Применяемый здесь термин «система инициации эукариотического многоуровневого вектора», «ELVIS» или «вектор ELVIS» относится к конструкции, которая способна направлять экспрессию последовательности(-ей) интересующего гена(-ов). Система инициации эукариотического многоуровневого вектора должна содержать 5'-концевой промотор, способный инициировать in vivo (т.е. внутри клетки) синтез РНК с кДНК, и вирусную векторную последовательность, способную направлять свою собственную репликацию в эукариотической клетке и также экспрессировать гетерологичную последовательность. В предпочтительных осуществлениях векторная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность альфавирусного происхождения и состоит из 5'-концевой последовательности, способной инициировать транскрипцию альфавирусной РНК (также обозначаемой как 5'-CSE), а также последовательностей, которые при экспрессии кодируют биологически активные неструктурные альфавирусные белки (например, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), и последовательности распознавания альфавирусной РНК-полимеразы (также обозначаемой как 3'-CSE). Кроме того, векторная последовательность может включать в себя вирусный субгеномный промотор «региона сращения», последовательности одного или нескольких генов структурных белков или их части, внешнюю(-ие) молекулу(-ы) нуклеиновой кислоты, достаточного размера для обеспечения продукции жизнеспособного вируса, подлежащую(-ие) экспрессии гетерологичную(-ые) последовательность(-и), один или несколько рестрикционных сайтов для вставки гетерологичных последовательностей, а также последовательность полиаденилирования. Система инициации эукариотического многоуровневого вектора также может содержать последовательности распознавания сплайсинга, последовательность участвующего в процессинге каталитического рибозима, сигнал экспорта из ядра и последовательность терминации транскрипции.

«Альфавирусная векторная конструкция» относится к конструкции, способной направлять экспрессию интересующей последовательности или гена. Такие векторные конструкции главным образом включают в себя 5'-концевую последовательность, способную инициировать транскрипцию альфавирусной РНК (также обозначаемую как 5'-CSE), а также последовательности, которые при экспрессии кодируют биологически активные неструктурные альфавирусные белки (например, nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), последовательность распознавания альфавирусной РНК-полимеразы (также обозначаемую как 3'-CSE) и участок полиаденилата. В дополнение, векторная последовательность может содержать вирусный субгеномный промотор «региона сращения», последовательности одного или нескольких генов структурных белков или их части, внешнюю(-ие) молекулу(-ы) нуклеиновой кислоты, достаточного размера для обеспечения продукции жизнеспособного вируса, 5'-концевой промотор, способный инициировать синтез вирусной ДНК с кДНК in vitro или in vivo, подлежащую экспрессии гетерологичную последовательность, один или несколько рестрикционных сайтов для вставки гетерологичных последовательностей.

Применяемое здесь выражение «векторная конструкция» относится главным образом к любой конструкции, способной направлять экспрессию интересующей(-их) последовательности(-ей) нуклеиновой кислоты или интересующего(-их) гена(-ов). Векторная конструкция обычно включает в себя транскрипционный промотор/энхансер или элемент(-ы), определяющий(-ие) локус, или другие элементы, контролирующие генную экспрессию другими способами, такими как альтернативный сплайсинг, экспорт РНК из ядра, посттрансляционная модификация несущей информацию РНК или посттрансляционная модификация белка. Кроме того, векторная конструкция обычно включает в себя последовательность, которая при транскрипции оказывается функционально связанной с интересующей(-ими) последовательностью(-ями) или интересующим(-ими) геном(-ами), и функционирует как последовательность инициации транскрипции. Векторная конструкция также может необязательно включать в себя сигнал, который направляет полиаденилирование, маркер для селекции, а также один или несколько рестрикционных сайтов для вставки гетерологичных последовательностей и последовательность терминации трансляции. Кроме того, если векторная конструкция помещена в ретровирус, данная векторная конструкция может включать в себя сигнал упаковки, длинные терминальные повторы (LTR) и сайты связывания праймера плюс- и минус-нитей, соответствующие применяемому ретровирусу (если они не присутствуют изначально). Примеры векторных конструкций включают в себя векторы ELVIS, которые содержат кДНК, комплементарную векторным РНК-конструкциям, веторные РНК-конструкции как таковые, альфавирусные векторные конструкции, векторные конструкции CMV и тому подобное.

Одним из конкретных типов векторных конструкций является «плазмида», которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут лигироваться дополнительные сегменты ДНК. Конкретные плазмиды, описанные ниже, включают в себя pCMV и pSINCP.

По некоторым осуществлениям настоящего изобретения предоставляются композиции и способы, которые осуществляют лечение, включающее в себя профилактическую и/или терапевтическую иммунизацию животного-хозяина против вирусных, грибковых, микоплазменных, бактериальных и вызываемых простейшими инфекций, а также против опухолей. Способы согласно изобретению могут использоваться для индукции у млекопитающего, предпочтительно у человека, профилактического и/или терапевтического иммунитета. Способы согласно изобретению могут также быть реализованы на млекопитающих, отличных от человека, включая млекопитающих, применяемых в биомедицинских исследованиях.

B. Основные способы

1. Полимерные микрочастицы с адсорбированными макромолекулами

Полимерные микрочастицы, включая микрочастицы на основе PLA и PLG, эффективно адсорбируют биологически активные макромолекулы. Более того, данные микрочастицы адсорбируют очень разнообразные молекулы, включая заряженные и/или объемные макромолекулы. Так, макромолекула/микрочастицы, применяемые согласно изобретению, могут использоваться в качестве системы доставки для доставки биологически активных компонентов с целью лечения, профилактики и/или диагностики широкого спектра заболеваний.

В ассоциации с микрочастицами может доставляться широкий спектр макромолекул, включая в качестве неограничивающих примеров фармацевтические средства, такие как антибиотики и противовирусные средства, нестроидные противовоспалительные лекарственные средства, анальгетики, вазодилататоры, сердечно-сосудистые лекарственные средства, психотропные средства, нейролептики, антидепрессанты, лекарственные средства против паркинсонизма, бета-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы брадикинина, ингибиторы АПФ, вазодилататоры, ингибиторы пролактина, стероиды, антагонисты гормонов, антигистаминные средства, антагонисты серотонина, гепарин, средства химиотерапии, противоопухолевые средства, и факторы роста, включая в качестве неограничивающих примеров, PDGF, EGF, KGF, IGF-1 и IGF-2, FGF, полинуклеотиды, кодирующие терапевтические или иммуногенные белки, иммуногенные белки и их эпитопы для применения в вакцинах, гормоны, включая пептидные гормоны, такие как инсулин, проинсулин, гормон роста, GHRH, LHRH, EGF, соматостатин, SNX-111, BNP, инсулинотропин, ANP, FSH, LH, PSH и hCG, стероидные гормоны гонад (андрогены, эстрогены и прогестерон), тиреоидстимулирующий гормон, ингибин, холецистокинин, ACTH, CRF, динорфины, эндорфины, эндотелин, фрагменты фибронектина, галанин, гастрин, инсулинотропин, глюкагон, фрагменты ГТФ-связывающих белков, гуанилин, лейкокинины, магаинины, мастопараны, дермасептин, системин, нейромедины, нейротензин, панкреастатин, панкреатический полипептид, субстанция P, секретин, тимозин, и тому подобные, ферменты, медиаторы транскрипции и трансляции, промежуточные продукты метаболических путей, иммуномодуляторы, такие как любой из различных цитокинов, включая интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4 и гамма-интерферон, антигены и адъюванты.

В некоторых предпочтительных осуществлениях изобретения макромолекула представляет собой нуклеиновую кислоту, более предпочтительно векторную конструкцию, такую как вектор ELVIS, или векторную РНК-конструкцию. Одним из особых преимуществ настоящего изобретения является способность микрочастиц с адсорбированным вектором ELVIS генерировать клеточно-опосредованный иммунный ответ у субъекта, относящегося к позвоночным.

Кроме того, в дополнение к обычному ответу антител, описанные здесь системы могут, например, обеспечивать ассоциацию экспрессированных антигенов с молекулами MHC I класса, так что может развиваться клеточный иммунный ответ на интересующий антиген in vivo, стимулирующий продукцию CTL, что впоследствии позволяет распознавать антиген. Более того, данными способами можно вызывать антигенспецифичный ответ хелперных T-клеток. Таким образом, способы согласно изобретению найдут применение любой макромолекуле, на которую требуется индуцировать клеточный и/или гуморальный иммунный ответ, предпочтительно, антигенам, происходящим из патогенных вирусов, способному индуцировать выработку антител, Т-клеточным хелперным эпитопам и Т-клеточным цитотоксическим эпитопам. Такие антигены включают в себя в качестве неограничивающих примеров антигены, кодируемые вирусами человека и животных, и могут соответствовать как структурным, так и неструктурным белкам.

Микрочастицы согласно изобретению, в частности, могут использоваться для иммунизации против внутриклеточных вирусов, которые обычно вызывают слабый иммунный ответ. Например, настоящее изобретение найдет применение при стимуляции иммунного ответа против широкого спектра белков семейства герпесвирусов, включая белки, происходящие из вируса простого герпеса (HSV) 1 и 2 типов, такие как гликопотеины gB, gD и gH из HSV-1 и HSV-2, антигены, происходящие из вируса ветряной оспы (VZV), вируса Эпштейна-Барр (EBV) и цитомегаловируса (CMV), включая gB и gH из CMV; и антигены, происходящие из других герпесвирусов человека, таких как HHV6 и HHV7. (См., например Chee et al., Cytomegaloviruses (J. K McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp. 125-169, для обзора кодирующего белки содержимого цитомегаловируса; McGeoch et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 1531-1574, для обсуждения различных белков, кодируемых HSV-1; патент США № 5171568 для обзора белков gB и gD из HSV-1 и HSV-2 и кодирующих их генов; Baer et al., Nature (1984) 310: 207-211, для идентификации кодирующих белков последовательностей в геноме EBV; и Davison и Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67: 1759-1816, для обзора VZV.)

Антигены из семейства вирусов гепатита, включая вирус гепатита A (HAV), вирус гепатита B (HBV), вирус гепатита C (HCV), вирус гепатита дельта (HDV), вирус гепатита E (HEV) и вирус гепатита G (HGV), также могут обычным образом применяться по описанным здесь способам. Для примера, известна последовательность генома HCV, как и способы получения данной последовательности. См., например, International Publication №№ WO 89/04669 ; WO 90/11089; и WO 90/14436. Геном HCV кодирует несколько вирусных белков, включая E1 (также известный как E) и E2 (также известный как E2/NSI) и N-концевой белок нуклеокапсида (называемый «кор») (см., Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381-388, для обсуждения белков HCV, включая E1 и E2). Каждый из данных белков, а также их антигенные фрагменты найдут применение в настоящей композиции и способах.

Сходным образом, известна последовательность δ-антигена из HDV (см., например, патент США № 5378814), и данный антиген может обычно использоваться в настоящих композициях и способах. Кроме того, здесь найдут применение антигены, происходящие из HBV, такие как коровый антиген, поверхностный антиген SAg, а также приповерхностные последовательности pre-S1 и pre-S2 (ранее называемая pre-S), а также комбинации вышеуказанных последовательностей, такие как SAg/pre-S1, SAg/pre-S2, SAg/pre-S1/pre-S2, и pre-S1/pre-S2. См., например,"HBV Vaccines-from the laboratory to license: a case study", Mackett, M. и Williamson, J. D., Human Vaccines и Vaccination, pp. 159-176, для обсуждения структуры HBV; и патенты США № 4722840, 5098704, 5324513, включенные в описание полностью в качестве ссылки; Beames et al., J. Virol. (1995) 69: 6833-6838, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64: 3319-3330; и Zhou et al., J. Virol. (1991) 65: 5457-5464.

В заявленных композициях и способах также найдут применение антигены, происходящие из других вирусов, такие как приведенные без ограничения белки из представителей семейств Picornaviridae (например, вирусы полиомиелита, и т.д.); Caliciviridae; Togaviridae (например, вирус краснухи, вирус тропической лихорадки, и т.д.); Flaviviridae ; Coronaviridae ; Reoviridae ; Birnaviridae ; Rhabdoviridae (например, вирус бешенства, и т.д.); Filoviridae ; Paramyxoviridae (например, вирус свинки, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус, и т.д.); Orthomyxoviridae (например, вирус гриппа типов A, B и C, и т.д.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviradae (например, HTLV-I; HTLV-II ; HIV-1 (также известный как HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, и т.д..)), среди прочих включая в качестве неограниченных примеров антигены из изолятов HIV_IIIb, HIV_SF2, HIV_LAV, HIV_LAI, HIV_MN; HIV-1_CM235, HIV-1_US4; HIV-2; вирус иммунодефицита обезьян (SIV). В дополнение, антигены также могут происходить из папилломавируса человека (HPV) и вирусов клещевого энцефалита. См., например, Virology, 3rd Edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields и D. M. Knipe, eds. 1991), для описания данных и других вирусов.

Более конкретно, известны и описаны оболочечные белки gp120 или gp140 любых из указанных изолятов HIV, включая представителей различных генетических субтипов HIV (см., например, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers et al., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory; и Modrow et al., J. Virol. (1987) 61: 570-578, для сравнения оболочечных последовательностей различных изолятов HIV), и антигены, происходящие из данных изолятов найдут применение по настоящим способам. Более того, данное изобретение в равной степени применимо к другим иммуногенным белкам, происходящим от любых из различных изолятов HIV, включая любые из различных оболочечных белков, такие как gp160 и gp41, антигены gag, такие как p24gag и p55gag, а также белки, происходящие из регионов pol и tat. Любые из данных белков и антигенов могут также модифицироваться для применения согласно изобретению. Например, на фиг. 1, 2, 5 и 6 представлены последовательности ДНК, кодирующие модифицированные антигены gag (SEQ ID NO: 63,64,67 и 68), а на фиг. 3 и 4 представлены последовательности ДНК, кодирующие модифицированные оболочечные антигены (SEQ ID NO: 65 и 66).

Другим примером вируса, для которого настоящее изобретение особо применимо, является вирус гриппа. Конкретно, оболочечные белки HA и NA вируса гриппа А вызывают особый интерес для индукции иммунного ответа. Были идентифицированы многие субтипы HA вируса гриппа A (Kawaoka et al., Virology (1990) 179: 759-767; Webster et al.,"Antigenic variation among type A influenza viruses,"p. 127-168. In: P. Palese and D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, New York). Таким образом, белки, происходящие от любого из данных изолятов также могут использоваться в описанных здесь композициях и способах.

Описанные здесь композиции и способы также найдут применение с многочисленными бактериальными антигенами, такими как антигены, происходящие из организмов, вызывающих дифтерию, холеру, туберкулез, столбняк, коклюш, менингит и другие патологические состояния, включая без ограничения Bordetella pertussis, Neisseria meningitides (A, B, C, Y), Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori и Haemophilus influenza, Haemophilus influenza типа B (HIB), Helicobacter pylori, и их комбинации. Примерами антигенов из Neisseria meningitides B служат те, что описаны в следующих патентных заявках, совладельцем которых является настоящий заявитель: PCT/US99/09346; PCT IB98/01665; и PCT IB99/00103. Примеры паразитических антигенов включают в себя антигены, происходящие из организмов, вызывающих малярию и болезнь Лайма.

Дополнительные антигены для применения согласно изобретению, некоторые из которых также перечислены в другом месте в данного описания, включают в себя следующие примеры (ссылки даны непосредственно ниже):

- белковый антиген из N. meningitidis серогруппы B, такой как в ссылках от 1 до 7 ниже;

- препарат везикул наружной мембраны (OMV) из N. meningitidis серогруппы B, такой как описанные ниже в ссылках 8, 9, 10, 11, и т.д.;

- сахаридный антиген из N. meningitidis серогруппы A, C, W135 и/или Y, такой как олигосахарид, описанный в ссылке 12 ниже для серогруппы C (см. также ссылку 13);

- сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, ссылки 14,15,16];

- антиген из N. gonorrhoeae [например, ссылки 1,2,3];

- антиген из Chlamydia pneumoniae [например, ссылки 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23];

- антиген из Chlamydia trachomatis [например, 24];

- антиген из вируса гепатита А, такого как инактивированный вирус [например, ссылки 25, 26];

- антиген из вируса гепатита B, такой как поверхностные и/или коровые антигены [например, ссылки 26,27];

- антиген из вируса гепатита C [например, ссылка 28];

- антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный холотоксин (PT) и филаментный гемагглютинин (FHA) из B. pertussis, необязательно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 [например, ссылки 29 и 30];

- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 3 ссылки 31], например, мутант CRM₁₉₇ [например, ссылка 32];

- столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин [например, глава 4 ссылки 31];

- белковый антиген из Helicobacter pylori, такой как CagA [например, ссылка 33], VacA [например, ссылка 33], NAP [например, ссылка 34], HopX [например, ссылка 35], HopY [например, ссылка 35] и/или уреаза;

- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae B [например, ссылка 13];

- антиген из Porphyramonas gingivalis [например, ссылка 36];

- полиомиелитный(-ые) антиген(-ы) [например, ссылки 37,38], такой как IPV или OPV;

- антиген(-ы) вируса бешенства [например, ссылка 39], такой как лиофилизированный инактивированный вирус [например, ссылка 40, Rabavert™);

- антигены кори, свинки и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11 ссылки 31];

- антиген(-ы) гриппа [например, глава 19 ссылки 31], такой как поверхностные белки гемагглютинин и/или нейраминидаза;

- антиген из Moraxella catarrhalis [например, ссылка 41];

- антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы B) [например, ссылки 42,43];

- антиген из Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А) [например, ссылки 43,44,45];

- антиген из Staphylococcus aureus [например, ссылка 46];

- композиции, включающие один или несколько данных антигенов.

В случае применения полисахаридного или углеводного антигена его предпочтительно конъюгируют с белком-носителем для усиления иммуногенности [например, ссылки с 47 по 56]. Предпочтительные белки-носители представлены бактериальными токсинами или анатоксинами, такими как дифтерийный или столбнячный анатоксины. Особенно предпочтительным является дифтерийный анатоксин CRM₁₉₇. Другие подходящие белки-носители включают в себя белок наружной мембраны N. meningitidis [например, ссылка 57], синтетические пептиды [например, ссылки 58, 59], белки теплового шока [например, ссылка 60], белки возбудителя коклюша [например, ссылки 61,62], белок D из H. Influenzae [например, ссылка 63], токсин A или B из C. difficile [например, ссылка 64], и т.д. В случае, когда смесь содержит полисахариды капсулы серогрупп A и C предпочтительным является, когда отношение (масс./масс.) полисахарид MenA: полисахарид MenC превышает 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Полисахариды из других серогрупп N. meningitidis могут конъюгироваться с одним тем же или различными белками-носителями.

Может применяться любая реакция конъюгации, где необходимо, с любым подходящим линкером.

Антигены токсичных белков, если необходимо, могут детоксифицироваться (например, детоксификация коклюшного токсина химическими и/или ... средствами [ссылка 30].

В случае включения в композицию дифтерийного антигена предпочтительно также включение столбнячного антигена и коклюшного антигена. Сходным образом, при включении столбнячного антигена предпочтительно также включение дифтерийного и коклюшного антигена. Сходным образом, при включении коклюшного антигена предпочтительно также включение дифтерийного и столбнячного антигена.

Легко понять, что настоящее изобретение может применяться для доставки различных макромолекул, осуществления таким образом лечения, профилактики и/или диагностики большого числа заболеваний. В некоторых осуществлениях композиции макромолекула/микрочастица согласно изобретению могут применяться для сайт-специфической направленной доставки. Например, внутривенное введение композиций макромолекула/микрочастица может применяться для нацеленной доставки в легкие, печень, селезенку, циркулирующую кровь или костный мозг.

Адсорбция макромолекул на поверхности микрочастиц адсорбента (или субмикронных эмульсий согласно изобретению) происходит по любому механизму связывания-взаимодействия, включая в качестве неограниченных примеров, образование ионной связи, водородной связи, ковалентной связи, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, физический захват и связывание за счет гидрофильных/гидрофобных взаимодействий. Обычные специалисты в данной области могут легко выбрать детергенты, подходящие для конкретного типа подлежащей адсорбции макромолекулы.

Например, выработка микрочастиц в присутствии заряженных детергентов, таких как анионные и катионные детергенты, может приводить к получению микрочастиц с поверхностью, обладающей суммарным отрицательным или суммарным положительным зарядом, которая может адсорбировать разнообразные молекулы. Например, микрочастицы, получаемые в присутствии анионных детергентов, таких как додецилсульфат натрия (SDS), т.е. микрочастицы SDS-PLG, адсорбируют положительно заряженные антигены, такие как белки. Сходным образом, микрочастицы, получаемые в присутствии катионных детергентов, таких как гексадецилтриметиламмония бромид (CTAB), т.е. микрочастицы CTAB-PLG, адсорбируют отрицательно заряженные антигены, такие как ДНК. В случае, когда подлежащие адсорбции макромолекулы содержат регионы с положительным и отрицательным зарядом, подходящими могут быть катионные, антионные, неионные или цвиттерионные детергенты.

Подлежащие биодеградации полимеры для получения микрочастиц, применяющихся согласно изобретению, легко доступны коммерчески, например, от Boehringer Ingelheim, Германия, и Birmingham Polymers, Inc., Бирмингем, Алабама. Например, полимеры, которые могут использоваться здесь для формирования микрочастиц, включают в себя гомополимеры, сополимеры и смеси полимеров, происходящие из следующих соединений: полигидроксимасляная кислота (также известная как полигидроксибутират); полигидроксивалериановая кислота (также известная как полигидроксивалерианат); полигликолевая кислота (PGA) (также известная как полиглиолид); полимолочная кислота (PLA) (также известная как полилактид); полидиоксанон; поликапролактон; полиортоэфир; и полиангидрид. Более предпочтительными являются поли-(α-гидроксикислоты), такие как поли-(L-лактид), поли-(D,L-лактид) (обе известные здесь как «PLA»), поли(гидроксибутират), сополимеры D,L-лактида и гликолида, такие как поли-(D,L-лактидкогликолид) (обозначенный здесь как «PLG» или «PLGA») или сополимер D,L-лактида и капролактона. Особенно предпочтительными полимерами для применения здесь являются полимеры PLA и PLG. Данные полимеры доступны в различных молекулярных массах, и подходящую молекулярную массу для данного определения легко определит специалист в данной области. Так, например, для PLA порядок подходящих молекулярных масс будет составлять примерно от 2000 до 5000. Для PLG подходящие молекулярные массы в основном будут изменяться примерно от 10,000 до 200000, предпочтительно примерно от 15000 до 150000.

Если для образования микрочастиц применяется такой сополимер, как PLG, здесь найдут применение различные отношения лактид:гликолид, и данное отношение во многом является предметом выбора, частично зависимым от совместно вводимой макромолекулы и требуемой скорости деградации. Например, полимер PLG 50:50, содержащий 50% D,L-лактида и 50% гликолида, будет предоставлять быструю резорбцию сополимера, тогда как PLG 75:25 деградирует медленнее, а варианты 85:15 и 90:10 даже медленнее вследствие повышения содержания лактидного компонента. Легко понять, что подходящее отношение лактид:гликолид легко определяется специалистом в данной области, например, на основании природы антигена и конкретного заболевания. Более того, в осуществлениях настоящего изобретения, где антигены или адъюванты захватываются микрочастицами, найдут применение смеси микрочастиц с различными отношениями лактид:гликолид, с целью достижения требуемой кинетики высвобождения данной макромолекулы и для обеспечения и первичного, и вторичного иммунного ответа. Скорость деградации микрочастиц согласно изобретению может также контролироваться такими факторами, как молекулярная масса полимера и его кристалличность. Сополимеры PLG с различными отношениями лактид:гликолид и молекулярными массами легко доступны коммерчески из некоторых источников, включая Boehringer Ingelheim, Германия, и Birmingham Polymers, Inc., Бирмингем, Алабама. Данные полимеры также могут синтезироваться простой поликонденсацией компонента молочной кислоты с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как описанные Tabata et al., J. Biomed. Mater. Res. (1988) 22: 837-858.

Предпочтительными полимерными поли-(D,L-лактидкогликолидами), где они применяются, являются те, что характеризуются молярным отношением лактид:гликолид, изменяющимся от 30:70 до 70:30, более предпочтительно от 40:60 до 60:40, и обладают молекулярной массой, изменяющейся от 10000 до 100000 дальтон, более предпочтительно от 30000 дальтон до 70000 дальтон.

Полимерные микрочастицы получают с использованием любых из нескольких способов, хорошо известных в данной области. Например, в некоторых осуществлениях для получения микрочастиц могут использоваться способы двойной эмульсии/упаривания растворителя, такие как описанные в патенте США № 3523907 и Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. (1988) 36: 1095-1103. Данные способы включают в себя образование первичной эмульсии, состоящей из капель раствора полимера, который впоследствии смешивают с непрерывной водной фазой, содержащей стабилизатор частиц/поверхностно-активное вещество.

Альтернативно, для образования микрочастиц может применяться упаривание растворителя «вода в масле в воде» (в./м./в.), как описано O'Hagan et al., Vaccine (1993) 11: 965-969, в PCT/US99/17308 (WO 00/06123), выданном O'Hagan et al., и Jeffery et al., Pharm Res. (1993) 10: 362. По данному способу конкретный полимер обычно комбинируют с органическим растворителем, таким как этилацетат, диметилхлорид (также называемый метиленхлоридом и дихлорметаном), ацетонитрил, ацетон, хлороформ и тому подобные. Полимер предоставляется в концентрации раствора в органическом растворителе, равной около 1-30%, предпочтительно около 2-15%, более предпочтительно около 3-10%, и наиболее предпочтительно 4-6%. Раствор полимера затем объединяют с водным раствором и эмульгируют с образованием эмульсии м./в. Водный раствор может, например, представлять собой деионизованную воду, физраствор или буферный раствор, такой как фосфатно-солевой буфер (PBS) или буферный раствор цитрата натрия/этилендиаминоукусной кислоты (цитрат натрия/ETDA). Предпочтительно, объемное отношение раствора полимера и водного раствора изменяется примерно от 5:1 до 20:1, более предпочтительно составляет примерно 10:1. Эмульгирование проводят с использованием любого оборудования подходящего для этой задачи, и оно обычно представляет собой устройство с высоким усилием сдвига, такое как, например, гомогенизатор.

Объем эмульсии м./в. затем предпочтительно, но необязательно объединяют с большим объемом водного раствора, предпочтительно содержащего катионный, анионный или неионный детергент. Объемное отношение водного раствора и эмульсии м./в. обычно изменяется примерно от 2:1 до 10:1, наиболее обычно составляет примерно 4:1. Примеры анионных, катионных и неионных детергентов, подходящих для выполнения изобретения, перечислены выше и включают в себя SDS, CTAB и PVA, соотвественно. Конкретные макромолекулы могут лучше адсорбироваться на микрочастицы, содержащие комбинации стабилизаторов и/или детергентов, например комбинацию PVA и DOTAP. Более того, в некоторых случаях может потребоваться добавление детергентов к указанному выше органическому раствору. В случае применения неионного детергента, такого как PVA, в качестве стабилизатора эмульсии его обычно предоставляют в растворе с концентрацией, примерно равной 2-15%, более обычно равной примерно 4-10%. В случае применения катионного или анионного детергента его обычно предоставляют в растворе с концентрацией, примерно равной 0,05-5%, более обычно равной примерно 0,25-1%. В основном применяют массовое соотношение детергента и полимера в примерных пределах от 0,00001:1 до 0,5:1, более предпочтительно в примерных пределах от 0,0001:1 до 0,5:1, более предпочтительно в примерных пределах от 0,001:1 до 0,5:1, и даже более предпочтительно в примерных пределах от 0,005:1 до 0,5:1.

Затем смесь гомогенизируют с образованием стабильной двойной эмульсии в./м./в. Затем упаривают органические растворители. Можно управлять параметрами препарата, чтобы получать микрочастицы от малых, порядка 0,05 мкм (50 нм), до более крупных, размером 50 мкм или даже больше. См., например, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; McGee et al., J Microencap. (1996). Например, снижение перемешивания приводит к образованию более крупных микрочастиц, как и увеличение объема внутренней фазы. Малые частицы продуцируют при малых объемах водной фазы и с высокими концентрациями стабилизаторов эмульсии.

Дополнительную информацию можно найти в заявке на выдачу патента США № Attorney Docket Nos. PP 16502.002, озаглавленной «Микрочастицы с адсорбированными макромолекулами», поданной 28 сентября 2001 г.

Можно управлять параметрами препарата, чтобы получать микрочастицы от малых, порядка 0,05 мкм (50 нм), до более крупных, размером 50 мкм или даже больше. См., например, Jeffery et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362-368; McGee et al., J Microencap. (1996). Например, снижение перемешивания приводит к образованию более крупных микрочастиц, как и увеличение объема внутренней фазы. Малые частицы продуцируют при малых объемах водной фазы и с высокими концентрациями стабилизаторов эмульсии.

Микрочастицы также могут быть образованы с использованием распыления-высушивания и коацервации, как описано, например, Thomasin et al., J. Controlled Release (1996) 41: 131; в патенте США № 2800457; Masters, К (1976) Spray Drying 2nd Ed. Wiley, New York; с использованием способов покрытия воздушной суспензии, таких как смазывание формы (pan coating) и покрытие Wurster, описанные Hall et al., (1980) The "Wurster Process" in Controlled Release Technologies: Methods, Theory, and Applications (A. F. Kydonieus, ed.), Vol. 2, pp. 133-154 CRC Press, Boca Raton, Florida and Deasy, P. B., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. (1988) S (2): 99-139; и с использованием ионного застывания, как описано, например, Lim et al., Science (1980) 210: 908-910.

Размер частиц может определяться, например, путем лазерного светорассеяния, с использованием, например, спектрометра, включающего гелий-неоновый лазер. В основном, определение размера частиц проходит при комнатной температуре и включает в себя множественные анализы данного образца (например, 5-10 раз) для получения среднего значения размера частицы. Размер частиц также легко определяют с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM).

Альтернативные осуществления настоящего изобретения задействуют препараты микрочастиц, включающих субмикронную эмульсию, которая предпочтительно включает в себя ионное поверхностно-активное вещество. В частности, в качестве основной маслосодержащей субмикронной эмульсии могут применяться MF59 или другие соединения, тогда как ионные поверхностно-активные вещества могут включать в себя в качестве неограничивающих примеров диолеил-3-триметиламонийпропан (DOTAP), диолеил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (DEPC) и диолеилфосфатидную кислоту (DPA), причем все они растворимы в сквалене. Предполагаемые ионные эмульсии могут быть получены путем растворения каждого из данных детергентов в сквалене/10% Span 85 в концентрациях, изменяющихся от 4 до 52 мг/мл сквалена. Смеси сквален/поверхностно-активное вещество могут быть эмульгированы в 0,5% Tween 80/H₂О при соотношении 5 мл сквалена/100 мл H₂О. Предварительная эмульсия может формироваться путем гомогенизации в гомогенизаторе Silverson (5 минут, 5000 об./мин), и конечные эмульсии могут быть получены микрофлюидизацией (˜10000 фунтов на кв.дюйм, 5 циклов, Microfluidizer 110S). Дополнительное обсуждение касательно субмикронных эмульсий можно найти ниже.

После получения микрочастицы можно хранить лиофилизованными для будущего применения. Обычно для адсорбции макромолекул на микрочастицы препарат микрочастиц просто смешивают с интересующей макромолекулой, и полученный в результате препарат можно снова лиофилизовать перед применением. В общем, макромолекулы добавляют к микрочастицам для получения микрочастиц с адсорбированными макромолекулами при массовом соотношении макромолекул и микрочастиц, составляющем примерно от 0,0001:1 до 0,25:1, предпочтительно от 0,001:1 до 0,1, более предпочтительно от 0,01 до 0,05. Содержание макромолекул в микрочастицах можно определить стандартными способами.

Как указывалось выше, макромолекулы для применения согласно изобретению включают в себя белки, предпочтительно антигенные молекулы и нуклеиновые кислоты, предпочтительно векторные конструкции, способные обеспечивать экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, такие как векторы на основе CMV, векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции.

Полимерные микрочастицы согласно изобретению могут содержать захваченные или инкапсулированные внутри них макромолекулы, а также содержать адсорбированные на них макромолекулы. Так, например, специалист в данной области может получить согласно изобретению микрочастицы, содержащие инкапсулированные адъюванты с адсорбированным на них вектором ELVIS, или микрочастицы, содержащие инкапсулированный антиген с адсорбированной на них векторной РНК-конструкцией. Данное изобретение относится к различным комбинациям молекул нуклеиновой кислоты, адсорбированных на микрочастицах и захваченных внутрь них, вместе с другими нуклеиновыми кислотами, а также другими молекулами. В некоторых предпочтительных осуществлениях микрочастицы согласно изобретению содержат адсорбированные на них векторы ELVIS или векторные РНК-конструкции.

Кроме того, любые осуществления микрочастиц согласно изобретению могут доставляться в сочетании с электропорацией.

Продуцированные микрочастицы с адсорбированными макромолекулами и/или субмикронные эмульсионные микрочастицы составляются с любыми требуемыми адъювантами в фармацевтические композиции, включающие вакцины, для лечения профилактики и диагностики множества нарушений, как описано выше. Композиции, в основном, включают в себя один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей. Например, могут использоваться такие носители, как вода, солевой раствор, глицерин, полиэтиленгликоль, гиалуроновая кислота, этанол, и.т.д. В таких носителях могут присутствовать другие наполнители, такие как увлажняющие или эмульгирующие вещества, биологические буферные вещества и тому подобное.

Биологическим буферным раствором может быть практически любой раствор, который является фармацевтически приемлемым и обеспечивает требуемый рН препарата, т.е. рН физиологических пределов. Примеры буферных растворов включают в себя солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, Tris-солевой буфер, буферный солевой раствор Хэнкса и тому подобное. Другие наполнители, известные в данной области, могут также вводиться в конечную дозированную форму, включая связующие вещества, разрыхлители, наполнители (растворители), смазки, агенты скольжения (усилители текучести), компрессионные средства, красители, подсластители, консерванты, суспендирующие/диспергирующие средства, пленкообразователи/покрытия, вкусовые добавки и печатные краски.

Композиции согласно изобретению включают в себя терапевтически эффективное количество одной или нескольких интересующих макромолекул. То есть композиции включают в себя количество макромолекулы/микрочастицы, которое вызовет у субъекта ответ, достаточный для профилактики, снижения, элиминации или диагностики симптомов. Точное количество необходимо изменять в зависимости от подлежащего лечению субъекта; тяжести подлежащего лечению состояния; в случае иммунного ответа - от способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела; степени требуемой защиты и конкретного выбранного антигена и способа его введения, а также от прочих факторов. Подходящее эффективное количество может легко определяться специалистом в данной области. Так, терапевтически эффективное количество попадает в относительно широкий интервал, который может определяться рутинными испытаниями.

Например, для целей настоящего изобретения, в том случае, когда молекула представляет собой полинуклеотид, эффективная доза обычно изменяется примерно от 1 нг до 10 мг, более предпочтительно примерно от 10 нг до 1 мг, и, наиболее предпочтительно примерно от 100 мкг до 1 мг доставленной макромолекулы на дозу; в том случае, когда молекула представляет собой антиген, эффективная доза обычно изменяется примерно от 1 мкг до 100 мг, более предпочтительно примерно от 10 мкг до 1 мг, и, наиболее предпочтительно примерно от 50 мкг до 1 мг доставленной макромолекулы на дозу.

После получения композиции согласно изобретению могут вводиться парентерально, например путем инъекции. Композиции могут инъецироваться подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно. Другие способы введения включают в себя назальное введение, введение через слизистые, ректальное, вагинальное, пероральное и пульмональное введение, суппозитории и трансдермальное или чрезкожное применение. Дозированное лечение может представлять собой схему с одной дозой или схему с множественными дозами. В схеме с множественными дозами первичный курс введения может осуществляться 1-10 раздельными дозами, с последующим введением других доз, которые вводят через следующие интервалы времени, выбранные для поддержания и/или усиления ответа на терапию, например через 1-4 месяца вводят вторую дозу, и, если требуется, вводят последующую(-ие) дозу(-ы) через несколько месяцев.

В конкретных осуществлениях изобретениях за серией из одной или нескольких инъекций векторной конструкции (которая включает в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген) следует серия из одной или нескольких инъекций антигена (также обозначена здесь как «поддерживающие инъекции»). Как конкретный пример, векторная конструкция может вводиться тремя инъекциями: (a) в момент первого введения, (b) в момент времени через 1-8 недель после первого введения, (c) в момент времени через 4-32 недели после первого введения, тогда как антиген может вводиться двумя инъекциями: (a) в момент времени через 8-50 недель после первого введения, (b) в момент времени через 8-100 недель после первого введения.

Режим дозировки также может, по меньшей мере частично, определяться потребностью субъекта и может зависеть от решения практикующего врача.

Более того, если требуется профилактика заболевания, микрочастицы с адсорбированными векторными конструкциями в основном вводят перед первичной инфекцией интересующим патогенным микроорганизмом. Если требуется лечение заболевания (а не его профилактика), например снижение симптомов или рецидивов, микрочастицы с адсорбированными векторными конструкциями в основном вводят после первичной инфекции.

2. Масляно-капельные эмульсии

В других осуществлениях настоящего изобретения получают масляно-капельную эмульсию (в частности, субмикронную эмульсию), включающую метаболизирующееся масло и эмульгирующее вещество. Молекулы, такие как олигонуклеотид, включающий по меньшей мере один CpG-мотив, могут комбинироваться с масляно-капельной эмульсией с образованием адъюванта.

Масляно-капельная эмульсия предпочтительно включает в себя метаболизирующееся масло и эмульгирующее вещество, где масло и эмульгирующее вещество присутствуют в форме эмульсии масла в воде, содержащей капли масла, по существу все составляющие менее одного микрометра в диаметре. Субмикронные эмульсии с каплями данного предпочтительного интервала размеров неожиданно имеют преимущество над другими эмульсиями, содержащими масло и эмульгирующие вещества, в которых капли масла являются существенно более крупными, чем в тех, что относятся к настоящему изобретению. В предпочтительных осуществлениях эмульсия положительно заряжена в результате присутствия катионного детергента, который применяли в качестве эмульгирующего вещества, или, альтернативно, содержит катионный детергент в дополнение к эмульгирующему веществу. Это способствует адсорбции нуклеотидных антигенных молекул, таких как CpG-олигонуклеотиды или векторные конструкции. Альтернативно, применение анионных детергентов способствует адсорбции таких молекул, как белки.

Хотя индивидуальные компоненты композиций субмикронных эмульсий согласно изобретению в основном известны, такие композиции не комбинированы тем же способом. Соответственно, индивидуальные компоненты, хотя они и описаны ниже как в общем, так и в некоторых деталях для предпочтительных осуществлений, хорошо известны в данной области, и применяемые здесь термины, такие как метаболизирующееся масло, эмульгирующее вещество, иммуностимулирующее средство, мурамилпептид и липофильный мурамилпептид, известны в достаточной степени, чтобы указать данные соединения специалистам в данной области без дальнейшего описания.

Одним из компонентов данных композиций является метаболизирующееся, нетоксичное масло, предпочтительно, состоящее примерно из 6-30 углеродных атомов, включая в качестве неограничивающих примеров алканы, алкены, алкины и соответствующие им кислоты и спирты, их простые и сложные эфиры и их смеси. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетически полученное масло, которое может метаболизироваться в организме животного-хозяина, которому будет введен адъювант и которое не токсично для данного субъекта. Животное-хозяин обычно является млекопитающим и, предпочтительно, человеком. Применение согласно изобретению минерального масла и подобных токсичных масел-продуктов нефтеперегонки категорически исключено.

Масляный компонент согласно изобретению может также представлять собой любой длинноцепочечный алкан, алкен или алкин, или производную от них кислоту или спирт, будь то свободная кислота, ее соль или сложный эфир, такой как моно-, ди- или триэфир, включая триглицериды или сложные эфиры 1,2-пропандиола или сходные полигидроксиспирты. Спирты могут ацилироваться с использованием амино- или полифункциональной кислоты, например уксусной кислоты, пропионовой кислоты, лимонной кислоты и тому подобных. Также могут использоваться простые эфиры - производные длинноцепочечных спиртов, являющиеся маслами и отвечающие другим установленным здесь критериям.

Индивидуальная группа алкана, алкена или алкина и производные от нее спирты и кислоты могут, как правило, содержать примерно от 6 до 30 углеродных атомов. Данная группа может характеризоваться линейной или разветвленной структурой цепи. Она может быть полностью насыщенной или содержать одну или несколько двойных или тройных связей. В случае применения масел на основе полимеров сложных или простых эфиров, ограничение, касающееся примерно 6-30 углеродов, распространяется на индивидуальную группу жирной кислоты или жирного спирта, а не на общее число углеродных атомов.

Здесь может использоваться любое метаболизирующееся масло, особенно происходящее из животного, рыбы или растения. Существенным является то, что данное масло метаболизируется организмом хозяина, которому оно вводится, иначе компонент масла может вызвать абсцессы, гранулемы или даже карциномы, или (при использовании в ветеринарной практике) может привести к тому, что масло вакцинированных птиц и животных станет неприемлемым для использования в пищу человеком вследствие вредоносного действия неметаболизированного масла на потребителя.

Для подробного описания таких субмикронных эмульсий см. International Publication № WO 90/14837 и принадлежащую настоящему заявителю International Patent Application PCT/US00/03331.

Масляный компонент данных адъювантов и иммуногенные композиции могут присутствовать в количестве, составляющем примерно от 0,5% до 20% по объему, но предпочтительно не более 15%, особенно в количестве, составляющем примерно от 1% до 12%. Наиболее предпочтительно применение примерно от 1% до 4% масла.

Водная часть данных композиций субмикронных эмульсий предпочтительно представляет собой солевой буфер, или, более предпочтительно, воду без примесей. Поскольку данные композиции предназначены для парентерального применения, предпочтительно составлять буферные растворы, применяемые в качестве иммуногенных композиций, так, что содержание солей, т.е. осмолярность, будет по существу таким же, как и в нормальных физиологических жидкостях, чтобы предотвратить отек после введения или быстрое всасывание композиции, возникающие по причине различных концентраций ионов в композиции и физиологических жидкостях. Также предпочтительным является делать солевой раствор буферным для поддержания значения рН, совместимого с нормальными физиологическими условиями. Также в некоторых случаях может быть необходимым поддержание рН на конкретном уровне для обеспечения стабильности некоторых компонентов композиции, таких как гликопептиды.

Может применяться любой фармацевтически приемлемый буфер, но предпочтительными являются фосфатные буферы. Другие приемлемые буферы, такие как ацетатный, tris, бикарбонатный, карбонатный, и подобные им, могут применяться в качестве замены фосфатным буферам. pH водного компонента предпочтительно составляет примерно 6,0-8,0.

Однако в начале получения субмикронной эмульсии предпочтительным водным компонентом эмульсии является вода без примесей. Повышение концентрации соли приводит к затруднениям при достижении требуемого малого размера капель. При получении из адъюванта конечной иммуногенной композиции, антигенный материал может добавляться к буферу подходящей осмолярности для обеспечения требуемой иммуногенной композиции.

Количество водного компонента, применяемого в данных композициях, необходимо для приведения к единице объема композиции. То есть количество водного компонента, достаточное для образования 100%, смешивают с другими перечисленными выше компонентами для доведения объема композиций.

В фармацевтических областях в общем применяют существенное количество эмульгирующих и суспендирующих средств. Они включают в себя материалы природного происхождения, такие как смолы деревьев, растительный белок, основанные на сахарах полимеры, такие как альгинаты и целлюлоза, и тому подобное. Некоторые оксиполимеры или полимеры, содержащие на углеродном скелете гидроксид или другие гидрофильные заместители, обладают действием поверхностно-активных веществ, например повидон, поливиниловый спирт и моно- и полифункциональные соединения на основе гликолевых простых эфиров. Соединения - производные длинноцепочечных жирных кислот образуют третью существенную группу эмульгирующих и суспендирующих средств, которые могут использоваться согласно изобретению. Любые из вышеупомянутых поверхностно-активных веществ могут использоваться при условии, если они не токсичны.

Конкретные примеры подходящих эмульгирующих веществ (также обозначаемых как поверхностно-активные вещества и детергенты), которые могут использоваться согласно изобретению, описаны в принадлежащей настоящему заявителю Международной патентной заявке PCT/USOO/0331. Поверхностно-активные вещества в основном подразделяются на четыре основных типа: анионные, катионные, цвиттерионные и неионные. Неограничивающие примеры анионных детергентов включают в себя альгиновую кислоту, каприловую кислоту, холевую кислоту, 1-декансульфоновую кислоту, дезоксихолевую кислоту, 1-додекансульфоновую кислоту, N-лауроилсаркозин и таурохолевую кислоту, и тому подобное. Катионные детергенты включают в себя в качестве неограничивающих примеров цетримид (цетилтриметиламмония бромид или CTAB), бензалкония хлорид, диметилдиоктодециламмония (DDA) бромид, DOTAP, додецилтриметиламмония бромид, бензилдиметилгексадециламмония хлорид, цетилпиридиния хлорид, метилбензетония хлорид, и 4-пиколиндодецилсульфат и тому подобное. Неограничивающие примеры цвиттерионных детергентов включают в себя 3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат (обычно сокращается как CHAPS), 3-[(холамидопропил)диметиламмоний]-2-гидрокси-1-пропансульфонат (главным образом обозначается как CHAPSO), N-додецил-N,N-диметил-3-аммоний-1-пропансульфонат и лизо-α-фосфатидилхолин, и тому подобное. Неограничивающие примеры неионных детергентов включают в себя деканоил-N-метилглюкамид, монопентиловый простой эфир диэтиленгликоля, н-додецил-β-D-глюкопиранозид, продукты конденсации этиленоксида с жирными спиртами (например, имеющиеся в продаже под торговым названием Lubrol), полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот (особенно, C₁₂-C₂₀-жирных кислот), полиоксиэтиленовые сорбитановые эфиры жирных кислот (например, имеющиеся в продаже под торговым названием Tween) и сорбитановые эфиры жирных кислот (например, имеющиеся в продаже под торговым названием Span) и тому подобное.

Особенно полезной группой сурфактантов являются неионные поверхностно-активные вещества на сорбитановой основе, такие как коммерчески доступные SPAN^® или ARLACEL^®, обычно с буквенным или численным обозначением, предназначенным для различия разных моно-, ди- или триэфирных замещенных сорбитанов. Родственная группа поверхностно-активных веществ включает в себя полиоксиэтиленовые сорбитановые моноэфиры и полиоксиэтиленовые сорбитановые триэфиры, коммерчески доступные под маркой TWEEN^®. Для обеспечения стабильности эмульсии поверхностно-активные вещества TWEEN могут комбинироваться с родственными поверхностно-активными веществами на основе сорбитановых моноэфиров или триэфиров.

Размер масляных капель может варьировать за счет изменения соотношения детергента и масла (повышения отношения снижает размер капли, рабочего давления (повышение рабочего давления снижает размер капли), температуры (повышение температуры снижает размер капли) и за счет добавления амфипатического иммуностимуляторного средства (добавление таких средств снижает размер капли). Фактический размер капли изменяется в зависимости от конкретного детергента, масла и иммуностимуляторного средства (если таковое имеется) и в зависимости от конкретных выбранных условий обработки. Размер капель может подтверждаться путем использования оборудования для измерения размеров, такого как коммерческий Sub-Micron Particle Analyzer (Model N4MD), производимый Coulter Corporation, и данные параметры могут изменяться согласно установленным выше руководящим принципам, пока по существу все капли не будут составлять менее 1 микрометра в диаметре, предпочтительно менее 0,8 микрометров в диаметре, и наболее предпочтительно менее 0,5 микрометра в диаметре. «По существу все капли» означает по меньшей мере около 80% (по количеству), предпочтительно, по меньшей мере, около 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, около 95%, и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, около 98%. Распределение размеров частиц обычно является гауссовым, так что их средний диаметр меньше, чем установленные пределы.

Предпочтительной масляно-капельной эмульсией является MF59. MF59 может быть получена по процедурам, описанным, например, Ott et al., Vaccine Design: The Subunit And Adjuvant Approach, 1995, M. F. Powell and M. J. Newman, Eds., Plenum Press, New York, p. 277-296; Singh et al., Vaccine, 1998,16,1822-1827; Ott et al, Vaccine, 1995,13,1557-1562; и Valensi et al., J. Immunol., 1994,153, 4029-39, описания этих публикаций включены в данное описание полностью в качестве ссылки.

Другие масляно-капельные эмульсии включают в себя, например, SAF, содержащую 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блокированного плуроном полимера L121 и thr-MDP, микрофлюидизированные с образованием субмикронной эмульсии или обработанные на устройстве типа вортекс с образованием эмульсии с частицами большего размера, и адъювантную систему Ribi^® (RAS), (Ribi Immunochem, Гамильтон, Монтана), содержащую 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, включающей в себя монофосфориллипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM), и цитоскелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™) (для дальнейшего обсуждения подходящих для применения здесь субмикронных эмульсий масла в воде см. принадлежащую заявителю заявку на выдачу патента № 09/015736, поданную 29 января 1998 г.).

После получения микрочастиц согласно изобретению, полимерного типа или типа субмикронной эмульсии, на них могут адсорбироваться макромолекулы, такие как полипептиды и векторные конструкции, как обсуждалось ранее. Микрочастицы, основанные на субмикронной эмульсии, согласно изобретению могут также содержать захваченные или инкапсулированные внутрь них макромолекулы, а также содержать адсорбированные на них макромолекулы. Так, например, специалист в данной области может согласно изобретению получить микрочастицы, содержащие инкапсулированные адъюванты с адсорбированным на них вектором ELVIS, или микрочастицы, содержащие инкапсулированный антиген и адсорбированную на них векторную РНК-конструкцию. Данное изобретение относится к различным комбинациям макромолекул нуклеиновой кислоты, адсорбированных на микрочастицах и захваченных внутрь них, с другими нуклеиновыми кислотами, а также другими антигенными молекулами. Предпочтительно, микрочастицы согласно изобретению содержат адсорбированные на них векторы ELVIS или веторные РНК-конструкции. Кроме того, любые осуществления микрочастиц согласно изобретению могут доставляться в сочетании с электропорацией.

3. Векторы ELVIS

Векторы ELVIS представляют собой системы инициации эукариотического многоуровневого вектора, которые в основном описаны в патентах США 5814482 и 6015686, цитируемых выше, а также в International Patent Applications WO 97/38087 и WO 99/18226. В одном из осуществлений вектор ELVIS происходит из генома альфавируса, более предпочтительно вируса Синдбис (SIN), вируса Леса Семлики (SFV), вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE) или вирус Росс-Ривер (RRV). Альфавирус представляет собой РНК-вирус длиной приблизительно 11-12 т.п.н., содержащий 5'-концевой кэп и 3'-концевой полиаденилатный хвост. Зрелый инфекционный вирус состоит из геномной РНК, окруженной нуклеокапсидом и оболочечными белками. Инфекция альфавирусом клеток хозяина происходит как опосредованное рецептором событие, кульминацией которого является высвобождение геномной РНК в цитоплазму. Во время репликации вируса синтезируются и встраиваются в мембрану клетки хозяина кодируемые вирусом оболочечные гликопротеины E1 и E2, посредством которых пробиваются и высвобождаются из клетки хозяина дочерние вирионы.

Репликация вирусного генома начинается с цепи геномной РНК, которая служит в качестве матрицы для синтеза комплементарной минус-нити РНК. Минус-нить РНК затем служит в качестве матрицы для полноразмерной геномной РНК и для внутренне инициируемой субгеномной РНК с плюс-нитью. Неструктурные белки транслируются с геномной цепи, в то время как структурные белки транслируются с субгеномной цепи. Все вирусные гены вначале экспрессируются как полипротеины, затем подвергаются пост-трансляционному процессингу путем протеолитического расщепления с образованием индивидуальных белков.

Альфавирусный векторный репликон может быть образован путем замещения некоторых частей вирусного генома (например, генов структурных белков) выбранной гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Таким образом, в некоторых осуществлениях альфавирусный репликон может включать в себя 5'-концевую последовательность, способную инициировать транскрипцию альфавируса, нуклеотидную последовательность, кодирующие неструктурные белки альфавируса, альфавирусный промотор региона сращения, сайт распознавания альфавирусной РНК-полимеразы и 3'-концевой полиаденилатный участок. Кроме того, в альфавирусной векторной конструкции может содержаться альфавирусный векторный репликон в виде копии кДНК. Такие векторные конструкции обычно включают в себя 5'-концевой промотор, способный инициировать синтез РНК с кДНК, который располагается выше по цепи и функционально ассоциирован с векторной кДНК, так что при такой транскрипции образуется векторный РНК-репликон. Векторная конструкция может содержать 3'-концевую последовательность, контролирующую терминацию транскрипции. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может присутствовать выше или ниже по цепи от вирусного региона сращения.

Выгодность применения вектора ELVIS основывается на механизме репликации РНК-вируса, обеспечивающего достижение доставки интересующих гетерологичных нуклеотидных последовательностей путем применения двухслойного подхода (например, основанного на описанной выше альфавирусной векторной конструкции). В общем, вектор ELVIS представляет многоуровневую экспрессионную систему, способную амплифицировать некоторое количество РНК, кодирующей интересующий генный продукт, по причине того, что первый слой инициирует транскрипцию второго слоя. Так, типичный вектор ELVIS включает в себя 5'-концевой промотор, способный инициировать синтез РНК с кДНК, кДНК, комплементарную конструкции, способной к автономной репликации в клетке, причем данная конструкция также способна экспрессировать гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, и 3'-последовательности, контролирующие терминацию транскрипции. Конструкция, способная к автономной репликации и экспрессии выбранной последовательности нуклеиновой кислоты, может являться альфавирусной векторной конструкцией. Таким образом, с первого слоя ДНК-вектора ELVIS транскрибируется альфавирусная векторная РНК-конструкция, с которой достигается экспрессия выбранной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты.

Основанный на альфавирусе вектор ELVIS может вначале конструироваться путем получения кДНК, комплементарной альфавирусному геному. кДНК, соответствующая геномной РНК, затем подвергается делеции по последовательностям, кодирующим один или несколько структурных вирусных белков, которые затем могут замещаться гетерологичной ДНК, кодирующей интересующий генный продукт, что таким образом предотвращает сборку зрелого вируса и обеспечивает амплификацию гетерологичной последовательности. Модифицированная кДНК, содержащая гетерологичную последовательность, затем подвергается вставке в первый слой вектора ELVIS. После введения в клетку и ядро вектор ELVIS транскрибируется, и полученные в результате молекулы мРНК, представляющие собой РНК-векторы, способные к саморепликации, начинают реплицироваться и транслировать полипептиды, включая интересующий гетерологичный ген.

Хотя предпочтительной является обычная альфавирусная векторная конструкция, происходящая от вируса Синдбис, согласно представленной здесь концепции могут легко применяться другие виды альфавирусов. Альтернативно могут задействоваться векторы, происходящие из любого РНК-вируса, особенно из вирусов с плюс-нитью.

Конструкция вектора ELVIS в общем описана в патентах США 5814482 и 6015686. В кратком изложении, РНК получают из РНК-вируса, тогда как кДНК синтезируют путем PCR-амплификации c использованием подходящих праймеров для конкретных генов или частей РНК-вируса, причем данные праймеры по необходимости могут также содержать дополнительные сайты рестрикции. Затем фрагменты кДНК клонируют в плазмиду и трансформируют ими подходящего хозяина, такого как E. coli. Позитивные колонии выращивают для очистки плазмиды и затем плазмиды объединяют в требуемом векторе ELVIS с частью, содержащей гетерологичную ДНК, такую как ген-репортер (например, GFP) или требуемый ген, кодирующий антиген. В примере 3 ниже описан конкретный предпочтительный вектор ELVIS (pSINCP), применяемый согласно изобретению.

4. Векторные РНК-конструкции и векторные конструкции pCMV

В других осуществлениях настоящего изобретения векторная РНК-конструкция или вектор-репликон на основе РНК применяется непосредственно, не требуя введения в клетку ДНК и транспорта в ядро, где должна произойти транскрипция. За счет применения РНК-вектора для непосредственной доставки в цитоплазму клетки хозяина эффективно происходит автономная репликация и трансляция гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты. В данном осуществлении векторная РНК-конструкция или вектор-репликон на основе РНК получают путем транскрипции in vitro векторной конструкции на основе ДНК. Предпочтительно, векторная РНК-конструкция или вектор-репликон на основе РНК происходит из генома альфавируса, более предпочтительно из вируса Синдбис (SIN), вируса Леса Семлики (SFV), вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (VEE) или вируса Росс-Ривер (RRV). В других осуществлениях векторная РНК-конструкция происходит из вируса, отличного от альфавируса. Предпочтительно, такие вирусы, применяемые для создания производных векторных РНК-конструкций, представляют собой РНК-вирусы с плюс-нитью и, более предпочтительно, они представляют собой пикорнавирусы, флавивирусы, рубивирусы или коронавирусы. Композиции и способы для транскрипции vitro РНК-векторов на основе альфавирусов подробно представлены в других источниках (см. патент США 5842723 и Polo et al., 1999, PNAS 96: 4598-603). РНК-вектор затем адсорбируется на микрочастицу согласно изобретению для доставки, как здесь подробно описано. Хотя предпочтительным является обычный альфавирусный РНК-вектор из SIN, SFV, VEE или RRV, они могут легко замещаться другими видами альфавирусов.

В другом осуществлении настоящего изобретения применяются векторные конструкции pCMV. Такие векторные конструкции хорошо известны в данной области. Особенно предпочтительный вектор pCMV содержит немедленный ранний энхансер/промотор CMV и терминатор бычьего гормона роста. Он подробно описан Chapman, B. S., et al. 1991."Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells." Nucleic Acids Res. 19: 3979-86.

5. Адъюванты

Адъюванты могут необязательно применяться для усиления эффективности фармацевтических композиций, причем Th1-стимулирующие адъюванты являются особенно предпочтительными. Адъюванты могут вводиться одновременно с микрочастицами согласно изобретению, например, в одной и той же композиции или в различных композициях. Альтернативно, адъювант может вводиться до или после введения композиций микрочастиц согласно изобретению. В другом осуществлении адъювант, такой как иммунологический адъювант, может инкапсулироватся в микрочастицу. Адъюванты, как и любые другие макромолекулы, могут инкапсулироваться в микрочастицы с использованием любого из нескольких способов, известных в данной области. См., например, патент США № 3523907; Ogawa et al., Chem Pharm. Bull. (1988) 36: 1095-1103; O'Hagan et al., Vaccine (1993) 11: 965-969 and Jefferey et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362. Альтернативно, адъюванты могут адсорбироваться на микрочастице, как описано выше для любой макромолекулы. Альтернативно, адъюванты могут включать в себя масляно-капельные эмульсии согласно изобретению.

Иммунологические адъюванты содержит в качестве неограничивающих примеров: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) другие препараты эмульсии масла в воде (с добавлением других специфических иммуностимуляторных средств, таких как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты бактериальной клеточной стенки, или без них), такие как, например, (a) MF59 (International Publication No. W090/14837 ; глава 10 в Vaccine design: the subunit an adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), содержащая 5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержит различные количества MTP-PE (см. ниже), хотя это не требуется), составленные в форме субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, Массачусетс), (b) SAF, содержащая 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блокированного плуроном полимера L121 и thr-MDP (см. ниже), микрофлюидизированные с образованием субмикронной эмульсии или обработанные на устройстве типа вортекс с образованием эмульсии с частицами большего размера, (с) адъювантную систему Ribi^® (RAS), (Ribi Immunochem, Гамильтон, Монтана), содержащую 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, включающей в себя монофосфориллипид A (MPL), димиколат трегалозы (TDM) и цитоскелет клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™) (для дальнейшего обсуждения подходящих для применения здесь субмикронных эмульсий масла в воде см. принадлежащую заявителю заявку на выдачу патента № 09/015736, поданную 29 января 1998 г.); (3) могут использоваться сапониновые адъюванты, такие как Quil A или QS21 (например, Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, Массачусетс)) или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимуляторные комплексы), причем данные ISCOM могут не содержать дополнительных детергентов, например WO00/07621; (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL5, IL-6, IL-7, IL-12 (W099/44636), и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF), и т.д.; (6) монофосфориллипид A (MPL) или 3-О-деацилированный MPL (3dMPL), например GB-2220221, EP-A-0689454, необязательно, в полное отсутствие квасцов при использовании с полисахаридами пневмококка, например WO00/56358; (7) комбинации 3dMPL, например с QS21 и/или эмульсиями масла в воде, например EP-A-0835318, EP-A0735898, EP-A-0761231; (8) олигонуклеотиды, включающие CpG-мотивы (Roman et al., Nat. Med., 1997,3,849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997,94,10833-10837; Davis et al., J. Immunol 1988, 160,870-876; Chu et al., J. Exp. Med., 1997,186,1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol. 1997,27,2340-2344; Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16,1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995,374,546-549; Klinman et al., PNAS USA, 1996,93,2879-2883: Ballas et al., J. Immunol., 1996,157,1840-1845; Cowdery et al., J. Immunol., 1996,156,4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996,167,72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988, 79,866-873; Stacey et al., J Immunol, 1996,157,2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991,147,1759-1764; Yi et al., J. Immunol., 1996,157,4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996,157,5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998,160,4755-4761; and Yi et al., J: Immunol., 1998,160,5898-5906; International patent applications W096/02555, W098/16247, W098/18810, W098/40100, W098/55495, W098/37919 и W098/52581), т.е. содержащие по меньшей мере один динуклеотид CG, при необязательном использовании 5-метилцитозина вместо цитозина; (9) полиоксиэтиленовый простой или сложный эфир, например W099/52549; (10) поверхностно-активное вещество, представляющее собой полиоксиэтиленовый сорбитановый сложный эфир в комбинации с октоксинолом (WO01/21207), или поверхностно-активное вещество, представляющее собой полиоксиэтиленовый алкиловый простой или сложный эфир в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным неионным поверхностно-активным веществом, таким как оксоксинол (WO01/21152); (11) сапонин и иммуностимуляторный олигонуклеотид (например, CpG-олигонуклеотид) (WO00/62800); (12) иммуностимулятор и частица соли металла, например WO00/23105; (13) сапонин и эмульсия масла в воде, например W099/11241; (14) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно, плюс стерол), например W098/57659; (15) детоксифицированные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого как холерный токсин (CT), коклюшный токсин (PT) и термолабильный токсин E. coli (LT), особенно LT-K63 (в котором лизин в положении 63 замещает аминокислоту, характерную для дикого типа), LT-R72 (в котором аргинин в положении 72 замещает аминокислоту, характерную для дикого типа), CT-S109 (в котором серин в положении 109 замещает аминокислоту, характерную для дикого типа) и PT-K9/G129 (в котором лизин в положении 9 замещает аминокислоту, характерную для дикого типа, и глицин замещен в положении 129) (см., например, International Publication Nos. W093/13202 и W092/19265); (16) другие вещества, действующие как иммуностимуляторные средства, усиливающие эффективность композиции. Предпочтительными являются квасцы (особенно фосфат и/или гидроксид алюминия) и MF59.

Мурамилпептиды включают в себя в качестве неограничивающих примеров N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE), и т.д.

Для дополнительных примеров адъювантов см. Vaccine Design, The Subunit and the Adjuvant Approach, Powell, M. F. and Newman, M. J, eds., Plenum Press, 1995.

Таким образом, необязательным дополнительным компонентом композиций согласно изобретению является адъювант, такой как соли алюминия или олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере один CpG-мотив. Применяемое здесь выражение «CpG-мотив» относится к динуклеотидной части олигонуклеотида, который включает в себя нуклеотид цитозин с последующим нуклеотидом гуанозином. Такие олигонуклеотиды также могут быть получены путем общепринятого олигонуклеотидного синтеза, хорошо известного специалисту в данной области. Предпочтительно, олигонуклеотиды согласно изобретению включают в себя модифицированный скелет, например, на основе фосфоротиокислоты или пептидной нуклеиновой кислоты, для обеспечения устойчивости олигонуклеотида к нуклеазам. Модифицированные скелеты хорошо известны специалистам в данной области. Предпочтительные пептидные нуклеиновые кислоты подробно описаны в патентах США № 5821060, 5789573, 5736392 и 5721102, патенте Японии № 10231290, Европейском патенте № 839828 и PCT Publication № WO 98/42735, WO 98/42876, WO 98/36098, WO 98/27105, WO 98/20162, WO 98/16550, WO 98/15648, WO 98/04571, WO 97/41150, WO 97/39024 и WO 97/38013, описания этих публикаций включены в данную заявку полностью в качестве ссылки.

Олигонуклеотид предпочтительно включает в себя примерно от 6 до 100 нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 8 до 50 нуклеотидов, наиболее предпочтительно примерно от 10 до 40 нуклеотидов. Кроме того, олигонуклеотиды согласно изобретению могут включать в себя замены групп сахаров и групп азотистых оснований. Предпочтительные олигонуклеотиды, например, описаны Krieg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998,95,12631-12636, Klinman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996,93,2879-2883, Weiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94,10833-10837, Chu et al., J. Exp. Med., 1997,186,1623-1631, Brazolot-Millan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 15553-15558, Ballas et al., J. Immunol., 1996,157,1840-1845, Cowdery et al., J. Immunol., 1996,156,4570-4575, Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78, Yamamoto et al., Jpn. J. Cancer Res., 1988,79,866-873, Stacey et al., J. Immunol., 1996,157,2116-2122, Messina et al., J. Immunol., 1991,147,1759-1764, Yi et al., J. Immunol., 1996,157,4918-4925, Yi et al., J. Immunol., 1996,157,5394-5402, Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761, Roman et al., Nat. Med., 1997,3,849-854, Davis et al., J. Immunol., 1998,160, 870-876, Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997,27,2340-2344, Moldoveanu et al., Vaccine, 1988,16,1216-1224, Yi et al., J. Immunol., 1998,160,5898-5906, в PCT Publication WO 96/02555, PCT Publication WO 98/16247, PCT Publication WO 98/18810, PCT Publication WO 98/40100, PCT Publication WO 98/55495, PCT Publication WO 98/37919 и PCT Publication WO 98/52581, описания этих публикаций включены в описание полностью в качестве ссылки. Также следует понимать, что олигонуклеотиды согласно изобретению могут включать в себя по меньшей мере один CpG-мотив, но могут содержать и множество CpG-мотивов.

Предпочтительные олигонуклеотиды включают в себя нуклеотидные последовательности, например, такие как tccatgacgttcctgacgtt (SEQ ID NO: 1), ataatcgacgttcaagcaag (SEQ ID NO: 2), ggggtcaacgttgagggggg (SEQ ID NO: 3), tctcccagcgtgcgccat (SEQ ID NO: 4), gagaacgctcgaccttcgat (SEQ ID NO: 5), tccatgtcgttcctgatgct (SEQ ID NO: 6), tccatgacgttcctgatgct (SEQ ID NO: 7), gctagacgttagcgt (SEQ ID NO: 8), atcgactctcgagcgttctc (SEQ ID NO: 9), gaaccttccatgctgttccg (SEQ ID NO: 10), gctagatgttagcgt (SEQ ID NO: 11), tcaacgtt (SEQ ID NO: 12), gcaacgtt (SEQ ID NO: 13), tcgacgtc (SEQ ID NO: 14), tcagcgct (SEQ ID NO: 15), tcaacgct (SEQ ID NO: 16), tcatcgat (SEQ ID NO: 17), tcttcgaa (SEQ ID NO: 18), tgactgtgaacgttcgagatga (SEQ ID NO: 19), tgactgtgaacgttagcgatga (SEQ ID NO: 20), tgactgtgaacgttagagcgga (SEQ ID NO: 21), gtttgcgcaacgttgttgccat (SEQ ID NO: 22), atggcaacaacgttgcgcaaac (SEQ ID NO: 23), cattggaaaacgttcttcgggg (SEQ ID NO: 24), ccccgaagaacgttttccaatg (SEQ ID NO: 25), attgacgtcaat (SEQ ID NO: 26), ctttccattgacgtcaatgggt (SEQ ID NO: 27), и tccatacgttcctgacgtt (SEQ ID NO: 28). В предпочтительных осуществлениях изобретения олигонуклеотид содержит CpG-мотив, фланкированный двумя пуринами с 5'-стороны мотива и двумя пиримидинами с 3'-стороны мотивы. Однако следует понимать, что согласно изобретению может использоваться любой олигонуклеотид, содержащий CpG-мотив, при условии, что данный олигонуклеотид в комбинации с описанными здесь композициями микрочастиц индуцирует повышение стимуляции Th1-лимфоцитов.

6. Антигены

Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, включающим в себя описанные выше микрочастицы с адсорбированными макромолекулами, предпочтительно с векторными конструкциями, кодирующими антигены и/или отдельный антиген. Как правило, антиген стимулирует пролиферацию Т-лимфоцитов, предпочтительно Th1-лимфоцитов, посредством рецепторов для антигена и может взаимодействовать с лимфоцитами, инициируя набор реакций, который обозначается как клеточно-опосредованный иммунитет. Так, антиген может индуцировать ответ CTL и/или гуморальный ответ и может индуцировать продукцию цитокинов.

Эпитоп лежит в объеме данного определения антигена. Эпитоп представляет собой часть антигенной молекулы или антигенного комплекса, которая определяет иммунологическую специфичность. Обычно эпитоп является пептидом или полисахаридом в присутствующих в природе антигенах. В искусственных антигенах он может являться веществом низкой молекулярной массы, таким как производное арсаниловой кислоты. Эпитоп специфично взаимодействует in vivo или in vitro с гомологичными антителами или T-лимфоцитами. Альтернативными идентификаторами являются антигенные детерминанты, антигенные структурные группы и гаптенные группы.

В предпочтительных осуществлениях данного изобретения антигенное вещество происходит из вируса, такого, например, как вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус простого герпеса (HSV), цитомегаловирус (CMV), вирус гриппа (грипп) и вирус бешенства. Предпочтительно, антигенное вещество выбрано из группы, включающей в себя гликопротеин gD из HSV, гликопротеин gp120 из HIV, p55 gag из HIV и полипептиды из регионов pol и tat HIV. В других предпочтительных осуществлениях изобретения антигенное вещество происходит из бактерии, такой как, например, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, возбудители холеры, дифтерии, столбняка, Neisseria meningitidis, возбудитель коклюша. В других предпочтительных осуществлений изобретения антигенное вещество происходит из паразита, например, такого как малярийный паразит. В другом предпочтительном осуществлении настоящего изобретения антиген адсорбирован на поверхности микрочастицы согласно изобретению.

Антигены могут продуцироваться способами, известными в данной области, или могут быть заказаны из коммерческих источников. Антигены в объеме данного изобретения включают в себя целые инактивированные вирусные частицы, выделенные вирусные белки и субъединицы белков, целые клетки и бактерии, клеточные мембраны и белки клеточной стенки, и тому подобное. Ниже описаны некоторые предпочтительные антигены.

rgD2 вируса простого герпеса (HSV) представляет собой рекомбинантный белок, продуцируемый в полученных посредством генной инженерии клетках яичника китайского хомячка. В данном белке укорочен нормальный якорный регион, что приводит к секреции гликозилированного белка в тканевую культуральную среду. gD2 может очищаться в среде CHO до чистоты, составляющей более чем 90%. env-2-3 вируса иммунодефицита человека (HIV) представляет собой рекомбинантную форму оболочечного белка HIV, продуцированную в полученных посредством генной инженерии Saccharomyces cerevisae. Данный белок представляет собой целый белковый регион gp120 из HIV, но не гликозилирован и денатурирован при очистке из дрожжей. gp120 из HIV представляет собой полностью гликозилированную секретируемую форму gp120, продуцируемого в клетках CHO способом, сходным с описанным выше для gD2. Дополнительные антигены HSV, подходящие для применения в иммуногенных композициях, описаны в PCT Publications WO 85/04587 и WO 88/02634, описания этих публикаций включены в данную заявку полностью в качестве ссылки. Особенно предпочтительными являются смеси антигенов gB и gD, которые представляют собой укороченные поверхностные белки, лишенные якорных регионов.

Дополнительные антигены HIV, применения в иммуногенных композициях, описаны в заявке на выдачу патента США № 490858, поданной 9 марта 1990 г., и в опубликованной заявке на выдачу Европейского патента № 181150 (14 мая 1986 г.), а также в заявках на выдачу патента США № 60/168471; 09/475515; 09/475504 и 09/610313, описания этих публикаций включены полностью в качестве ссылки.

Антигены цитомегаловируса, подходящие для применения в иммуногенных композициях, описаны в патенте США № 4689225, заявке на выдачу патента США № 367363, поданной 16 июня 1989 г и PCT Publication WO 89/07143, описания этих публикаций включены полностью в качестве ссылки.

Антигены вируса гепатита C, подходящие для применения в иммуногенных композициях, описаны в PCT/US88/04125, в опубликованной заявке на выдачу Европейского патента № 318216 (31 мая 1989), опубликованной заявке на выдачу патента Японии 1-500565, выданной 18 ноября 1988 г., в заявке на выдачу патента Канады 583561 и EPO 388232, описания этих публикаций включены в данную заявку полностью в качестве ссылки. Другой набор антигенов HCV описан в заявке на выдачу Европейского патента 90/302866.0, поданной 16 марта 1990 г., и в заявке на выдачу патента США № 456637, поданной 21 декабря 1989 г., и в PCT/US90/01348, описания этих публикаций включены полностью в качестве ссылки.

Иммуногенные композиции согласно изобретению могут использоваться для иммунизации птиц и млекопитающих от заболеваний и инфекции, включая без ограничений холеру, дифтерию, столбняк, коклюш, грипп, корь, менингит, свинку, чуму, полиомиелит, бешенство, пятнистую лихорадку Скалистых гор, краснуху, оспу, брюшной тиф, сыпной тиф, вирус кошачьего лейкоза и желтую лихорадку.

Некоторые иммуногенные композиции согласно изобретению могут включать в себя эффективное количество антигена. Например, они могут содержать количество антигена, которое, в комбинации с адъювантом, будет стимулировать продукцию у субъекта специфичного и достаточного иммунного ответа, так что субъект будет наделяться защитой от последующего воздействия вируса, бактерии, гриба, микоплазмы или паразита.

В других осуществлениях композиция, включающая в себя антиген, используется для поддержки иммунного ответа на предварительно введенную векторную конструкцию, которая предпочтительно включает в себя гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую данный антиген. Более предпочтительно, антиген ассоциирован с описанными здесь микрочастицами (например, адсорбирован на них) и/или антиген вводится совместно с адъювантом.

Назначение однократной дозы для манипуляций с любым и каждым антигеном, которые могут использоваться согласно изобретению, исключено. Эффективное количество антигена является функцией присущей ему активности и чистоты и определяется рядовым специалистом в данной области эмпирически, путем рутинного экспериментирования. Предполагается, что композиции адъюванта согласно изобретению могут использоваться совместно с иммуногенными композициями целых клеток и вирусов, а также с очищенными антигенами, или субъединицами белков, или пептидными иммуногенными композициями, полученными способами рекомбинантной ДНК или синтетически.

В случае предоставления антигена вместе с эмульсией по причине стабильности композиции адъюванта согласно изобретению антиген и эмульсия могут обычно смешиваться путем простого встряхивания. Подходящие иммуногенные композиции легко получаются при помощи других способов, таких как быстрое пропускание смеси адъюванта и раствора или суспензии антигена через малое отверстие (такое, как игла для подкожного введения).

Иммуногенные композиции согласно изобретению включают в себя примерно от 1 нанограмма до 1000 микрограмм нуклеиновой кислоты, предпочтительно ДНК, например, такой как CpG-олигонуклеотиды. В некоторых предпочтительных осуществлениях иммуногенные композиции содержат примерно от 10 нанограммов до 800 микрограммов нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных осуществлениях иммуногенные композиции содержат примерно от 0,1 до 500 микрограммов нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных осуществлениях иммуногенные композиции содержат примерно от 1 микрограмма до 10 миллиграммов нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных осуществлениях иммуногенные композиции содержат примерно от 250 микрограммов до 1 миллиграмма нуклеиновой кислоты. В некоторых предпочтительных осуществлениях иммуногенные композиции содержат примерно от 500 микрограммов до 1 миллиграмма нуклеиновой кислоты. Специалист в данной области может легко составить иммуногенную композицию, содержащую любое требуемое количество нуклеиновой кислоты. Иммуногенные композиции согласно изобретению предоставляются в стерильном виде и в отсутствие воспламеняющихся веществ. Данные иммуногенные композиции могут обычным образом вводиться в виде дозированных единиц и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики, например, описанных в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980), описание которой включено полностью в качестве ссылки.

Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции у животного-хозяина иммунного ответа, включающим в себя введение животному одной или нескольких описанных выше иммуногенных композиций в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Животное-хозяин предпочтительно является млекопитающим, более предпочтительно человеком. Предпочтительные пути введения включают в себя в качестве неограничивающих примеров внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутриглазной и пероральный пути, а также трансдермально или путем ингаляции или суппозитория. Наиболее предпочтительные пути введения включают внутримышечную, внутрибрюшинную, внутрикожную и подкожную инъекцию.

По некоторым осуществлениям настоящего изобретения иммуногенные композиции вводят животному-хозяину с использованием устройств для безыгольной инъекции, которые хорошо известны и общедоступны. Обычный специалист в данной области, следуя приведенным здесь указаниям, может применять устройства для безыгольной инъекции для доставки иммуногенных композиций к клеткам или субъектам. Кроме того, осуществления изобретения могут быть доставлены совместно с применением электропорации.

Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации животного-хозяина против вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции, включающим введение животному одной или нескольких описанных выше иммуногенных композиций в количестве, эффективном для индукции протективного ответа. Животное-хозяин, предпочтительно, является млекопитающим, более предпочтительно человеком. Предпочтительными путями введения являются описанные выше. Хотя профилактическое или терапевтическое лечение животного-хозяина может быть направлено на любой патогенный микроорганизм, предпочтительные патогенные микроорганизмы, включая в качестве неограничивающих примеров вирусные, бактериальные и паразитарные патогенные микроорганизмы, описаны выше.

Настоящее изобретение также относится к способам индукции у животного-хозяина иммунного ответа, включающим в себя введение животному одной или нескольких описанных выше иммуногенных композиций в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. Животное-хозяин предпочтительно является млекопитающим, более предпочтительно человеком. Предпочтительными путями введения являются описанные выше. Специалисту в данной области хорошо известны виды иммунного ответа и способы их измерения.

Настоящее изобретение относится к применению полимерных микрочастиц или субмикронных эмульсионных микрочастиц с адсорбированными макромолекулами для индукции ими иммунного ответа отдельно или в комбинации с другими макромолекулами. Это означает, что данное изобретение относится к микрочастицам с адсорбированной нуклеиновой кислотой, субмикронным эмульсиям с адсорбированной нуклеиновой кислотой или иммуностимулирующей молекулой и к комбинации микрочастиц с адсорбированной нуклеиновой кислотой вместе с субмикронными эмульсиями с адсорбированной нуклеиновой кислотой или иммуностимулирующей молекулой. Для улучшения доставки нуклеиновой кислоты можно применять электропорацию.

Как демонстрируется в следующих примерах, полимерные микрочастицы с адсорбированными макромолекулами согласно изобретению вызывают мощный иммунный ответ. Кроме того, субмикронные эмульсионные микрочастицы согласно изобретению также вызывают мощный иммунный ответ. Следовательно, комбинация микрочастиц согласно изобретению с адсорбированными макромолекулами является мощным средством для индукции иммунного ответа.

Все цитируемые здесь ссылки включены в данное описание полностью в качестве ссылки.

C. Экспериментальная часть

Ниже представлены примеры конкретных осуществлений для выполнения настоящего изобретения. Примеры предложены только для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области известны модификации, соответствующие сути настоящего изобретения и лежащие в его объеме.

Чтобы гарантировать точность в отношении используемых значений (например, количества, температуры и т.п.) были затрачены большие усилия, но все же нужно сделать поправку на некоторые экспериментальные ошибки и отклонения.

Пример 1

Получение полимерных микрочастиц с адсорбированной нуклеиновой кислотой

Микрочастицы PLG-CTAB получали с применением модифицированного процесса испарения. Вкратце, микрочастицы получали посредством эмульгирования 10 мл 5%-ного масс./об. раствора полимера в метиленхлориде с 1 мл буфера TE при высокой скорости с применением гомогенизатора IKA. Затем первичную эмульсию добавляли в 50 мл дистиллированной воды, содержащей бромид цетилтриметиламмония (CTAB) (0,5% масс./об.). Это приводило к формированию эмульсии вода-масло-вода, которую перемешивали при 6000 об./мин 12 часов при комнатной температуре, позволяющей испариться метиленхлориду. Полученные в результате микрочастицы дважды промывали дистиллированной водой посредством центрифугирования при 10000g и высушиванием посредством сушки вымораживанием.

Для обычной порции адсорбирующих ДНК микрочастиц массой 100 мг в стеклянный сосуд добавляли 100 мг катионных микрочастиц PLG-CTAB и ресуспендировали в 5 мл 200 мкг/мл растворе ДНК (например, плазмиды pCMV или pSINP, содержащей gp140 или p55gag) в буфере TE. Суспензию перемешивали на устройстве типа "Вортекс" одну минуту для равномерного диспергирования микрочастиц в растворе ДНК. Сосуд выдерживали в течение ночи на шейкере (медленная скорость) при 4°C для адсорбции. На следующий день микрочастицы центрифугировали 10 минут при 8000 об./мин на центрифуге Beckman, после чего собирался супернатант для количественного анализа ДНК. Осадок однократно промывали в 1X TE-буфере посредством ресуспендирования, перемешивали с помощью шпателя и центрифугировали 10 мин при 8000 об./мин. Конечный осадок ресуспендировали в минимальном количестве деионизированной воды (примерно 2 мл) путем перемешивания посредством шпателя и высушивали вымораживанием 24 часа на лиофильной сушке с рабочей поверхностью (Labconco).

Супернатант анализировали на предмет содержания ДНК посредством измерения поглощения при 260 нм. Количество ДНК, абсорбированной на микрочастицах, подсчитывали посредством вычитания количества ДНК в супернатанте из общего количества добавленной ДНК (1 мг на 10 мг частиц). Общую загрузку оценивали посредством растворения 5 мг конечной композиции в растворе 0,5 М NaOH/1% SDS и измерения поглощения чистого раствора после гидролиза при 260 нм.

Пример 2

Получение субмикронных эмульсионных микрочастиц с адсорбированной нуклеиновой кислотой

Субмикронные эмульсии, образованные из MF59 и DOTAP, получали посредством помещения DOTAP (в хлороформе) в химический стакан, позволяя ему испариться до 200 мкл. Для получения гомогенной основы для конечной эмульсии добавляли Tween (0,5% масс./масс.), сквален (5% масс./масс.) и Span (0,5% масс./масс.) и гомогенизировали 10 мм пробы при 10К об./мин 1 минуту в гомогенизаторе Omni. Эту основу 5 раз пропускали через гомогенизатор Microfludizer M110S (Microfluidics Co., Newton, MA) при давлении ˜800 фунтов на квадратный дюйм. Электрокинетический потенциал эмульсии, являющийся мерой суммарного поверхностного заряда, измеряли на измерителе DELSA 440 SX Zetasizer фирмы Coulter, и нашли его равным примерно +55 мВ.

ДНК (или 1 мг ДНК gp140 HIV-1 или 0,5 мг ДНК p55 gag, присутствующей в pCMV или pSINCP) адсорбировали на субмикронной эмульсии посредством инкубации в течение ночи при 4°С.

Пример 3

Получение векторов ELVIS и других векторных конструкций для адсорбции на микрочастицах

Как типичный пример, проводилось конструирование основанных на альфавирусах векторов ELVIS и векторов-репликонов с применением вируса Синдбис. Понятно, что нижеследующее может быть легко применимо специалистом в данной области к производным векторов на основе любого альфавируса. Примерно 10⁷ клеток BHK-21 инфицировали штаммом SINDCchiron вируса Синдбис (депозит ATCC VR-2643, 13 апреля 1999) при множественности заражения 1 PFU/клетка. Через 24 часа после инфекции, после развития цитопатического эффекта, тотальную РНК выделили из клеток с применением реагента TRIzol (GIBCO/BRL) соответственно инструкциям производителя. После очистки вирусную РНК растворили в очищенной от нуклеаз воде, разделили на аликвоты и хранили при -80°C для последующего использования при клонировании кДНК.

Синтез кДНК выполняли амплификацией посредством ПЦР с применением набора праймеров, показанных ниже (для каждого праймера указана нумерация нуклеотидов в Синдбис):

Пары праймеров 1-5 применяли для клонирования генов структурных вирусных белков, тогда как пары 6-14 - для генов неструктурных вирусных белков. Олигонуклеотиды в парах 1-5 содержали дополнительные последовательности, представляющие участки узнавания рестрикционными ферментами EcoRI и HindIII и не представленные в субгеномной РНК вируса Синдбис. Олигонуклеотиды 6-14 содержали участки для SacI и XhoI, не представленные в полном геноме ранее секвенированных штаммов вируса Синдбис (эти участки подчеркнуты).

Каждую реакцию обратной транскрипции (RT) проводили в объеме 50 мкл, применяя фермент SuperscriptII (GIBCO/BRL), соответственно инструкциям производителя. Реакционные смеси, содержащие количества РНК, эквивалентные 10⁶ клеткам и 50 пмоль каждого праймера, показаны ниже.

Смесь 1: праймеры 1, 3 и 5

Смесь 2: праймеры 2 и 4

Смесь 3: праймеры 6, 9 и 12

Смесь 4: праймеры 8, 11 и 14

Реакционные смеси после RT замораживали и впоследствии использовали для амплификации посредством ПЦР. Реакции ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Vent (NEB) по рекомендациям производителя. Каждые 50 мкл пробы ПЦР содержали 3 мкл RT-смеси, описанной выше и 50 пмоль праймеров. Всего проводили 14 реакций (Таблица 1).

Таблица 1№ фрагментаПраймеры№ реакции RTдлина фрагмента (пн.)11 и 1,11112822 и 2,1280033 и 3,1178944 и 4,1264455 и 5,1167066 и 6,1396277 и 7,1366688 и 8,14110799 и 9,136381010 и 10,139121111 и 11,147431212 и 12,138701213 и 13,1310341414 и 14,141088

Реакции ПЦР для фрагментов 1-5 проводили в следующих условиях: 12 циклов, состоящих из 30 секунд при 95°C, 30 секунд при 56°C и 90 секунд при 74°C. Для фрагментов 6-14 число циклов увеличивали с 12 до 15. Небольшие аликвоты каждой реакционной смеси проанализировали с помощью электрофореза в агарозном геле для подтверждения присутствия фрагментов ожидаемой длины. С применением фенол-хлороформа из остальной смеси проводили экстракцию фрагментов ДНК, которые очищали с помощью этанола.

Для клонирования фрагменты 1-5 расщепляли посредством HindIII и EcoRI и затем лигировали в плазмиду pRS2 (pUC19 с дополнительным участком рестрикции в полилинкере), обработанной теми же ферментами. Фрагменты 6-14 расщепляли посредством SacI и XhoI и лигировали в ту же плазмиду pRS2, обработанную SacI и XhoI. Все рекомбинантные плазмиды трансформировали в штамм E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, Калифорния).

В дополнение, также получали клоны кДНК, представляющие субгеномный промоторный регион и 3'-нетранслируемую область с применением следующих пар праймеров:

Позитивные клоны для каждой трансформации наращивали с применением набора QIAGEN согласно инструкциям производителя для очищения плазмиды. Фрагменты, обозначенные как p1-p14 соответственно, затем собирали в подходящие векторные конфигурации.

Конструирование системы инициации эукариотического многоуровневого вектора (ELVIS) и альфавирусной векторной конструкции для транскрипции репликона РНК-вектора in vitro осуществляли с применением клонов p1-p14 и фрагментов субгеномных и 3'-концевых областей вируса Синдбис, как изложено ниже. Фрагмент ApaI-MscI, содержащий промотор для РНК-полимеразы SP6 и старт геномной РНК вируса Синдбис, лигировали с фрагментом MscI-XhoI фрагмента 14, клонированного в плазмиде pRS2, расщепленной посредством ApaI-XhoI. Полученную плазмиду обозначили как p15. Далее, фрагмент SacI-EcoRI фрагмента p8, фрагмент EcoRI-NsiI фрагмента p7 и фрагмент NsiI-XhoI фрагмента p6 лигировали в плазмиду pRS2, расщепленную посредством SacI-XhoI. Полученную плазмиду обозначили как p16. Далее, фрагмент SacI-MunI фрагмента p12, фрагмент MunI-NheI фрагмента p11 и фрагмент NheI-XhoI фрагмента p10 лигировали в плазмиду pRS2, расщепленную посредством SacI-XhoI. Полученную плазмиду обозначили как p17. Фрагмент ApaI-ApaLI фрагмента p15 и фрагмент ApaLI-XhoI фрагмента pl3 затем лигировали в плазмиду pRS2, расщепленную посредством ApaI-XhoI, с получением в результате плазмиды, обозначенной как p18. Далее, фрагмент ApaI-NsiI фрагмента p18 и фрагмент NsiI-XhoI фрагмента pl7 вместе лигировали в плазмиду pRS2, расщепленную посредством ApaI-XhoI. Полученную плазмиду обозначили как p19. В заключение, фрагмент ApaI-AvrII фрагмента pl9, фрагмент AvrII-SalGI фрагмента p9 и фрагмент SaIGI-BamHI фрагмента pl6 вместе лигировали в заранее сконструированный и экспрессирующий GFP-репортер репликон вектора на основе Синдбис (см. Dubensky et al., J. Virol. 70: 508-519, 1996; Polo et al., 1999, там же и патент США 5843723), который расщепляли посредством ApaI-BamHI для удаления существующих генов неструктурных белков. Полученную в результате векторную конструкцию на основе Синдбис, содержащую происходящие из SINDCchiron последовательности и кодирующую также GFP-репортер, обозначили как SINCR-GFP (также известную как DCSP6SINgfp). Получение репликонов РНК данной конструкции-репортера, а также векторных конструкций на основе Синдбис, экспрессирующих другие гетерологичные последовательности (например, антигены, описанные в данном описании ниже), проводили посредством линеаризации ДНК с применением PmeI и последующей транскрипцией in vitro с применением полимеразы бактериофага SP6 как описано ранее (Polo et al., там же, Dubensky et al., там же.).

Подобным образом вышеупомянутые последовательности вируса Синдбис (см. патенты США 5814482 и 6015686) применяли для сборки в основанной на альфавирусе системе инициации многоуровневого эукариотического вектора, в которой транскрипция самоамплифицирующейся векторной РНК происходит с эукариотического промотора (например, с промотора РНК-полимеразы II) непосредственно в эукариотических клетках, трансфицированных ДНК плазмиды ELVIS. ДНК-плазмиду ELVIS, которая также экспрессирует GFP-репортер, сконструировали с помощью замены происходящих от вируса Синдбис последовательностей в данном векторе ELVIS на соответствующую последовательность SINGR-GFP, описанную выше. Начиная с описанного ранее вектора ELVIS pSIN1.5 (Hariharan et al., J Virol. 72: 950-958, 1998), для получения промежуточной конструкции, известной как ELVIS1.5CB, остов плазмиды модифицировали посредством его замены на таковой из pCMVLink (zur Megede et al., J. Virol. 74: 2628-2635, 2000), используя два участка SacI, найденные в каждой плазмиде. Далее, из ELVIS1.5CB удаляли один из двух участков SacI (расположенный рядом с 3'-концом SIN) путем частичного расщепления посредством SacI, создания тупых концов посредством ДНК-полимеразы T4 и лигирования в модифицированный участок линкерной последовательности PmeI 5'-GTTTAAAC-3'. Скорректированную плазмиду без целевого участка SacI обозначили как ELVIS1.5CВd1Sac. Данную промежуточную плазмиду затем подготовили для вставки новых генов неструктурных белков SIN посредством расщепления SacI и XhoI. Соответствующие неструктурные гены получали амплификацией посредством ПЦР участка SINCR-GFP с использованием олигонуклеотидных праймеров 5'CCTATGAGCTCGTTTAGTGAACCGTATTGACGGCGTAGTACACAC (SEQ ID NO: 61) и 5'CCTATCTCGAGGGTGGTGTTGTAGTATTAGTC (SEQ ID NO: 62), последующего расщепления посредством SacI и XhoI и встраивания, с получением промежуточной конструкции SINCP-Not. На конечном этапе один из двух участков NotI, присутствующих в конструкции, элиминировали посредством частичного расщепления и достраивания фрагментом Кленова для того, чтобы оставить в полилинкере только один участок NotI. Вновь сконструированный вектор ELVIS обозначили как SINCP (или pSINCP).

Инсерции гетерологичных последовательностей (например, кодирующих антигены генов) в альфавирусные векторы SINCR или SINCP производились преимущественно путем расщепления посредством XhoI/NotI или XhoI/XbaI, с последующим лигированием требуемого фрагмента ДНК, также с XhoI/NotI- или XhoI/XbaI-концами. Альтернативно, для того, чтобы сделать возможным большее число инсерций, эти участки можно превратить в тупые концы, а также использовать другие участки полилинекра (или заменять другие гетерологичные последовательности). Например, в данные векторы вставляют гены, кодирующие в HIV-1 p55gag (штамм SF2) и gpl40 env (штамм SF162). Более точно, кодон-оптимизированную последовательность p55gagmod HIV (см. принадлежащую заявителю заявку на выдачу патента США 09/475515; zur Megede et al., там же) вставляли с помощью расщепления векторов посредством XhoI/XbaI и лигирования в фрагмент p55gagmod, полученный с помощью расщепления посредством SalI/XbaI. Полученный вектор обозначили как SINCR-p55gag или SINCP-p55gag. Подобным образом кодон-оптимизированные последовательности gpl40 HIV (описанные в примере 10 и у Barnett et al., 2001. J. Virol. 75: 5526-40) вставили в обе плазмиды: SINCR и SINCP для получения конструкций SINCR-gpl40 и SINCP-gpl40. Препарат ДНК-плазмиды ELVIS (pSINCR) и репликонов РНК-векторов, транскрибирующихся in vitro с плазмид SINCR, получали как описано в других примерах.

Пример 4

Иммунизация макак резус антигеном из плазмид pCMV или pSINCP с применением микрочастиц или субмикронных эмульсий

PLG-полимерные микрочастицы и субмикронные эмульсии M59 получали, как описано выше в примерах 1 или 2. Микрочастицы и субмикронные эмульсии получали с целью анализа различных эффектов при иммунизации макак-резус конструкцией плазмидного вектора, pCMV-gp140 или pCMV-p55gag (см. принадлежащую заявителю заявку на выдачу патента США 09/475515) на микрочастицах или в субмикронной эмульсии, а также сравнения эффекта применения плазмиды ELVIS, pSINCP-gp140 или pSINCP-p55gag, сконструированных как описано выше. Иммунизировали шесть групп животных следующими различными препаратами:

Для группы 1 применяли pCMV-gp140 и pCMV-p55gag без микрочастиц или субмикронных эмульсий.

Для группы 2 применяли pCMV-gp140 и pCMV-p55gag, адсорбированные на микрочастицах PLG/CTAB.

Для группы 3 применяли pCMV-gp140 и pCMV-p55gag, адсорбированные на субмикронной эмульсии MF59-DOTAP.

Для группы 4 применяли pSINCP-gp140 и pSINCP-p55gag без микрочастиц или субмикронных эмульсий.

Для группы 5 применяли pSINCP-gp140 и pSINCP-p55gag, адсорбированные на микрочастицах PLG/CTAB.

Для 6 группы, контрольной, не применяли ни антигенов, ни микрочастиц, ни субмикронных эмульсий.

В каждой группе животных 5 макак-резус (только 4 в группе 6) иммунизировали достаточным количеством материала, так что дозировка вектора с ДНК gp140 составляла 1,0 мг каждому животному, а дозировка вектора с ДНК p55gag составляла 0,5 мг каждому, исключая контроль, где ничего не вводили. Животных иммунизировали второй раз спустя четыре недели после первой иммунизации и третий раз спустя 14 недель после (wp) первой иммунизации. На 2 (2wp1), 6 (2wp2), 11-12 (7wp2) и 16 (2wp3) неделях анализировали сыворотку. Применяли процедуру иммунизации IM TA. После иммунизаций измерили титры анти-p55gag и анти-gp140 IgG в плазме и результаты этих измерений показаны в таблицах 2 и 3 как среднее геометрическое титров.

Таблица 2
Титр сывороточного анти-p55gag IgG (среднее геометрическое)ГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31PCMV в солевом растворе719191182PCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB49010770436016373PCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP1425702148035364pSINCP в солевом растворе878455pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB7281925634268566Отсутствует12987Таблица 3
Титр сывороточного анти-gp140 IgG (среднее геометрическое)ГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31pCMV в солевом растворе55178124602pCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB52762529019133pCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP556411248234pSINCP в солевом растворе84820705pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB1511289426610026Никакая12141111

Те же группы животных, какие сформировали для предшествующих животных, анализировали на предмет индукции ответа CTL. Отношения эффектора к цели (E:T) находились в диапазоне примерно от 4:1 до 100:1. Результаты анализа CTL показаны ниже в таблицах 4 и 5. "Отвечающей" является макака-резус, характеризовавшаяся специфичным лизисом мишени в 10% или более % случаев при двух или более последовательных отношениях E:T.

Таблица 4
Число отвечающих (p55gag)ГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31pCMV в солевом растворе04142pCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB33233pCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP01104pSINCP в солевом растворе01005pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB03116Никакая0000Таблица 5
Число отвечающих (gp140)ГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31PCMV в солевом растворе00002pCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB00003pCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP00004pSINCP, в солевом растворе00015pSINCP адсорбированная на частицах PLG/CTAB01016Никакая0000

Тех же животных анализировали на предмет пролиферации лимфоцитов. При помощи данного анализа измеряют специфическую пролиферацию Т-клеток in vitro в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) макаки-резус очищали из цельной гепаринизированной крови посредством центрифугирования в градиентах фиколл-гипака. PBMC культивировали в количестве 2x10⁵ на лунку в плоскодонных планшетах для микротитрования в присутствии 3 микрограмм/мл очищенного рекомбинантного белка p55gag или в его отсутствие. Инициировали шесть параллельных культур для каждого состояния. После 4 суток в культуре добавляли тимидин с тритием (³[H]TdR) (1 микрокюри на лунку). Культуры инкубировали в течение ночи и собирали на следующий день. Клетки размещали на микростекловолоконные фильтры. Фильтры подвергли воздействию сцинтиллирующей жидкости и проводили подсчет в жидкостном сцинтилляционном счетчике. Для каждого состояния для 6 параллелей рассчитали включение ³[H]TdR, измеряемое как среднее счетов в минуту (cpm). Результаты показаны в Таблице 6. Средний геометрический индекс стимуляции (GMSI) подсчитан как счеты в минуту (cpm) стимулированных p55gag клеток разделенное на cpm нестимулированных клеток и, таким образом, чем больше был GMSI, тем более позитивным был результат.

Таблица 6
GMSIГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31PCMV в солевом растворе2,65,13,03,22pCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB6,615,45,94,63pCMV, адсорбированная на
эмульсии MF59/DOTAP9,129,513,610,54pSINCP в солевом растворе7,56,64,14,35pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB10,413,85,44,46Никакая1,41,51,31,2

Тех же животных анализировали на предмет внутриклеточной продукции цитокинов. При помощи данного анализа измеряют специфическую продукцию цитокинов Т-клетками in vitro в ответ на короткую повторную стимуляцию антигеном. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) макаки-резус очищали из цельной гепаринизированной крови посредством центрифугирования в градиентах Ficoll-Hypaque. Аликвоты 1x10⁶ PBMC в присутствии костимуляторного анти-CD28 моноклонального антитела стимулировали совокупностью синтетических перекрывающихся пептидов, охватывающих последовательность белка gag (или env). Для обеспечения возможности аккумуляции вновь синтезированных в клетках цитокинов добавили брефелдин А. После инкубации в течение ночи PBMC окрашивали коммерчески доступными, флуоресцентно меченными моноклональными антителами для установления присутствия внутриклеточного интерферона γ (IFN-γ), фактора некроза опухоли α (TNF-α) и клеточных поверхностных маркеров CD4 и CD8. Окрашенные клеточные образцы анализировали на проточном цитометре с получением данных для приблизительно 50000-100000 PBMC. Частоту клеток, продуцирующих цитокины, определяли для каждого образца, применяя коммерчески доступное программное обеспечение. Результаты для gp140 и p55gag показаны в таблицах 7 и 8, соответственно. Таблицы показывают число отвечающих животных, где отвечающих определяли как животных, с более чем 100 CD4 клеток на 100000 экспрессирующих TNF-α и IFN-γ, измеренных внутриклеточным окрашиванием.

Таблица 7
Особи, отвечающие цитокинами на gp140ГруппаФорма ДНК2wp17wp22wp31PCMV в солевом растворе1002PCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB1203PCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP0004pSINCP в солевом растворе0005pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB0106Никакая000Таблица 8
Особи, отвечающие цитокинами на p55gagГруппаФорма ДНК2wp17wp22wp31PCMV в солевом растворе0002PCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB2103PCMV, адсорбированная на эмульсии MF59/DOTAP0004pSINCP в солевом растворе0005pSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB1106Отсутствует000

Пример 5

Векторные РНК-конструкции

Векторные РНК-конструкции (например, репликоны) можно адсорбировать на микрочастицах для доставки гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты в клетки животных. Векторная РНК-конструкция обычно содержит вирусную РНК, с областью геномной РНК (например, ген структурного белка), замещенной выбранной гетерологичной последовательностью, полученной из кодирующей ген интересующего продукта последовательности ДНК. Типичные образцы векторных РНК-конструкций включают в себя в качестве неограничивающих примеров альфавирусные РНК-векторы (см., например, патент США 5843723, PCT publication WO 99/18226 и Polo et al., 1999, PNAS 96:4598-4603), пикорнавирусные РНК-векторы (см., например, патент США 6156538 и Vignuzzi et al., 2001, J Gen Virol. 82:1737-47), флавивирусные РНК-векторы (см., например, Varnavski et al. 1999, Virology 255:366-75) и рубивирусные РНК-векторы (Pugachev et al., 2000, J Virol. 74:10811-5). Векторные РНК-конструкции для применения в настоящем изобретении вообще можно получить из плазмидных кДНК-конструкций как источника исходного материала посредством стандартных процессов транскрипции in vitro (см. ссылки выше). Так же, как и плазмидную ДНК, данные РНК-векторные конструкции затем можно адсорбировать на микрочастицах согласно изобретению, как описано здесь в примерах. Например, векторные РНК-конструкции адсорбируют на микрочастицах посредством инкубации 100 мг катионных микрочастиц в 1 мг/мл растворе ДНК 6 часов при 4°С. Затем микрочастицы разделяют посредством центрифугирования, осадок промывают буфером ТЕ и микрочастицы высушивают вымораживанием. Получение и доставка составленных с PLG векторных РНК-конструкций подобна таковой, описанной для ДНК, с применением для доставки, например, как минимум 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг или 1000 мкг составленной РНК-векторной конструкции.

Пример 6

Адъюванты у мышей

Для анализа действия адъюванта фосфата алюминия (квасцы) у мышей провели эксперимент на этих животных. Полимерные микрочастицы получали, как описано выше, с pCMV-p55gag, адсорбированной на них или без нее. 10 микрограмм ДНК, или свободной или адсорбированной на PLG-микрочастицах, вводили группам из 6 мышей CB6 F1 на 0 и 6 неделях с квасцами или без них. Результаты, как геометрическое среднее титров антител, показаны в таблице 9.

Таблица 9
Титр сывороточного IgG для анти-p55gag (геометрическое среднее/стандартная ошибка)ГруппаФорма ДНК2wp12wp27wp22wp31pCMV в солевом растворе28149623852742pCMV, адсорбированная на частицах PLG5022219923468561713013pCMV в солевом растворе плюс квасцы1536303919507092438

Пример 7

Электропорация микрочастицами, векторами ELVIS и РНК-векторными конструкциями

В комбинации с полимерными микрочастицами или микрочастицами субмикронных эмульсий, полученными вместе с любой из нуклеиновых кислот, описанных выше, такой как плазмидная ДНК, векторы ELVIS и конструкции РНК-векторов, можно применять электропорацию.

Пример 8

Индукция иммунного ответа у макак-резус первичной и поддерживающей иммунизациями

Для определения действия примирования посредством ДНК и поддержания белком, адсорбированным на PLG-микрочастицах, провели эксперимент. Более подробно, микрочастицы PLG-SDS получали, как описано выше и в принадлежащей данному заявителю заявке на выдачу International Patent PCT/US99/17308, и на них адсорбировали очищенный рекомбинантный белок p55gag. Группу животных иммунизировали посредством 1 мг pCMV-p55gag. Животных снова иммунизировали через 4 и затем через 8 недель. Животных в течение 41 недели поддерживали адсорбированным на PLG-микрочастицах белком p55gag. Результаты показаны в таблице 10, которая показывает титр антител у отвечающих особей, индукцию пролиферации хелперных Т-клеток (средний индекс стимуляции отвечающих особей) и индукцию CTL (число отвечающих особей, основанное на более чем 10% лизисе при двух или более последовательных отношениях E:T). Результаты для первых колонок измеряли на 14 неделе после 3 примирования и для вторых колонок на 2 неделе после поддержания. Число в скобках означает количество отвечающих особей при общем количестве 4 животных.

Таблица 10ВакцинаТитр антителПролиферация лимфоцитов (SI)CTLначалоподдержаниеначалоподдержаниеначалоподдержаниеначалоподдержаниеpCMV-p55gagPLG/
p55gag44 (1)1777(4)2,5 (2)21,8 (4)44

Пример 9

Индукция нейтрализующих антител

Сыворотку макак-резус из примера 5 выше тестировали на ингибирование двух различных штаммов HIV-1 (SF2 и SF162) с применением маточных растворов вируса, растущего на PBMC, и анализа, основанного на линии Т-клеток CCR5+/CXCR4+/CD4+. Использовалась сыворотка в разведении 1:20. Для каждого животного ингибиторную активность сыворотки до иммунизации вычитали из результатов. Результаты для каждого из пяти животных в каждой группе показаны в таблице 11.

Таблица 11
Процент ингибированияГруппаФорма ДНКHIV-1_SF2HIV-1_SF162  2wp22wp32wp22wp31pCMV в солевом растворе0
0
0
0
00
0
8
0
00
0
0
0
00
17
0
12
522PCMV, адсорбированная на частицах PLG/CTAB58
0
0
72
4840
41
0
79
613
6
0
0
110
0
0
0
103PCMV, адсорбированная на эмульсии M59/DOTAP0
0
76
81
15100
0
100
100
930
0
3
0
00
0
4
0
04pSINCP в солевом растворе0
0
0
0
00
0
0
0
00
0
12
0
160
0
1
0
05PSINCP, адсорбированная на частицах PLG/CTAB73
43
91
69
9150
0
0
0
2319
29
4
32
недоступно0
0
0
6
0

Пример 10

Получение плазмид

Плазмиды, кодирующие p55gag и gp140 HIV-1, управляемые промотором человеческого цитомегаловируса (CMV), выращивали в штамме DH5α Escherichia coli, очищали посредством Qiagen Endofree Plasmid Giga kit (Qiagen, Inc.) и ресуспендировали в 0,9% растворе хлорида натрия (Abbott Laboratories, North Chicago, Ill). Использующийся вектор pCMV содержит непосредственно-ранний энхансер/промотор CMV и терминатор бычьего гормона роста и описан подробно в другом месте (Chapman, B.S., et aL 1991."Effect of intron A from human cytomegalovirus (Towne) immediate-early gene on heterologous expression in mammalian cells." Nucleic Acids Res. 19:3979-86). ДНК-плазмидная вакцина с gag из HIV (pCMVgag) содержит синтетически сконструированный ген p55gag, полученный из штамма HIV-1 SF2, как описано ранее (zur Megede, J., et al. 2000."Increased expression and immunogenicity of sequence-modified human immunodeficiency virus type 1 gag gene." J Virol. 74:2628-35), с кодонами, отражающими частоту применения кодонов у млекопитающих. ДНК-плазмидная вакцина с env из HIV (pCMVgp140) состоит из сигнальной последовательности человеческого активатора тканевого плазминогена (tPA) и gp140 из штамма SF162 HIV-1, с кодонами, оптимизированными для высокоуровневой экспрессии в клетках млекопитающих (Barnett, S. W., et. 2001. "The ability of an oligomeric human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope antigen to elicit neutralizing antibodies against primary HIV-1 isolates is improved following partial deletion of the second hypervariable region." J Virol. 75:5526-40). Плазмидный вектор SINCP с любым из p55gag или gp140env описан в примере 3.

Пример 11

Получение белков

Последовательности белков и кДНК gp160env.SF162 опубликованы в Cheng-Mayer, C., M. Quiroga, J. W. Tung, D. Dina, and J. A. Levy. 1990. "Viral determinants of human immunodeficiency virus type 1 T-cell or macrophage tropism, cytopathogenicity, and CD4 antigen modulation." J Virol. 64:4390-8. Эти последовательности можно найти с помощью инвентарного номера Genbank M65024. Рекомбинантный белок g140.SF162(dV2) из HIV-1 экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка и очищали, как описано ранее (Barnett, S. W., ET. 2001. J Virol. 75:5526-40). Рекомбинантный белок p55gag из HIV-1.SF2 экспрессировали в дрожжах и очищали посредством катионообменной хроматографии (Chiron Corporation, Emeryville, CA). кДНК последовательность p55gag из штамма SF2 HIV-1 (инвентарный номер Genbank K02007) клонировали в экспрессирующий убиквитин вектор, что имело результатом добавление глицина и аргинина на N-конце последовательности дикого типа. Рекомбинантный белок p55gag экстрагировали из клеточного осадка дрожжей с применением 50мМ фосфорной кислоты, 6М мочевины, pH 7,9, с последующей ионообменной (катионной) хроматографией с S-fractogel. Элюцию p55gag проводили в линейном градиенте NaCl (пик при 0.4М NaCl). Расчетная очистка посредством SDS-PAGE составила 90%.

Пример 12

Поли(лактидкогликолид)-PLG-микрочастицы с адсорбированной ДНК

Полимер PLG (RG505) получали от Boehringer Ingelheim. Катионные микрочастицы получали с применением модифицированного процесса испарения растворителя. Вкратце, микрочастицы получали посредством эмульгирования 10 мл 5%-го масс./об. раствора полимера в метиленхлориде с 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) при высокой скорости с применением гомогенизатора IKA. Затем первичную эмульсию добавляли в 50 мл дистиллированной воды, содержащей бромид цетилтриметиламмония (CTAB) (0,5% масс./об.), что приводило в результате к формированию эмульсии вода-в-масле-в-воде, которую перемешивали при 6000 об./мин 12 часов при комнатной температуре, позволяющей испариться метиленхлориду. Получившиеся в результате микрочастицы дважды промывали дистиллированной водой посредством центрифугирования при 10000g и высушиванием посредством сушки вымораживанием. Плазмидную ДНК из примера 11 адсорбировали на микрочастицах посредством инкубации 100 мг катионных микрочастиц в 5 мл 200 микрограмм/мл растворе ДНК 6 часов при 4°C. Микрочастицы затем разделяли центрифугированием, осадок промывали буфером ТЕ (Tris-EDTA) и микрочастицы высушивали вымораживанием.

Пример 13

PLG-микрочастицы с адсорбированным белком

Пустые частицы получали посредством способа испарения растворителя. Вкратце, микрочастицы получали посредством гомогенизирования 10 мл 6%-го масс./об. раствора полимера в метиленхлориде с 40 мл дистиллированной воды, содержащей SDS (1% масс./об.), при высокой скорости, используя 10 мм пробы. Результатом являлась эмульсия масла в воде, которую перемешивали при 1000 об./мин 12 часов при комнатной температуре, что позволяло испариться метиленхлориду. Полученные в результате микрочастицы фильтровали через 38 мкм фильтры, 3 раза промывали в дистиллированной воде и высушивали вымораживанием. Распределение размера микрочастиц определяли с применением анализатора размера частиц (Master sizer, Malvern Instruments, Великобритания).

50 мг лиофилизированных с SDS пустых частиц инкубировали с 0,5 мг белка p55gag из примера 12 в 10 мл 25 мМ боратного буфера pH 9 с 6М мочевиной. Частицы оставляли на лабораторной мешалке 5 часов при комнатной температуре. Микрочастицы разделяли от инкубационной среды посредством центрифугирования, осадок с SDS однократно промывали в боратном буфере с 6М мочевиной, а затем три раза дистиллированной водой, после чего высушивали вымораживанием.

Уровень загрузки белка, адсорбированного на микрочастицах, определяли посредством растворения 10 мг микрочастиц в 2 мл раствора 5% SDS - 0,2М гидроксид натрия при комнатной температуре. Концентрацию белка измеряли посредством анализа белка BCA (Pierce, Rockford, Illinois). Электрокинетический потенциал и для пустых и для адсорбировавших микрочастиц измеряли с применением Malvern Zeta analyzer (Malvern Instruments, Великобритания).

Пример 14

Получение белка с адъювантом MF59

Рекомбинантный белок g140.SF162(dV2) HIV-1 из примера 12 объединяли с адъювантом MF59, как описано ранее (Barnett, S. W., et. 2001. J Virol. 75:5526-40).

Пример 15

Иммунизация

Самцов и самок макак-резус содержали в Southern Research Institute (Frederick, MD).

Иммунизацию плазмидной ДНК проводили на 0, 4 и 14 неделях. Макакам-резус вводили внутримышечные инъекции в количестве 0,5 мг pCMVgag из примера 11 (в солевом растворе, в составе с PLG/CTAB микрочастицами, как описано в примере 13, или в составе с MF59/DOTAP, как описано в примере 2) и 1,0 мг pCMVenv из примера 11 (в солевом растворе или в составе с PLG/CTAB микрочастицами, как описано в примере 13) в 4 различных участка каждому животному (по 0,25 мг pCMVgag в правое плечо и правое бедро, по 0,5 мг pCMVenv в левое плечо и левое бедро). Альтернативно, макакам-резус вводили внутримышечные инъекции в количестве 0,5 мг pSINCPgag из примера 11 (в солевом растворе или в составе с PLG/CTAB микрочастицами, как описано в примере 13) и 1,0 мг pSINCPenv из примера 11 (в солевом растворе или в составе с PLG/CTAB микрочастицами, как описано в примере 13) в четыре различных участка каждому животному.

Макак-резус поддерживали посредством внутримышечных инъекций в количестве 0,2 мг рекомбинантного белка p55gag/на PLG микрочастицах из примера 14 на 29 неделе и 0,1 мг рекомбинантного белка gp140env(dV2)/с адъювантом MF59 из примера 15 на 38 неделе.

Пример 16

Реакции c антителами

В различное время после иммунизации у анестезированных животных собирали гепаринизированную кровь и центрифугированием отделяли плазму. Анти-HIV- gag- и env-антитела измеряли посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), как описано ниже. Лунки плашек для микротитрования покрывали рекомбинантным белком p55gag из HIV-1.SF2 или рекомбинантным белком gp140env из HIV-1.SF162, растворенных в PBS в концентрации 5 микрограмм/мл, в объеме 50 микролитров на лунку и инкубировали в течение ночи при 4°C. Плашки промывали 6 раз промывочным буфером (PBS, 0,3% Tween 20) и блокировали при 37°C 1 час с 200 микролитрами блокирующего буфера (PBS, 0,3% Tween 20, 5% козьей сыворотки) на лунку. Тестируемые образцы разводили в соотношении 1:25 и затем серийно трехкратно разводили в блокирующем буфере. Блокирующий раствор удаляли и затем плашки 1 час инкубировали при комнатной температуре с 70 микролитрами каждого разведения плазмы на лунку. После шестикратной промывки плашки 1 час инкубировали при 37°C с конъюгированными с пероксидазой хрена анти-IgG антителами (разведение 1:8000). После 6-кратной промывки плашки 15 минут проявляли с субстратом TMB. Реакцию останавливали посредством 2н. NaCl и измеряли оптические плотности (OD) при длине волны 450 нм. Титр подсчитывали как обратный тому разведению, при котором была достигнута OD_{450 нм} 0,5.

Таблица 12
Титры анти-gag-антител в плазме у макак-резус  Время⁽¹⁾До2 нед.
после
1-й2 нед. после 2-й7 нед. после 2-й2 нед. после 3-й6 нед. после 3-й10 нед. после 3-й13 нед. после 3-й2 нед. после белка ⁽⁴⁾Плазмидная ДНККомпозицияНеделя026111620242731pCMV-p55gagсолевой растворГеом.
среднее⁽²⁾5619191186691411684  LL⁽³⁾558868326022955  UL⁽³⁾584241206133138782971            pCMV-p55gagPLG/CTABГеом.
среднее649010770436016375503492869968  LL5302667223259703401901887370  UL8795173848179276289064243513484            pCMV-p55gagMF59/DOTAPГеом.
среднее7142570214793536148111838542126  LL53522755771158535478235468  UL9568142933786107974098293131039664            pSINCP-p55gagсолевой растворГеом.
среднее6878452442321003  LL555518132314386  UL81111131144678722606            pSINCP-p55gagPLG/CTABГеом.
среднее872819256342785648964867823543  LL663510711225959633143139613750  UL118353461951991229723975119440312            ничего Геом.
среднее9129877887  LL675555555  UL1319161491114149⁽¹⁾ относительно иммунизаций плазмидами, проведенных на 0, 4 и 14 неделях
⁽²⁾ Геометрическое среднее для группы
⁽³⁾ Групповые арифметические средние и стандартные ошибки, подсчитанные после лог-трансформации титров. LL = antilog (арифметическое среднее - стандартная ошибка). UL = antilog (арифметическое среднее + стандартная ошибка).
⁽⁴⁾ Рекомбинантный белок p55gag, адсорбированный на анионные PLG микрочастицы, введенные на 29 неделе.

Таблица 13
Титры анти-env-антител в плазме у макак-резус  Время⁽¹⁾До2 нед. после 1-й2 нед. после 2-й7 нед. после 2-й2 нед. после 3-й6 нед. после 3-й10 нед. после 3-й13 нед. после 3-й17 нед. после 3-й23 нед. после 3-й2 нед. после белка8 нед. после белка ⁽⁴⁾Плазмидная ДНККомпозицияНеделя026111620242731374046pCMV-gp140envСолевой растворГеом.
среднее⁽²⁾55589812460342302624133580717962  LL⁽³⁾55273321703227109952815114079  UL⁽³⁾5512722023555515947269314554422824               pCMV-gp140envPLG/CTABГеом.
среднее653200529019132362614342292793913992  LL551306243087987201181713180169019  UL857841115154163640338105101644332921707               pCMV-gp140envMF59/DOTAPГеом.
среднее75659112482358925822317112156983301  LL5517651212516990796448972645  UL9524612481094620527426304513043340916903               pSINCP-gp140envСолевой растворГеом.
среднее654420703612121412152947660  LL551281310555578533931  UL8516849366127313037312978714926               pSINCP-gp140envPLG/CTABГеом.
среднее815873542661002228203318153380116921  LL6850152817656152815882700213521  UL11301521464591531341467438314231321175               НичегоНичегоГеом.
среднее91211111111111110131212  LL655555555555  UL132823252624222522322930⁽¹⁾ Относительно иммунизаций плазмидами, проведенных на 0, 4 и 14 неделях
⁽²⁾ Геометрическое среднее для группы
⁽³⁾ Групповые арифметические средние и стандартные ошибки, подсчитанные после лог-трансформации титров. LL = antilog (арифметическое среднее - стандартная ошибка). UL = antilog (арифметическое среднее + стандартная ошибка).
⁽⁴⁾ Рекомбинантный олигомерный белок gp140env(ΔV2)/адъювант MF59, введенные на 38 неделе.

Пример 17

Реакции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL)

Были получены пул из 51 синтетического пептида длиной 20 аминокислот (aa), с перекрыванием по 10 aa и охватывающий p55gag, и пул из 66 синтетических пептидов длиной 20 аминокислот (aa), с перекрыванием по 10 aa и охватывающий gp140. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) макаки-резус отделяли от гепаринизированной крови посредством центрифугирования в градиентах фиколл-гипака (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.). PBMC культивировали 8 дней в 24-луночных плашках в количестве 3x10⁶ на лунку в 1,5 мл среды для культивирования AIM-V/RPMI 1640 (50:50) (Gibco-BRL, Grand Island, N.Y.), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой. Специфичный к gag CTL стимулировали посредством добавления пула пептидов gag, а специфичный к env CTL стимулировали посредством добавления пула пептидов env. В культуры добавляли рекомбинантный человеческий интерлейкин-7 (IL-7; 15 нг/мл ; R&D Systems, Minneapolis, Minn.). Человеческий рекомбинантный IL-2 (20 междунар.ед./мл; Proleukin; Chiron) добавляли на 1, 3 и 6 дни. Стабильные линии B-лимфобластных клеток макак-резус получали посредством воздействия на PBMC супернатанта культуры, содержащей вирус герпеса papio из клеточной линии S594 (Falk, L., et al. 1976. Properties of a baboon lymphotropic herpesvirus related to Epstein-Barr virus. Int J Cancer. 18: 798-807. Rabin, H., et al. 1976. Virological studies of baboon (Papio hamadryas) lymphoma: isolation and characterization of foamyviruses. J Med Primatol. 5: 13-22.) в присутствии циклоспорина А (Sigma, St. Louis, MO). Аутологичные B-LCL заражали рекомбинантным вирусом коровьей оспы (rVV), кодирующим gag-pol из HIV-1.SF2 (rVVgag-pol) или gpl60env из HIV-1.SF162 (rVVgpl60env) (отношение PFU: клетка составляло 10) и конкурентно метили посредством Na[⁵¹Cr]₂O₄ (NEN, Boston, MA) в количестве 25 микрокюри на 1x10⁶ B-LCL. После культивирования в течение ночи при 37°C инфицированные rVV и меченные ⁵¹Cr B-LCL промывали и затем добавляли (2500 на круглодонную лунку) в дублированные лунки, содержащие трехкратные серийные разведения культивируемых PBMC. Затем добавляли в расчете 10⁵ на лунку немеченных, неинфецированных B-LCL для ингибирования неспецифического цитолиза. После инкубации в течение 4 часов при 37°C собирали по 50 микролитров супернатантов культур, помещали в LumaPlates (Packard, Meiden, CT) и подсчитывали радиоактивность (счетов в минуту (cpm)) с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика Microbeta 1450 (Wallac, Gaithersburg, MD) Высвобождающийся из лизированных мишеней ⁵¹Cr нормализовали, применяя формулу: % специфического высвобождения ⁵¹Cr =100% x (среднее экспериментальной число счетов/мин -SR)/(MR - SR), где SR = среднее число счетов/мин одних мишеней, а MR = средне число счетов/мин мишеней, подвергшихся воздействию Triton X-100. Животных определяли как обладающих позитивным, специфичным к p55gag ответом, если при двух последующих разведениях стимулированных пулом пептидов gag PBMC лизис инфицированных посредством rVVgag-pol B-LCL превосходил лизис инфицированных посредством rVVgp160env B-LCL как минимум на 10%, и если при двух последующих разведениях культивируемых PBMC лизис инфицированных посредством rVVgag-pol B-LCL посредством стимулированных пулом пептидов gag PBMC превосходил лизис инфицированных посредством rVVgag-pol B-LCL посредством стимулированных пулом пептидов env PBMC как минимум на 10%. Животных определяли как обладающих позитивным, специфичным к gp160 ответом, если при двух последующих разведениях стимулированных пулом пептидов env PBMC лизис инфицированных посредством rVVgp160env B-LCL превосходил лизис инфицированных посредством rVVgag-pol B-LCL как минимум на 10%, и если при двух последующих разведениях культивируемых PBMC лизис инфицированных посредством rVVgp160env B-LCL посредством стимулированных пулом пептидов env PBMC превосходил лизис инфицированных посредством rVVgp160env B-LCL посредством стимулированных пулом пептидов gag PBMC как минимум на 10%.

Таблица 14
Gag-специфичный CTLИндукция p55gag-специфичных CTL посредством вакцин
Число позитивных животных на группу (n=5) Неделя -22611162024Вакцинавремя: до2wp1st2wp2nd7wp2nd2wp3rd6wp3rd10wp3rdpSINCP001000 PSINCP/PLG003110 pCMV0041431PCMV/PLG0332311PCMV/MF59001100 нет000000 Таблица 15
Env-специфичный CTLИндукция gp140env-специфичных CTL посредством вакцин
Число позитивных животных на группу (n=5) Неделя -22611162024Вакцинавремя: до2wp1st2wp2nd7wp2nd2wp3rd6wp3rd10wp3rdpSINCP000010 PSINCP/PLG001010 pCMV0000011PCMV/PLG0000000PCMV/MF59000000 нет000000 

Пример 18

Анализ пролиферации лимфоцитов (LPA)

PBMC макак-резус в количестве 2x10⁵ на лунку культивировали в присутствии рекомбинантного белка p55gag или пула синтетических пептидов env или в их отсутствие. Для каждого условия культивирования задавали шесть параллельных лунок. После 4-суточной инкубации культуры метили посредством [³H]TdR в течение ночи в количестве 1 микрокюри/лунка. Включение [³H]TdR в клетки определяли посредством подсчета сцинтилляций в жидкости (BetaPlate, Wallac, Gaithersburg, MD). Индекс стимуляции (SI) подсчитывали как SI = средний cpm (стимуляция посредством gag или env)/средний cpm (без стимуляции).

Таблица 16
Индексы стимуляции анти-gag пролиферации лимфоцитов макак-резус  Время⁽¹⁾До2 нед. после 1-й2 нед. после 2-й7 нед. после 2-й2 нед. после 3-й6 нед. после 3-й10 нед. после 3-й13 нед. после 3-й2 нед. после белка ⁽⁴⁾8 нед. после белка11 нед. после белка17 нед. после белка Плазмидная ДНКДоставкаНеделя026111620242731374046pCMV-p55gagСолевой растворГеом.
среднее⁽²⁾135332527942  LL⁽³⁾124232324622  UL⁽³⁾13744363111373               pCMV- p55gagPLG/CTABГеом.
среднее2715655428754  LL137333224322  UL216341278841715118               pCMV- p55gagMF59/DOTAPГеом.
среднее1930141110911191085  LL1513766569443  UL1186527171515214225147pSINCP- p55gagСолевой растворГеом.
среднее1864466311665  LL143233326433  UL115138610124179128               pSINCP- p55gagPLG/CTABГеом.
среднее110145467613656  LL1794344410534  UL11521769121116789               ничегоНичегоГеом.
среднее112111212111  LL111111112111  UL222211213111⁽¹⁾ Относительно иммунизаций плазмидами, проведенных на 0, 4 и 14 неделях
⁽²⁾ Геометрическое среднее для группы
⁽³⁾ Групповые арифметические средние и стандартные ошибки, подсчитанные после лог-трансформации титров. LL = antilog (арифметическое среднее - стандартная ошибка). UL = antilog (арифметическое среднее + стандартная ошибка).
⁽⁴⁾ Рекомбинантный белок p55gag, адсорбированный на анионные PLG микрочастицы, введенные на 29 неделе.

Таблица 17
Индексы стимуляции анти-env пролиферации лимфоцитов макак-резус  Время⁽¹⁾До2 нед. после 1-й2 нед. после 2-й7 нед. после 2-й2 нед. после 3-й6 нед. после 3-й10 нед. после 3-й13 нед. после 3-й17 нед. после 3-й 23 нед. после 3-й2 нед. после белка8 нед. после белка⁽⁴⁾Плазмидная ДНКДоставкаНеделя026111620242731374046pCMV-gp140envСолевой растворГеом.
среднее⁽²⁾   4434444229  LL⁽³⁾   3323322126  UL⁽³⁾   66456654015               pCMV-gp140envPLG/CTABГеом.
среднее   5233232158  LL   322212284  UL   93442533116               pCMV-gp140envMF59/DOTAPГеом.
среднее   65557741812  LL   4443553139  UL   9777101062516               pSINCP-gp140envСолевой растворГеом.
среднее   96785544123  LL   54453332312  UL   15912149867445               pSINCP-gp140envPLG/CTABГеом.
среднее   103466433426  LL   73343321915  UL   1546109646247               ничегоНичегоГеом.
среднее   221212111  LL   111112111  UL   321213111⁽¹⁾ Относительно иммунизаций плазмидами, проведенных на 0, 4 и 14 неделях
⁽²⁾ Геометрическое среднее для группы
⁽³⁾ Групповые арифметические средние и стандартные ошибки, подсчитанные после лог-трансформации титров. LL = antilog (арифметическое среднее - стандартная ошибка). UL = antilog (арифметическое среднее + стандартная ошибка).
⁽⁴⁾ Рекомбинантный олигомерный белок gp140env(ΔV2)/адъювант MF59, введенные на 38 неделе.
⁽⁵⁾ нет значений: анализ не проводили.

Пример 19

Внутриклеточная иммунофлуоресценция цитокинов и проточная цитометрия

PBMC макак-резус (в количестве 1x10⁶ на лунку) культивировали в присутствии брефелдина А (Pharmingen, San Diego, CA), анти-CD28 моноклональных антител (mAb) (Pharmingen) и в присутствии пулов пептидов gag или env или в их отсутствие. Для каждого условия стимулирования подготовили дублированные лунки. На следующие сутки клетки окрасили конъюгированными с хлорофилловым белком перидинином (PerCP) анти-CD8 mAb и конъюгированными с аллофикоцианином (APC) анти-CD4 mAb (Becton Dickinson, San Jose, CA), фиксировали, разрушили мембраны (Cytofix/Cytoperm, Pharmingen) и окрасили конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) mAb против фактора некроза опухоли α (TNF-α) и конъюгированным с фикоэритрином (PE) mAb против интерферона γ (IFN-γ) (Pharmingen). Окрашенные клеточные образцы анализировали посредством проточного цитометра FACSCalibur™ и программного обеспечения CellQuest™ (Becton Dickinson). Для подклассов Т-клеток CD4+8- и CD8+4- подсчитали фракцию клеток, позитивно окрашенных на IFN-γ и TNF-α. Число клеток, специфичных к gag или env, подсчитали посредством вычитания средней фракции IFN-γ/TNF-α, обнаруженной в нестимулированных контрольных лунках, из средней фракции IFN-γ/TNF-α, обнаруженной в стимулированных gag или env лунках.

Для данного подкласса Т-клеток (CD4+8- или CD8+4-) и антигена (gag или env) ответ обозначали как позитивный, если фракция антиген-специфичных клеток составляла как минимум 0,1%.

Таблица 18
Специфичные к gag IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD4+ Т-клеткиИндукция вакциной специфичных к p55gag IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD4+
Т-клеток
Число позитивных животных на группу (n=5)* ДоПосле
1-йПосле
2-йПосле
3-йПосле белкаpSINCP00001PSINCP/PLG00200pCMV00000PCMV/PLG00201PCMV/MF5900000Нет00000*Позитивные: частота ≥ 0,1%Таблица 19
Специфичные к env IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD4+ Т-клеткиИндукция вакциной специфичных к gp140env IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD4+ Т-клеток
Число позитивных животных на группу (n=5)* ДоПосле
1-йПосле
2-йПосле
3-йПосле белкаpSINCP00003PSINCP/PLG00103pCMV00102PCMV/PLG00203PCMV/MF5900000Нет00000*Позитивные: частота ≥ 0,1%Таблица 20
Специфичные к gag IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD8+ Т-клеткиИндукция вакциной специфичных к p55gag IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD8+ Т-клеток
Число позитивных животных на группу (n=5)* ДоПосле
1-йПосле
2-йПосле
3-йПосле белкаpSINCP00000PSINCP/PLG00000pCMV00010PCMV/PLG00100PCMV/MF5900000Нет00000*Позитивные: частота ≥ 0,1%

Таблица 21
Специфичные к env IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD8+ Т-клеткиИндукция вакциной специфичных к gp140env IFN-γ⁺/TNF-α⁺ CD8+ Т-клеток
Число позитивных животных на группу (n=5)* ДоПосле
1-йПосле
2-йПосле
3-йПосле белкаpSINCP00010PSINCP/PLG00000pCMV00000PCMV/PLG00000PCMV/MF5900000Нет00000*Позитивные: частота ≥ 0,1%

Хотя предпочтительные осуществления настоящего изобретения подробно описаны, следует понимать, что можно осуществлять очевидные вариации без отклонения от сути и объема изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.

Ссылки

Изобретение относится к области медицины и касается микрочастиц с адсорбирующими поверхностями, способов получения таких микрочастиц и способов их применения. Микрочастицы включают в себя полимер, такой как поли-(α-гидроксикислота), и образуются с использованием катионных, анионных и неионных детергентов, а микрочастицы в виде субмикронных эмульсий и масляно-капельных эмульсий содержит метаболизирующееся масло и эмульгирующее средство. Поверхность микрочастиц эффективно адсорбирует полипептиды, такие как антигены, и нуклеиновые кислоты, такие как векторы ELVIS, и другие векторные конструкции, содержащие гетерологичные нуклеотидные последовательности, кодирующие биологически активные макромолекулы, такие как полипептиды, антигены и адъюванты. Также описано применение композиций микрочастиц для производства лекарственных средств. Преимущество изобретения заключается в разработке более эффективных носителей лекарственных средств. 7 н. и 46 з.п. ф-лы, 21 табл., 6 ил.

1. Способ получения микрочастицы, имеющей адсорбирующую поверхность, на которой адсорбирована векторная конструкция, способная экспрессировать выбранную гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, где указанный способ включает в себя стадии

(a) эмульгирования смеси раствора полимера и детергента с образованием эмульсии, где раствор полимера содержит полимер поли-(α-гидроксикислоты), присутствующий в органическом растворителе в концентрации, составляющей примерно от 1% и примерно до 30%, и где детергент присутствует в смеси в отношении массы детергента к массе полимера, составляющем примерно от 0,00001:1 и примерно до 0,5:1;

(b) удаления из эмульсии органического растворителя, с образованием указанной микрочастицы; и

(c) адсорбции векторной конструкции на поверхности микрочастицы, где указанная векторная конструкция выбрана из группы, состоящей из вектора ELVIS и векторной РНК-конструкции, и указанная векторная конструкция содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.

(a) векторная конструкция содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антиген, в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ;

(b) векторная конструкция адсорбирована на микрочастицах, содержащих (i) полимер поли-(α-гидроксикислоты) и (ii) детергент;

(c) лекарственное средство используют со вторым антигеном, который служит для усиления иммунологического ответа у позвоночного хозяина; и

(d) первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или различными.

(a) векторная конструкция содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую первый антиген, в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать иммунный ответ;

(b) векторная конструкция адсорбирована на микрочастицах, содержащих (i) полимер поли-(α-гидроксикислоты) и (ii) детергент;

(c) второй антиген используется после адсорбированной векторной конструкции и служит для усиления иммунного ответа у позвоночного хозяина; и

(d) первый антиген и второй антиген могут быть одинаковыми или различными.