САПОВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ Российский патент 2025 года по МПК A61K39/12 C12N15/86 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] В целом, настоящее изобретение относится к композициям, вызывающим иммунные ответы против саповирусов. В частности, изобретение относится к иммуногенным композициям (например, вакцинам), содержащим иммуногенные полипептиды саповируса. Помимо этого, иммуногенные композиции могут содержать антигены, отличные от антигенов саповируса. Также описаны способы индукции иммунного ответа с помощью иммуногенных композиций, раскрытых в настоящем описании, и способы лечения саповирусной инфекции.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Саповирусы (также известные как Саппоро - подобные вирусы) являются этиологическими агентами острого гастроэнтерита. Саповирусы относятся к семейству Caliciviridae, небольшим вирусам без оболочки диаметром 27-35 нм, содержащим одноцепочечную геномную РНК положительной полярности.

[0003] Природными хозяевами вируса являются люди и свиньи. Вирус передается при оральном/фекальном контакте. Симптомы чаще всего включают диарею и рвоту. Саповирус был обнаружен впервые в 1977 году во время вспышки гастроэнтерита в детском доме в Саппоро, Япония.

[0004] После инкубационного периода продолжительностью от 1 до 4 дней начинают проявляться признаки заболевания. Симптомы саповируса очень похожи на симптомы норовируса. Наиболее распространенными симптомами являются рвота и диарея; однако могут возникнуть дополнительные симптомы, и очень редко лихорадка. Хотя у людей чаще всего симптомы начинают проявляться после инкубационного периода продолжительностью от 1 до 4 дней, зарегистрированы случаи, когда у индивидуума отсутствовали симптомы. Несмотря на отсутствие симптомов, такой индивидуум все же способен распространять вирус обычным путем передачи, т.е. орально-фекальным способом.

[0005] Сохраняется потребность в улучшенной терапии для лечения субъектов, страдающих гастроэнтеритом, связанным с саповирусной инфекцией, и в способах предотвращения распространения инфекции.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим антигены саповируса, в частности, в составе субъединичных вакцин.

[0007] В вариантах осуществления раскрыты способы получения иммуногенных полипептидов и/или пептидов, происходящих от саповируса, которые можно смешивать или коэкспрессировать с адъювантами. Иммуногенные композиции могут включать один или более полипептидов и/или адъювантов, раскрытых в настоящем описании. Например, иммуногенные композиции могут содержать другие антигены, которые можно использовать при иммунизации против вызывающих диарейные заболевания патогенов, такие как антигены, полученные из ротавируса.

[0008] В некоторых вариантах осуществления раскрыт способ получения полипептида, включающий этап культивирования клетки-хозяина, трансформированной нуклеиновой кислотой, раскрытой в настоящем описании, в условиях, индуцирующих экспрессию полипептида. В родственном аспекте белок саповируса может быть экспрессирован с помощью рекомбинантного метода и использован для разработки иммуногенной композиции, содержащей рекомбинантную антигенную субъединицу, где такой экспрессируемый полипептид получают методом, в котором используются бакуловирус/клетки насекомых.

[0009] В одном из аспектов раскрыт способ получения нуклеиновой кислоты, где нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или полипептид, происходящий из саповируса, получают (по меньшей мере частично) путем химического синтеза. В родственном аспекте способ включает амплификацию нуклеиновых кислот методом амплификации с помощью праймеров (например, ПЦР). В родственном аспекте праймеры для таких реакций включают, без ограничения, SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 22, 23, 24, 25 и их комбинации.

[0010] В другом аспекте раскрыт способ получения белкового комплекса, включающий введение субъекту полипептида, полученного из саповируса, или его фрагмента. В родственном аспекте способ включает смешивание полипептида, полученного из саповируса, с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. В дополнительном родственном аспекте композиция может включать полипептид, представленный в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:21 или их комбинации. В еще одном родственном аспекте полипептид саповируса содержит VP1. В другом аспекте композиция может содержать более одного VP1 саповируса, причем указанные более одного VP1 происходят из более чем одного штамма.

[0011] В вариантах осуществления раскрыт способ индукции иммунологического ответа у субъекта, включающий введение композиции по настоящему изобретению. В родственном аспекте способ дополнительно включает введение адъюванта. В дополнительном родственном аспекте способ включает введение иммуногенной композиции субъекту топическим, парентеральным или мукозальным способом введения.

[0012] В одном из аспектов введение может представлять собой многократное введение, где первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция являются одинаковыми. В другом аспекте первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция отличаются.

[0013] В одном из аспектов введение осуществляют два или более раз.

[0014] В вариантах осуществления раскрыто лекарственное средство для лечения у нуждающегося в этом субъекта инфекции, вызванной саповирусом, содержащее терапевтически эффективное количество вышеуказанной иммуногенной композиции.

[0015] В вариантах осуществления раскрыт способ лечения инфекции, вызванной саповирусом, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества иммуногенной композиции, раскрытой в настоящем описании.

[0016] В родственном аспекте способ включает мукозальное введение терапевтически эффективного количества первой иммуногенной композиции, содержащей один или более антигенов саповируса, и местное или парентеральное введение терапевтически эффективного количества второй иммуногенной композиции, содержащей один или более антигенов саповируса.

[0017] В одном из аспектов субъекту вводят несколько терапевтически эффективных доз иммуногенной композиции. В другом аспекте иммуногенная композиция содержит антиген ротавируса.

[0018] В вариантах осуществления раскрыта выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая белок VP1 саповируса, где кодирующая нуклеиновая кислота включает i) последовательность, включающую SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:20 и их комбинации, или ii) нуклеиновую кислоту, последовательность которой на по меньшей мере 80% идентична последовательностям нуклеиновой кислоты, представленным в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:20 или их комбинациях.

[0019] В одном из аспектов кодирующую нуклеиновую кислоту рекомбинируют с вектором. В родственном аспекте вектор представляет собой бакуловирусный вектор. В другом родственном аспекте вектор содержится в клетке-хозяине. В дополнительном родственном аспекте клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого.

[0020] Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения станут более понятны специалистам в данной области техники из настоящего описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[0021] Фиг. 1 представляет собой график сравнения гомологичного и гетерологичного покрывающих антигенов, по оси х отложено разведение сыворотки, по оси у указана оптическая плотность. ( V19030-060920, среднее значение OD пула с саповирусом; IAV-S Н3, среднее значение OD пула вакцинированных; V19030-060920, среднее значение OD пула контроля с саповирусом, но не вакцинированного, V19045-120321А; IAV-S Н3, среднее значение OD пула контроля с саповирусом, но не вакцинированного).

[0022] Фиг. 2 представляет собой график сравнения вакцинированных с невакцинированными по данным серологической оценки, выполненной с помощью ELISA (те же оси, что и на фиг.1) ( 860 вакцинированные; 861 вакцинированные; 862 вакцинированные; 863 вакцинированные; 864 вакцинированные; 865 вакцинированные; 866 вакцинированные; 867 невакцинированные; 868 невакцинированные; 869 невакцинированные).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0023] Перед описанием настоящей композиции, способов и методов, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными композициями, способами и экспериментальными условиями, поскольку такие композиции, способы и условия могут меняться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, а не для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

[0024] В контексте настоящего описания и прилагаемой формулы изобретения, формы единственного числа «a», «an» и «the» включают ссылки на множественное число, если из контекста в явном виде не следует иное. Таким образом, например, ссылки на «нуклеиновую кислоту» включают одну или более нуклеиновых кислот и/или композиций описанного здесь типа, которые станут очевидными специалистам в данной области после ознакомления с настоящим описанием и т.д.

[0025] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, в котором их обычно понимает специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Любые способы и материалы, подобные или эквивалентные раскрытым в настоящем описании, могут быть использованы на практике или при тестировании изобретения, поскольку следует понимать, что модификации и изменения включены в сущность и объем настоящего изобретения.

[0026] В контексте настоящего описания термины «примерно», «приблизительно», «по существу» и «практически» будут понятны специалисту в данной области техники и будут меняться до некоторой степени в зависимости от контекста, в котором они используются. Если существуют варианты использования термина, которые не понятны специалистам в данной области техники, исходя из контекста, в котором этот термин используется, термины «примерно» и «приблизительно» будут означать плюс/минус <10% конкретного термина, и «по существу» и «практически» будут означать плюс/минус >10% конкретного термина. В вариантах осуществления композиции могут «состоять», «содержать» или «по существу состоять из» конкретного компонента или группы компонентов, при этом специалисту в данной области будет понятно, что последнее означает, что объем формулы изобретения ограничен указанными материалами или этапами, а также материалами или этапами, которые не оказывают существенного влияния на основную/основные и новую/новые характеристику/характеристики заявленного изобретения.

[0027] В контексте настоящего описания термины «саповирус» и «Саппоро-подобный вирус» относятся к членам рода Sapovirus семейства Caliciviridae, которые являются вирусами с одноцепочечной РНК с положительной полярностью и не содержат оболочку. Термин «саповирус» включает штаммы всех геногрупп вируса. На сегодняшний день штаммы саповирусов разделены на пять геногрупп (GI-GV) на основе последовательностей их капсида (VP1). Термин «саповирус» может включать, без ограничения, разновидности вируса Саппоро, вируса London/29845, вируса Manchester, вируса Houston/86, вируса Houston/90 и вируса Parkville. Большое количество изолятов саповируса было частично или полностью секвенировано. Термин «саповирус» также включает изоляты, не охарактеризованные на момент подачи заявки.

[0028] Термины «полипептид» и «белок» относятся к полимеру из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной продукта. Таким образом, определение включает пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и т.п. Это определение включает как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Эти термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Помимо этого, для целей настоящего описания «полипептид» относится к белку, который включает модификации нативной последовательности, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по своей природе), при условии, что белок сохраняет желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, результатом сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, результатом мутаций хозяев, которые продуцируют эти белки, или ошибок, вызванных ПЦР-амплификацией.

[0029] «По существу очищенный» обычно относится к выделению вещества (соединения, полинуклеотида, белка, полипептида, полипептидной композиции), в результате которого это вещество составляет основной процент образца, в котором оно находится. Как правило, по существу очищенный компонент в образце составляет примерно 50%, примерно 80%-85% или примерно 90-95% образца. Методы очистки представляющих интерес полинуклеотидов и полипептидов хорошо известны в данной области и включают, например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и седиментацию в градиенте плотности.

[0030] Под «выделенным» применительно к полипептиду подразумевается, что указанная молекула является отделенной и обособленной от всего организма или клетки, в которой эта молекула встречается в природе, или присутствует при по существу отсутствии других биологических макромолекул одного и того же типа. Термин «выделенный» применительно к полинуклеотиду означает молекулу нуклеиновой кислоты, полностью или частично лишенную последовательностей, обычно связанных с ней в природе; или последовательность, существующую в природе, но ассоциированную с гетерологичными последовательностями; или молекулу, отделенную от хромосомы.

[0031] В контексте настоящего описания термины «метка» и «детектируемая метка» относятся к молекуле, способной к обнаружению, включая, без ограничения, радиоактивные изотопы, флуоресцентные вещества, хемилюминесцентные вещества, ферменты, ферментные субстраты, кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов, хромофоры, красители, ионы металлов, золи металлов, лиганды (например, биотин или гаптены) и т.п. Термин «флуоресцентное вещество» относится к веществу или его части, которые способны проявлять флуоресценцию в детектируемом диапазоне. Конкретные примеры меток, которые могут быть использованы, включают флуоресцеин, родамин, дансил, умбеллиферон, техасский красный, люминол, сложные эфиры акрадимума, НАДФН и α-β-галактозидазу.

[0032] «Гомология» относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидными или двумя полипептидными фрагментами. Две последовательности нуклеиновых кислот или две полипептидные последовательности являются «по существу гомологичными» друг другу, когда последовательности являются на по меньшей мере примерно 50% идентичными, по меньшей мере примерно 75% идентичными, по меньшей мере примерно 80-85% идентичными, по меньшей мере примерно 85% идентичными, 90% идентичными и по меньшей мере примерно 95%-98% идентичными на определенной длине молекул. В настоящем описании термин «по существу гомологичный» также относится к последовательностям, которые полностью идентичны указанной последовательности. В одном из аспектов антигены, раскрытые в настоящем описании, могут не включать встречающиеся в природе последовательности саповируса (т.е. аминокислотные последовательности, гомологичные на 100% встречающейся в природе аминокислотной последовательности VP1 саповируса или встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аминокислотную последовательность).

[0033] В целом, «идентичность» относится к точному нуклеотидному или аминокислотному соответствию двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, соответственно. Процент идентичности может быть определен путем прямого сравнения информации о последовательностях между двумя молекулами путем выравнивания последовательностей, подсчета точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, деления на длину более короткой последовательности и умножения результата на 100. Для этой цели в анализе можно использовать легкодоступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, М.О. в Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff, ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, D.C., которая адаптирует алгоритм поиска локальной гомологии Смита и Ватермана (Smith и Waterman) (см. Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981) для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидных последовательностей доступны в пакете для анализа последовательностей Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 (от Genetics Computer Group, Madison, Wis.), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также основаны на алгоритме Смита и Ватермана. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию, рекомендованными производителем и описанными в упомянутом выше пакете Wisconsin Sequence Analysis Package. Например, процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности относительно эталонной последовательности может быть определен с помощью алгоритма гомологии Смита и Ватермана с таблицей оценок по умолчанию и штрафом за пропуск шести положений нуклеотидов.

[0034] Другой способ определения процента идентичности в контексте настоящего изобретения заключается в использовании пакета программ MPSRCH, авторские права которого принадлежат Эдинбургскому университету и который был разработан John F. Collins и Shane S. Sturrok и дистрибьюьером которого является IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Из этого набора пакетов можно использовать алгоритм Смита-Ватермана, в котором для таблицы оценок используются параметры по умолчанию (например, штраф за открытие пропуска (гэпа) - 12, штраф за удлинение пропуска - один, и пропуск - шесть). Из полученных данных значение «совпадение» (Match) отражает «идентичность последовательностей». Другие подходящие программы для вычисления процента идентичности или сходства между последовательностями в целом хорошо известны в данной области техники, например программа выравнивания BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: генетический код=стандартный; фильтр=нет; нить=обе; пороговое значение=60; ожидаемое=10; матрица=BLOSUM62; описания=50 последовательностей; сортировка по=наивысшей оценке (HIGH SCORE); базы данных=неизбыточные, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Подробная информация об этих программах находится в общем доступе. В одном из аспектов антигены, раскрытые в настоящем описании, могут не включать встречающиеся в природе последовательности саповируса (т.е. аминокислотные последовательности, идентичные на 100% встречающейся в природе аминокислотной последовательности VP1 саповируса или встречающейся в природе последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную аминокислотную последовательность).

[0035] Альтернативно, гомология может быть определена гибридизацией полинуклеотидов в условиях, при которых между гомологичными областями образуются стабильные дуплексы, с последующим расщеплением нуклеазой(ами) со специфичностью к одноцепочечной нуклеиновой кислоте, и определением размеров расщепленных фрагментов. По существу гомологичные последовательности ДНК могут быть идентифицированы в гибридизации по Саузерну, например, в жестких условиях, определенных для этой конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в компетенции специалиста в данной области.

[0036] Термин «рекомбинантный», используемый для описания молекулы нуклеиновой кислоты, означает полинуклеотид геномного, кДНК, вирусного, полусинтетического или синтетического происхождения, который в силу своего происхождения или манипуляций не связан со всей или частью полинуклеотида, с которым он связан в естественных условиях. Термин «рекомбинантный», используемый по отношению к белку или полипептиду, означает полипептид, полученный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Обычно представляющий интерес ген клонируют, а затем экспрессируют в трансформированных организмах, как описано ниже. Экспрессию чужеродного гена для продуцирования белка осуществляют в организме-хозяине в подходящих для экспрессии условиях.

[0037] Термин «трансформация» относится к вставке экзогенного полинуклеотида в клетку-хозяина, независимо от метода, используемого для вставки. Например, сюда входят прямое поглощение, трансдукция или f-спаривание. Экзогенный полинуклеотид может находиться в виде неинтегрированного вектора, например, плазмиды, или, альтернативно, может быть интегрирован в геном хозяина.

[0038] «Рекомбинантные клетки-хозяева», «клетки-хозяева», «клетки», «линии клеток», «культуры клеток» и другие аналогичные термины, обозначающие микроорганизмы или линии высших эукариотических клеток, культивируемые в виде одноклеточных организмов, относятся к клеткам, которые могут быть, или используются в качестве реципиентов для рекомбинантного вектора или другой перенесенной ДНК, и включают исходное потомство исходной трансфицированной клетки.

[0039] «Кодирующая последовательность» или последовательность, которая «кодирует» выбранный полипептид, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vivo, когда помещается под контроль соответствующих регуляторных последовательностей (или «регуляторных элементов»). Границы кодирующей последовательности могут определяться стартовым кодоном на 5'-(амино)-конце и стоп-кодоном трансляции на 3'-(карбокси)-конце. Кодирующая последовательность может включать, без ограничения, кДНК из последовательностей вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, геномной ДНК из вирусной или прокариотической ДНК и даже синтетические последовательности ДНК. Последовательность терминации транскрипции может располагаться на 3'-конце кодирующей последовательности.

[0040] Типичные «регуляторные элементы» включают, без ограничения, промоторы транскрипции, элементы-энхансеры транскрипции, сигналы терминации транскрипции, последовательности полиаденилирования (расположенные на 3'-конце относительно стоп-кодона трансляции), последовательности для оптимизации инициации трансляции (расположенные на 5'-конце относительно кодирующей последовательности) и последовательности терминации трансляции.

[0041] Термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК и РНК, а также их аналоги, например, содержащие модифицированные остовы (например, фосфоротиоаты и т.п.), а также пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) и т.п. Настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, содержащим последовательности, комплементарные описанным выше (например, с целью использования антисмысловых последовательностей или зондов).

[0042] «Функционально связанный» относится к расположению элементов, при котором описанные таким образом компоненты расположены с возможностью выполнения своей обычной функции. Таким образом, данный промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, способен осуществлять экспрессию кодирующей последовательности в присутствии соответствующих ферментов. Промотор не обязательно должен находиться рядом с кодирующей последовательностью, при условии, что он функционирует, направляя ее экспрессию. Таким образом, например, между последовательностью промотора и кодирующей последовательностью могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибируемые последовательности, и последовательность промотора все еще можно считать «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.

[0043] «Кодируемый [чем-то]» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептидную последовательность, где полипептидная последовательность или ее часть содержит аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 3-5 аминокислот, по меньшей мере из 8-10 аминокислот, и по меньшей мере от 15-20 аминокислот полипептида, кодируемого последовательностью нуклеиновой кислоты.

[0044] «Экспрессионная кассета» или «экспрессионная конструкция» относится к сборке, которая способна управлять экспрессией представляющей(их) интерес последовательности(ей) или гена(ов). Экспрессионная кассета обычно включает описанные выше регуляторные элементы, такие как промотор, который функционально связан (чтобы направлять транскрипцию) с представляющей(ими) интерес последовательностью(ями) или геном(ами), и часто также включает последовательность полиаденилирования. В вариантах осуществления экспрессионная кассета, представленная в настоящем описании, может находиться внутри плазмидной конструкции. Помимо компонентов экспрессионной кассеты плазмидная конструкция также может включать один или более селектируемых маркеров, сигнал, который позволяет плазмидной конструкции существовать в виде одноцепочечной ДНК (например, точку начала репликации М13), по меньшей мере один сайт множественного клонирования и точку начала репликации «млекопитающих» (например, начало репликации SV40 или аденовируса).

[0045] «Очищенный полинуклеотид» относится к представляющему интерес полинуклеотиду или его фрагменту, по существу свободному, например, содержащему менее чем примерно 50%, менее чем примерно 70% и менее чем примерно 90% белка, с которым полинуклеотид связан в естественных условиях. Способы очистки представляющих интерес полинуклеотидов хорошо известны в данной области техники и включают, например, разрушение клетки, содержащей полинуклеотид, с помощью хаотропного агента и разделение полинуклеотида(ов) и белков с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии и седиментации в градиенте плотности.

[0046] Термин «трансфекция» используется для обозначения поглощения клеткой чужеродной ДНК. Клетка является «трансфицированной» после введения внутрь клеточной мембраны экзогенной ДНК. В данной области техники общеизвестно несколько способов трансфекции. Такие способы можно использовать для введения одного или более экзогенных фрагментов ДНК в подходящие клетки-хозяева. Этот термин относится как к стабильному, так и к временному поглощению генетического материала и включает поглощение ДНК, связанных с пептидами или антителами.

[0047] «Вектор» способен переносить последовательности нуклеиновых кислот в клетки-мишени (например, вирусные векторы, невирусные векторы, частицы-носители и липосомы). Обычно «векторная конструкция», «вектор экспрессии» и «вектор для переноса гена» означают любую конструкцию нуклеиновой кислоты, которая способна управлять экспрессией представляющей интерес нуклеиновой кислоты и которая может переносить последовательности нуклеиновых кислот в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает средства клонирования и экспрессии, а также вирусные векторы.

[0048] Под «фрагментом» подразумевается молекула, состоящая только из части неповрежденной полноразмерной последовательности и структуры. Фрагмент полипептида может включать С-концевую делецию, N-концевую делецию и/или внутреннюю делецию нативного полипептида. Фрагмент полипептида обычно включает по меньшей мере примерно 5-10 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы, по меньшей мере примерно 15-25 смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы и по меньшей мере примерно 20-50 или более смежных аминокислотных остатков полноразмерной молекулы или любое целое число от 5 аминокислот до количества аминокислот в полноразмерной последовательности, при условии, что рассматриваемый фрагмент сохраняет способность вызывать желаемый биологический ответ. Фрагмент нуклеиновой кислоты может включать 5'-делецию, 3'-делецию и/или внутреннюю делецию нуклеиновой кислоты. Фрагменты нуклеиновой кислоты обычно включают по меньшей мере примерно 5-1000 смежных нуклеотидных оснований полноразмерной молекулы и могут включать по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 или по меньшей мере 500 смежных нуклеотидов полноразмерной молекулы или любое целое число от 5 нуклеотидов до количества нуклеотидов в полноразмерной последовательности. Такие фрагменты могут быть полезны при гибридизации, амплификации, получении иммуногенных фрагментов или иммунизации с использованием нуклеиновых кислот.

[0049] Под «иммуногенным фрагментом» понимают фрагмент иммуногена, который включает один или более эпитопов и, таким образом, может модулировать иммунный ответ или может действовать в качестве адъюванта для совместно вводимого антигена. Такие фрагменты можно идентифицировать любым количеством методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, путем одновременного синтеза большого количества пептидов на твердых носителях, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и осуществления взаимодействия между пептидами и антителами, при этом пептиды все еще остаются прикрепленными к носителям. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США №4708871, включенном в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки. Аналогично, можно легко идентифицировать конформационные эпитопы путем определения пространственной конформации аминокислот, например, методами рентгеновской кристаллографии и двумерного ядерного магнитного резонанса.

[0050] Иммуногенные фрагменты для целей настоящего изобретения обычно будут иметь в длину по меньшей мере примерно 2 аминокислоты, примерно 5 аминокислот и по меньшей мере от примерно 10 до примерно 15 аминокислот. Не существует критического верхнего предела длины фрагмента, который может включать практически всю длину белковой последовательности или даже слитый белок, содержащий два или более эпитопов.

[0051] В контексте настоящего описания термин «эпитоп» обычно относится к участку на антигене, который распознается Т-клеточным рецептором и/или антителом. В вариантах осуществления он представляет собой короткий пептид, полученный из белкового антигена или являющийся его частью. Однако этот термин также включает пептиды с гликопептидами и углеводными эпитопами. Одна антигенная молекула может нести несколько разных эпитопов. Термин «эпитоп» также включает модифицированные последовательности аминокислот или углеводов, которые стимулируют реакции, распознающие целый организм.

Предпочтительно, если выбранный эпитоп является эпитопом инфекционного агента, вызывающего инфекционное заболевание.

[0052] Эпитоп может быть создан на основе знаний об аминокислоте и соответствующих последовательностях ДНК пептида или полипептида, а также на основе природы конкретных аминокислот (например, размера, заряда и т.п.) и словаря кодонов, без излишнего экспериментирования. Некоторые рекомендации по определению того, будет ли белок стимулировать ответ, включают: длина пептида - пептида длиной примерно 8 или 9 аминокислот, чтобы соответствовать комплексу МНС класса I, и примерно 13-25 аминокислот, чтобы соответствовать комплексу МНС класса II. Эта длина является минимальной для связывания пептида с комплексом МНС. В одном из аспектов пептиды могут быть длиннее указанных значений, поскольку они могут разрезаться в клетках. Пептид может содержать соответствующий якорный мотив, который позволит ему связываться с различными молекулами класса I или класса II с достаточно высокой специфичностью для генерации иммунного ответа. Это можно сделать без излишнего экспериментирования путем сравнения последовательности представляющего интерес белка с опубликованными структурами пептидов, связанных с молекулами МНС. Таким образом, специалист в данной области техники может определить представляющий интерес эпитоп путем сравнения последовательности белка с последовательностями, приведенными в базе данных белков.

[0053] В контексте настоящего описания термин «Т-клеточный эпитоп» обычно относится к тем особенностям пептидной структуры, которые способны индуцировать Т-клеточный ответ, а «В-клеточный эпитоп» обычно относится к тем особенностям пептидной структуры, которые способны индуцировать В-клеточный ответ.

[0054] «Иммунологический ответ» на антиген или композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на антиген, присутствующий в представляющей интерес композиции. Для целей настоящего изобретения «гуморальный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител, тогда как «клеточный иммунный ответ» является ответом, опосредованным Т-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами. Одним из важных аспектов клеточного иммунитета является антигенспецифический ответ цитолитических Т-клеток («CTL»). CTL обладают специфичностью к пептидным антигенам, которые представлены в ассоциации с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (МНС) и экспрессируемыми на поверхности клеток. CTL облегчают индукцию и способствуют разрушению внутриклеточных микробов или лизису клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает антигенспецифический ответ Т-хелперов. Действие Т-хелперов заключается в облегчении стимуляции функционирования неспецифических эффекторных клеток и фокусирования их активности против клеток, демонстрирующих пептидные антигены в ассоциации с молекулами МНС на своей поверхности. «Клеточный иммунный ответ» также относится к продуцированию цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими лейкоцитами, включая клетки, происходящие из CD4+ и CD8+ Т-клеток.

[0055] Композиция или вакцина, вызывающая клеточный иммунный ответ, может служить для сенсибилизации позвоночного субъекта путем презентации антигена на поверхности клетки в ассоциации с молекулами МНС. Клеточно-опосредованный иммунный ответ направлен на клетки, презентирующие на своей поверхности антиген, или вблизи них. Кроме того, для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина можно генерировать антигенспецифические Т-лимфоциты.

[0056] Способность конкретного антигена стимулировать клеточно-опосредованный иммунологический ответ может быть определена с помощью нескольких анализов, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы цитотоксических клеток CTL или анализ антигенспецифических Т-лимфоцитов у сенсибилизированного субъекта. Такие анализы хорошо известны в данной области. Современные методы измерения клеточно-опосредованного иммунного ответа включают измерение уровня внутриклеточных цитокинов или секреции цитокинов популяциями Т-клеток или измерение эпитоп-специфических Т-клеток.

[0057] Таким образом, иммунологический ответ, используемый в настоящем описании, может быть ответом, который стимулирует выработку антител (например, нейтрализующих антител, которые блокируют бактериальные токсины и патогены, такие как вирусы, проникающие в клетки, и репликация которых осуществляется за счет связывания с токсинами и патогенами, что обычно приводит к защите клетки от инфицирования и разрушения). Представляющий интерес антиген также может вызывать продуцирование CTL. Следовательно, иммунологический ответ может включать один или более из следующих эффектов: продуцирование антител В-клетками; и/или активацию супрессорных Т-клеток и/или Т-клеток памяти/эффекторных Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, присутствующие в представляющей интерес композиции или вакцине. Эти ответы могут служить для нейтрализации инфекционности и/или могут опосредовать антитело-комплементарную или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) для обеспечения защиты иммунизированного хозяина. Такие ответы можно определить с помощью стандартных иммуноанализов и анализов нейтрализации, хорошо известных в данной области. Врожденная иммунная система млекопитающих также распознает молекулярные особенности патогенных организмов и реагирует на них посредством активации Toll-подобных рецепторов и аналогичных рецепторных молекул на иммунных клетках. При активации врожденной иммунной системы активируются различные клетки неадаптивного иммунного ответа, например, для продуцирования различных цитокинов, лимфокинов и хемокинов. Клетки, активированные врожденным иммунным ответом, включают незрелые и зрелые дендритные клетки линии моноцитов и плазмоцитоидных клеток (MDC, PDC), а также гамма, дельта, альфа и бета Т-клетки и В-клетки и т.п. Таким образом, настоящее изобретение также имеет отношение к иммунному ответу, как к врожденному, так и адаптивному ответу.

[0058] «Иммуногенная композиция» представляет собой композицию, которая содержит антигенную молекулу, причем введение композиции субъекту приводит к развитию у субъекта гуморального и/или клеточного иммунного ответа на представляющую интерес антигенную молекулу.

[0059] Термины «иммуногенный» белок или полипептид относятся к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунологический ответ, как описано выше. «Иммуногенный» белок или полипептид, в контексте настоящего описания, включает полноразмерную последовательность рассматриваемого белка, включая предшественник и зрелые формы, их аналоги или их иммуногенные фрагменты.

[0060] «Перенос гена» или «доставка гена» относится к способам или системам для надежной вставки представляющей интерес ДНК или РНК в клетку-хозяина. Такие способы могут привести к временной экспрессии неинтегрировэнной перенесенной ДНК, внехромосомной репликации и экспрессии перенесенных репликонов (например, эписом) или интеграции перенесенного генетического материала в геномную ДНК клеток-хозяев. Векторы экспрессии для доставки генов включают, без ограничения, векторы, полученные из бактериальных плазмидных векторов, вирусные векторы, невирусные векторы, альфавирусы, вирусы оспы и вирусы коровьей оспы. При использовании для иммунизации такие векторы экспрессии для доставки генов могут называться вакцинами или вакцинными векторами.

[0061] Термин «полученный из» используется в настоящем описании для идентификации исходного источника молекулы, но не предназначен для ограничения способа получения молекулы, который может представлять собой, например, химический синтез или рекомбинантные способы.

[0062] Как правило, вирусный полипептид «получают из» конкретного полипептида вируса (вирусного полипептида), если он (i) кодируется открытой рамкой считывания полинуклеотида этого вируса (вирусного полинуклеотида) или (ii) является идентичным последовательности полипептидов этого вируса, как описано выше.

[0063] Полинуклеотид, «полученный из» указанной последовательности, относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит непрерывную последовательность, состоящую приблизительно из по меньшей мере примерно 6 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 8 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 10-12 нуклеотидов и по меньшей мере примерно 15-20 нуклеотидов, соответствующих, т.е. идентичных или комплементарных участку обозначенной нуклеотидной последовательности. Полученный полинуклеотид не обязательно будет получен физически из представляющей интерес нуклеотидной последовательности, но может быть создан любым способом, включая, без ограничения, химический синтез, репликацию, обратную транскрипцию или транскрипцию, которая основана на информации, предоставляемой последовательностью оснований в области(ях), из которой получен полинуклеотид. По существу, он может представлять либо смысловую, либо антисмысловую ориентацию исходного полинуклеотида.

[0064] Полинуклеотид, олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, белок, полипептид или пептид саповируса, как определено выше, представляет собой молекулу, полученную из саповируса, соответственно, включая, без ограничения, любой из различных изолятов саповируса. Молекула не обязательно должна быть физически получена из конкретного изолята, о котором идет речь, но может быть получена синтетически или рекомбинантно.

[0065] Геномы штаммов саповирусов содержат либо две, либо три открытые рамки считывания. В штаммах саповируса, имеющих две открытые рамки считывания, ORF1 кодирует полипротеин, содержащий как неструктурные, так и структурные белки. Капсидный белок VP1 кодируется ORF1 в виде компонента полипротеина саповируса, а минорный структурный белок VP10 кодируется ORF2. В штаммах саповируса, имеющих три открытые рамки считывания, стоп-кодон предшествует кодирующей области капсидного белка. Полипротеин, не включающий капсидный белок, кодируется ORF1, капсидный белок VP1 кодируется ORF2, а минорный структурный белок VP10 кодируется ORF3.

[0066] Расщепление полипротеина штамма Мс10 саповируса (инвентарный номер GenBank AY237420) с помощью 3С-подобной протеазы дает по меньшей мере десять разных продуктов: p11, р28, р35 (NTPase), р32, р14 (VPg), р70 (Pro-Pol), р60 (VP1). Полипротеин содержит полипептиды в порядке NH₂-p11-p28-NTPase-p32-VPg-p70(Pro-Pol)-VP1-COOH. Область p70 (Pro-Pol) полипротеина расположена в остатках 1056-1720, а область VP1 полипротеина расположена в остатках 1721-2278. Хотя приведенная выше нумерация относится к аминокислотной последовательности полипротеина штамма Мс10 саповируса, следует понимать, что соответствующие положения аминокислот в последовательностях, полученных из других генотипов и изолятов саповируса, также входят в объем настоящего изобретения. Любой из полипептидов, кодируемых ORF1, или полноразмерный полипротеин, VP1 или VP10, а также их варианты, иммуногенные фрагменты и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, варианты или иммуногенные фрагменты могут быть использованы на практике в рамках настоящего изобретения.

[0067] Также известны последовательности нуклеиновых кислот и белков нескольких изолятов саповируса. Репрезентативные последовательности саповируса представлены в SEQ ID NO: 1, 7, 14 и 20. Дополнительные репрезентативные последовательности, включая последовательности ORF1 и ORF2, а также кодируемые ими полипептиды из изолятов саповируса, перечислены в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI). См., например, записи GenBank: Sapovirus Мс10, номер доступа в GenBank NC-010624; вирус Саппоро, номер доступа в GenBank U65427; Саповирус Мс10, номер доступа в GenBank AY237420; Саповирус SaKaeo-15/Thailand, номер доступа в GenBank AY646855; вирус Саппоро, номер доступа в GenBank NC-006269; Саповирус С12, номер доступа в GenBank NC 006554; Саповирус С12, номер доступа в GenBank AY603425; саповирус Hu/Dresden/pJG-Sap01/DE, номер доступа в GenBank AY694184; калицивирус человека SLV/cruise ship/2000/США, номер доступа в GenBank AY289804; калицивирус человека SLV/Arg39, номер доступа в GenBank AY289803; штамм LL14 кишечного калицивируса свиней, номер доступа в GenBank AY425671; энтеральный калицивирус свиней, номер доступа в GenBank NC000940; штамм Мс37 калицивируса человека, номер доступа в GenBank AY237415; канадский штамм 151А кишечного калицивируса норки, номер доступа в GenBank AY144337; штамм SLV/Hou7-1181 калицивируса человека, номер доступа в GenBank AF435814; штамм SLV/Mex14917/2000 калицивируса человека, номер доступа в GenBank AF435813; штамм SLV/Мех340/1990 калицивируса человека, номер доступа в GenBank AF435812; энтеральный калицивирус свиней, номер доступа в GenBank AF182760; вирус Саппоро London/29845, номер доступа в GenBank U95645; манчестерский вирус Саппоро, номер доступа в GenBank Х86560; вирус Саппоро Houston/86, номер доступа в GenBank U95643; вирус Саппоро Houston/90, номер доступа в GenBank U95644; и штамм HuCV/Potsdam/2000/DEU калицивируса человека, номер доступа в GenBank AF294739; все эти последовательности (в соответствии с датой подачи настоящей заявки) включены в настоящее описание посредством ссылки.

[0068] В контексте настоящего описания термины «капсидный белок» или «капсидный полипептид» или «VP1» по отношению к саповирусу относятся к полипептиду, содержащему последовательность, гомологичную или идентичную капсидному полипептиду саповируса, и включают последовательности, идентичные его последовательности на по меньшей мере примерно 80-99,9%, включая любой процент идентичности в этом диапазоне, например 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%. Капсидный полипептид может кодироваться либо ORF1, либо ORF2 в зависимости от штамма саповируса. У некоторых штаммов саповирус имеет две открытые рамки считывания: капсидный белок кодируется ORF1 в виде части полипротеина, а минорный структурный белок (VP10) кодируется ORF2. В других штаммах саповирус имеет три открытые рамки считывания: стоп-кодон предшествует кодирующей области капсидного белка, который кодируется ORF2, а минорный структурный белок (VP10) кодируется ORF3.

[0069] В контексте настоящего описания термины «минорный структурный белок» или «минорный структурный полипептид» или «VP10» по отношению к саповирусу относятся к полипептиду, содержащему последовательность, гомологичную или идентичную полипептиду, кодируемому открытой рамкой считывания, следующей за кодирующей областью капсидного белка в геноме саповируса (либо ORF2, либо ORF3 в зависимости от штамма), и включают последовательности, идентичные его последовательности на по меньшей мере примерно 80-100%, включая любой процент идентичности в этом диапазоне, например 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,9%.

[0070] В контексте настоящего описания термин «полипротеин саповируса» относится к полипротеину, содержащему последовательность, гомологичную или идентичную полипротеину саповируса, кодируемому ORF1, и включает последовательности, идентичные на по меньшей мере примерно 80-100%, включая любой процент идентичности в этом диапазоне, например 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9%.

[0071] «Антиген» относится к молекуле, содержащей один или более эпитопов (линейных, конформационных или обоих типов), которые будут стимулировать иммунную систему хозяина к выработке гуморального и/или клеточного антигенспецифического ответа. Этот термин используется взаимозаменяемо с термином «иммуноген». Обычно В-клеточный эпитоп включает по меньшей мере примерно 5 аминокислот, но может состоять всего из 3-4 аминокислот. Т-клеточный эпитоп, такой как эпитоп CTL, будет включать по меньшей мере примерно 7-9 аминокислот, а эпитоп хелперных Т-клеток будет включать по меньшей мере примерно 12-20 аминокислот. Обычно эпитоп включает примерно от 7 до 15 аминокислот, например 9, 10, 12 или 15 аминокислот. Термин «антиген» обозначает как субъединичные антигены (т.е. антигены, которые отделены и обособлены от целого организма, с которым антиген связан в природе), так и убитые, аттенуированные или инактивированные бактерии, вирусы, грибы, паразиты или другие микробы. Антитела, такие как анти-идиотипические антитела или их фрагменты, и синтетические пептидные мимотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту, также подпадают под определение антигена в контексте настоящего описания. Аналогичным образом, олигонуклеотид или полинуклеотид, который экспрессирует антиген или антигенную детерминанту in vivo, например, в приложениях, относящихся к генной терапии и иммунизации с использованием ДНК, также включен в определение антигена в контексте настоящего описания.

[0072] Термин «антитело» охватывает препараты поликлональных и моноклональных антител, а также препараты, включающие гибридные антитела, измененные антитела, химерные антитела и гуманизированные антитела, а также молекулы гибридных (химерных) антител и любые функциональные фрагменты, полученные из таких молекул, при этом такие фрагменты сохраняют свойства специфического связывания молекулы родительского антитела.

[0073] Термины «гибридизироваться» и «гибридизация» относятся к образованию комплексов между нуклеотидными последовательностями, которые достаточно комплементарны для образования комплексов посредством спаривания оснований Уотсона-Крика. Когда праймер «гибридизируется» с мишенью (матрицей), такие комплексы (или гибриды) являются достаточно стабильными, чтобы выполнять функцию прайминга, необходимую, например, ДНК-полимеразе для инициации синтеза ДНК.

[0074] В настоящем описании термин «биологический образец» относится к образцу ткани или жидкости, выделенному из организма субъекта, включая, без ограничения, кровь, плазму, сыворотку, фекалии, мочу, костный мозг, желчь, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, образцы кожи, внешние выделения кожи, дыхательных, кишечных и мочеполовых путей, слезы, слюну, молоко, клетки крови, органы, образцы биопсии, а также образцы компонентов клеточной культуры in vitro, включая, без ограничения, в кондиционированной среде, полученной в результате роста клеток и тканей в культуральной среде, например, образцы рекомбинантных клеток и клеточных компонентов. В частности, саповирус можно получить из биологических образцов, таких как рвота или жидкий стул людей, инфицированных этими вирусами.

[0075] Под «субъектом» подразумевается любой представитель подтипа хордовых, включая, без ограничения, человека и других приматов, в том числе приматов, не являющихся человеком, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и мартышек; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы, олени и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничьих птиц, таких как куры, индейки и другие представители куриных, утки, гуси, дикие и охотничьи животные и т.п. Этот термин не относится к конкретному возрасту. Таким образом, он охватывает как взрослых, так и новорожденных.

[0076] Термины «вариант», «аналог» и «мутеин» относятся к биологически активным производным эталонной молекулы, которые сохраняют желаемую активность, такую как антигенная активность при индукции иммунного ответа против саповируса. В общем смысле, термины «вариант» и «аналог» относятся к соединениям, имеющим нативную полипептидную последовательность и структуру с добавлением одной или более аминокислот, замен (обычно консервативных по природе) и/или делеций по отношению к нативной молекуле, при условии, что модификации не разрушают биологическую активность нативной молекулы, и полученные соединения «по существу гомологичны» эталонной молекуле, как определено ниже. Как правило, аминокислотные последовательности таких аналогов будут иметь высокую степень гомологии последовательности с эталонной последовательностью, например, при выравнивании двух последовательностей гомология аминокислотных последовательностей будет составлять более 50%, как правило более 60-70%, более конкретно 80-85% или более, например, по меньшей мере 90%-95% или более. Часто аналоги будут включать такое же количество аминокислот, но будут включать замены, как раскрыто в настоящем описании. Термин «мутеин» дополнительно включает полипептиды, содержащие одну или более аминокислотоподобных молекул, включая, помимо прочего, соединения, содержащие только амино- и/или имино-молекулы, полипептиды, содержащие один или более аминокислотных аналогов (включая, например, неприродные аминокислоты и т.п.), полипептиды с замещенными связями, а также другими модификациями, известными в данной области, как встречающимися в природе, так и не встречающимися в природе (например, синтетические), циклизованные, разветвленные молекулы и т.п. Термин также включает молекулы, содержащие один или более N-замещенных остатков глицина («пептоид») и другие синтетические аминокислоты или пептиды. (См., например, патенты США №№5831005, 5877278 и 5977301). В вариантах осуществления аналог или мутеин обладает по меньшей мере такой же антигенной активностью, что и нативная молекула. Способы получения полипептидных аналогов и мутеинов известны в данной области техники и дополнительно описаны ниже.

[0077] Как пояснялось выше, аналоги обычно включают замены, которые являются консервативными по своей природе, т.е. такие замены, которые происходят внутри семейства аминокислот, родственных относительно своих боковых цепей. В частности, аминокислоты обычно делят на четыре семейства: (1) кислые аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные -глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда относят к ароматическим аминокислотам. Например, вполне предсказуемо, что отдельная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серии или подобная консервативная аминокислотная замена на структурно родственную аминокислоту не будет оказывать сильного влияния на биологическую активность. Например, представляющий интерес полипептид может включать примерно до 5-10 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или даже примерно до 15-25 консервативных или неконсервативных аминокислотных замен или любое целое число от 5 до 25, т.е. такое количество, при котором желаемая функция молекулы остается неизменной. Специалист в данной области может легко определить области в структуре представляющей интерес молекулы, которые могут быть устойчивыми к изменениям, используя графики Хоппа/Вудса и Кайта-Дулиттла, хорошо известные в данной области.

[0078] Термин «антиген, состоящий из множества слитых эпитопов» или «белок, состоящий из множества слитых эпитопов» в контексте настоящего описания означает полипептид, в котором множество антигенов саповируса являются частью одной непрерывной аминокислотной цепи, причем эта цепь не встречается в природе. Антигены саповируса могут быть связаны друг с другом непосредственно пептидными связями или могут быть разделены промежуточными аминокислотными последовательностями. Слитые антигены могут содержать полипептиды, кодируемые ORF1, кодируемые ORF2 и/или кодируемые ORF3, или их фрагменты, включая, например, последовательности полипептидов саповируса, такие как N-концевой белок, p11, р28, NTPase, р32, VPg, протеаза, полимераза, VP1 и VP10. Слитые антигены также могут содержать экзогенные, по отношению к саповирусу, последовательности. Более того, присутствующие последовательности могут принадлежать множеству генотипов и/или изолятов саповируса.

[0079] Под «терапевтически эффективным количеством» в контексте иммуногенных композиций понимают количество иммуногена (например, иммуногенного полипептида, слитого белка, полипротеина или нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген), которое будет индуцировать иммунологический ответ либо для генерации антител, либо для лечения или профилактики саповирусной инфекции. Такой ответ обычно приводит к развитию у субъекта антитело-опосредованного и/или секреторного или клеточного иммунного ответа на композицию. Обычно такая реакция включает, без ограничения, один или более из следующих эффектов: продуцирование антител любого иммунологического класса, например иммуноглобулинов A, D, Е, G или М; пролиферацию В- и Т-лимфоцитов; и обеспечение сигналов активации, роста и дифференцировки иммунологическим клеткам; увеличение популяций Т-хелперных Т-клеток, Т-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или популяций γ-, δ-Т-клеток.

[0080] Для целей настоящего изобретения «эффективным количеством» адъюванта будет такое количество, которое усиливает иммунологический ответ на совместно вводимый антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую этот антиген.

[0081] В настоящем описании термин «лечение» относится к любому из следующего: (i) предотвращению инфицирования или повторного заражения, как в случае традиционной вакцины, (ii) уменьшению или устранению симптомов и (iii) существенному или полному устранению рассматриваемого патогена. Лечение может осуществляться с целью профилактики (до заражения) или терапии (после заражения).

[0082] Перед подробным описанием настоящего изобретения, следует указать, что при практическом применении настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, традиционные методы вирусологии, микробиологии, молекулярной биологии, методы рекомбинантной ДНК и иммунологии, все из которых находятся в пределах компетентности обычного специалиста в данной области техники. Такие методы подробно описаны в литературе. Хотя при практическом применении настоящего изобретения в том виде, как оно заявлено, можно использовать ряд способов и материалов, аналогичных или эквивалентных приведенным здесь, в настоящем описании раскрыты материалы и способы.

[0083] Настоящее изобретение относится к композициям и способам иммунизации субъекта против саповирусной инфекции. Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие капсидные белки и/или другие иммуногенные полипептиды, происходящие от одного или более штаммов саповируса, композициям, содержащим иммуногенные полипептиды, полученные из одного или более штаммов саповируса. Иммуногенные полипептиды, используемые на практике в рамках настоящего изобретения, могут включать полипептиды, полученные из саповируса, включая полипептиды, кодируемые ORF1, полипептиды, кодируемые ORF2, полипептиды, кодируемые ORF3, антигены, состоящие из множества слитых эпитопов, и/или полипротеины, кодируемые ORF1. Кроме того, иммуногенные композиции могут содержать один или более адъювантов или нуклеиновых кислот, кодирующих адъюванты, где иммуногенные полипептиды смешаны или коэкспрессируются с адъювантами. Иммуногенные композиции могут также содержать дополнительные антигены, отличные от антигенов саповируса, такие как антигены, которые можно использовать при иммунизации против патогенов, вызывающих диарейные заболевания.

[0084] Для дальнейшего понимания раскрытого изобретения ниже представлено более подробное описание получения нуклеиновых кислот и полипептидов для использования в иммуногенных композициях и способах применения таких композиций при лечении или профилактике саповирусной инфекции.

Структурные полипептиды, неструктурные полипептиды и полипротеины

[0085] Иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем описании, могут содержать один или более полипептидов, полученных из одного или более генотипов и/или изолятов саповируса. Полипептиды, которые можно использовать на практике в рамках настоящего изобретения, включают структурные белки, неструктурные белки и полипротеины. Такие полипептиды могут представлять собой полноразмерные белки или их варианты или иммуногенные фрагменты, способные вызывать иммунный ответ на саповирус.

[0086] Расщепление полипротеина штамма Мс10 саповируса (инвентарный номер в GenBank AY237420), например, с помощью 3С-подобной протеазы дает по меньшей мере десять разных продуктов: p11, р28, р35 (NTPase), р32, р14 (VPg), р70 (Pro-Pol), р60 (VP1). Первоначальный протеолитический процессинг дает фрагменты р66 (р28-р35), р46 (р32-р14) и р120 (p32-p14-р70). Полипротеин содержит полипептиды в порядке NH2-p11-p28-NTPase-p32-VPg-р70(Pro-Pol)-VP1-COOH. Область р70 (Pro-Pol) полипротеина расположена в остатках 1056-1720, а область VP1 полипротеина расположена в остатках 1721-2278 (нумерация соответствует номеру доступа в GenBank AY237420).

[0087] Также определены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности нескольких штаммов и изолятов саповирусов, включая последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности структурных белков VP1 и VP10 и различных областей полипротеинов саповируса, включая гены p11, р28, NTPase, р32, VPg, р70 (Pro-Pol), VP1 и полипептиды.

[0088] Полипептиды в иммуногенных композициях могут кодироваться любым участком генома саповируса. В иммуногенные композиции может быть включено множество полипептидов. Такие композиции могут содержать полипептиды из одного и того же изолята саповируса или из разных штаммов и изолятов, включая изоляты, имеющие любой из различных генотипов саповируса, для обеспечения повышенной защиты от широкого спектра генотипов саповируса. Известно множество вирусных штаммов саповируса, и в иммуногенных композициях можно использовать множество полипептидов, содержащих эпитопы, полученные из любого из этих штаммов.

[0089] Антигены, используемые в иммуногенных композициях по настоящему изобретению, могут присутствовать в композиции в виде индивидуальных отдельных полипептидов. Как правило, рекомбинантные белки по настоящему изобретению экспрессируются в виде GST-слитого белка и/или His-меченного слитого белка.

Мультиэпитопные слитые белки

[0090] Иммуногенные композиции, представленные в настоящем описании, также могут содержать белки, состоящие из множества слитых эпитопов. См., например, международную публикацию WO 97/44469, патент США №6632601, патент США №6630298, патент США №6514731 и патент США №6797809, которые включены в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки. Такие слитые белки включают множественные эпитопы, полученные из двух или более вирусных полипептидов одного или более генотипов и/или изолятов саповируса. Белки, состоящие из множества слитых эпитопов, обладают двумя принципиальными преимуществами: во-первых, полипептид, который сам по себе может быть нестабильным или плохо экспрессируемым, может быть улучшен путем добавления подходящего гибридного партнера, который решает эту проблему; во-вторых, упрощается коммерческое производство, поскольку для получения двух полипептидов, оба из которых являются антигенно полезными, потребуется только один этап экспрессию и очистки.

[0091] Мультиэпитопные слитые белки могут содержать один или более различных доменов полипротеинов саповируса, полноразмерные полипротеины, VP1 (также называемый в настоящем описании капсидным белком) и/или VP10 (также называемый в настоящем описании минорным структурным белком саповируса); или их фрагменты, полученные из одного или более изолятов саповируса. Полипептиды в слитых белках могут быть получены из одного и того же изолята саповируса или из разных штаммов и изолятов, включая изоляты, имеющие любой из различных генотипов саповируса, для обеспечения повышенной защиты от широкого спектра генотипов саповируса. Известно множество вирусных штаммов саповируса, и в слитом белке можно использовать эпитопы, полученные из любого из этих штаммов.

[0092] Хорошо известно, что любой конкретный вид организма изменяется от одного индивидуального организма к другому и, кроме того, конкретный организм, такой как вирус, может иметь несколько разных штаммов. Например, как пояснялось выше, саповирус включает по меньшей мере пять геногрупп (G1-GV). Каждый штамм включает несколько антигенных детерминант, которые находятся в гомологичных областях, присутствующих во всех штаммах саповирусов, но имеют незначительные отличия одного вирусного штамма от другого. Таким образом, антиген из множества слитых эпитопов может включать множество полипептидов из разных вирусных штаммов саповируса, каждый из которых содержит конкретную гомологичную область, при этом каждый из них имеет отличную от других форму антигенной детерминанты. В целом, антигенные детерминанты при выравнивании могут иметь высокую степень гомологии с точки зрения аминокислотной последовательности, причем степень гомологии обычно составляет 30% или более, 40% или более. Слитый белок также может содержать несколько копий эпитопа, при этом один или более полипептидов слитого белка могут содержать последовательности, содержащие точные копии одного и того же эпитопа. Помимо этого, полипептиды могут быть выбраны на основе конкретных вирусных клад, эндемичных в конкретных географических регионах, где будут использоваться вакцинные композиции, содержащие гибридные соединения. Совершенно очевидно, что рассматриваемые продукты слияния обеспечивают эффективные средства лечения саповирусной инфекции в самых разных контекстах.

[0093] Антигены, состоящие из множества слитых эпитопов, могут быть представлены формулой NH₂-A-{-X-L-}_n-В-СООН, где: X представляет собой аминокислотную последовательность саповирусного антигена или его фрагмента; L представляет собой необязательную аминокислотную последовательность линкера; А представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность; В представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность; и n равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

[0094] Если фрагмент -Х- имеет лидерную пептидную последовательность дикого типа, она может быть включена или исключена из антигена, состоящего из множества слитых эпитопов. В некоторых вариантах осуществления лидерные пептиды будут удалены, за исключением пептида фрагмента -Х-, расположенного на N-конце гибридного белка, т.е. лидерный пептид у X₁ будет сохранен, но лидерные пептиды у Х₂…X_n не будут включены. Это эквивалентно удалению всех лидерных пептидов и использованию лидерного пептида фрагмента X₁ в качестве фрагмента -А-.

[0095] Для каждого n экземпляров (-X-L-) линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, когда n=2, гибрид может представлять собой NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH, NH₂-X₁-X₂-COOH, NH₂-X₁-L₁-X₂ - COOH, NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH и т.п. Аминокислотная(ые) последовательность(и) линкера -L- обычно будет(ут) короткой(ими), например, состоящей(ими) из 20 или менее аминокислот (т.е. 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование, полиглициновые линкеры (Gly, где n=2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) и гистидиновые метки (His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более). Специалистам в данной области будут очевидны другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности. Полезным линкером является GSGGGG, при этом дипептид Gly-Ser образуется из сайта рестрикции BamHI, что облегчает клонирование и манипуляции, а тетрапептид (Gly)₄ является типичным полиглициновым линкером. Кроме того, также могут быть добавлены последовательности субстрата протеазы (например, протеаза TEV: ENLYFQG).

[0096] -А- представляет собой необязательную N-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она состоит из нескольких аминокислот, например, 40 или менее (т.е. 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для управления транспортировкой белка или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновая метка His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Специалистам в данной области будут очевидны другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности. Если у X₁ отсутствует собственный N-концевой метионин, -А- представляет собой олигопептид (например, с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 аминокислотами), который обеспечивает N-концевой метионин.

[0097] -В- представляет собой необязательную С-концевую аминокислотную последовательность. Обычно она состоит из нескольких аминокислот, например, 40 или менее (т.е. 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности, регулирующие транспортировку белка, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, His_n, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) или последовательности, которые повышают стабильность белка. Специалистам в данной области техники будут очевидны и другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности, с учетом того, что такие последовательности His_n могут быть удалены, если им предшествует последовательность субстрата протеазы TEV (например, ENLYFQGHis_n).

[0098] Отдельные антигены иммуногенной композиции в антигене, состоящем из множества слитых эпитопов (отдельных фрагментов -Х-), могут происходить из одного или более штаммов или из одного или более М-типов. Например, когда n=2, Х₂ может происходить из того же штамма или типа, что и Х₁, или из другого штамма или типа. Если n=3, штаммы могут быть следующими: (i) X₁=X₂=X₃, (ii) X₁=X₂ не равно Х₃, (iii) X₁ не равно Х₂=Х₃, (iv) X₁ не равно Х₂ не равно Х₃, или (v) X₁=X₃ не равно Х₂, и т.п.

[0099] Если используются антигены, состоящие из множества слитых эпитопов, отдельные антигены в слитом белке (т.е. отдельные фрагменты --Х-) могут происходить из одного или более штаммов. Например, когда n=2, Х₂ может происходить из того же штамма, что и X₁, или из другого штамма. Если n=3, штаммы могут быть следующими: (i) X₁=X₂=X₃ (ii) X₁=X₂ не равно Х₃ (iii) X₁ не равно Х₂=Х₃ (iv) X₁ не равно Х₂ не равно Х₃ или (v) X₁=X₃ не равно Х₂ и т.п.

[00100] Соответственно, в вариантах осуществления могут присутствовать антигенные детерминанты из разных штаммов саповируса. Репрезентативные мультиэпитопные слитые белки для использования в настоящем изобретении, содержащие полипептиды, полученные из изолятов саповируса, обсуждаются ниже. Однако следует понимать, что мультиэпитопные слитые белки, содержащие другие эпитопы, полученные из геномов саповирусов, или мультиэпитопные слитые белки, содержащие разные расположения эпитопов, также найдут применение в описанных иммуногенных композициях.

[00101] В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит один или более капсидных и/или минорных структурных полипептидов из одного или более изолятов саповируса.

[00102] В другом варианте осуществления слитый белок содержит полипептиды VP1 из более чем одного штамма саповируса (например, VP1_Sapporo-VP1_London/ 29845, VP1_London/29845-VP1_Manchester-VP1_Sapporo, VP1_Manchester-VP1_Parkville-VP1_Sapporo-VP1_London/29845, VP1_Parkville-VP1_Houston/ 90-VP1_Houston/86-VP1_Manchester-VP1_Sapporo).

[00103] Во всех продуктах слияния, представленных в настоящем описании, вирусные области не обязательно должны располагаться в том порядке, в котором они встречаются в природе. Более того, каждая из областей может быть получена из одного и того же или разных изолятов саповируса. Различные полипептиды саповируса, присутствующие в различных продуктах слияния, описанных выше, могут представлять собой либо полноразмерные полипептиды, либо их части.

[00104] При желании слитые белки или отдельные компоненты этих белков также могут содержать другие аминокислотные последовательности, такие как аминокислотные линкеры или сигнальные последовательности, а также лиганды, полезные при очистке белков, такие как глутатион-S-трансфераза и стафилококковый белок А.

Пуклеиновые кислоты

[00105] Нуклеиновые кислоты, предназначенные для использования, как раскрыто в настоящем описании, например, при производстве полипептидов, могут быть получены из любой из различных областей генома саповируса, включая любую из областей ORF1, ORF2 или ORF3. Здесь перечислены репрезентативные последовательности изолятов саповируса. Таким образом, нуклеиновые кислоты, предназначенные для использования, как раскрыто в настоящем описании, включают нуклеиновые кислоты, которые получены из одной или более последовательностей любого генотипа или изолята патогенного саповируса.

[00106] Известны репрезентативные последовательности саповируса, включая SEQ ID NO: 1, 7, 14 и 20. Репрезентативными последовательностями саповируса являются вирус Саппоро London/29845, номер доступа в GenBank U95645, вирус Parkville, номер доступа в GenBank AF294739; и вирус Саппоро Houston/86, номер доступа в GenBank U95643.

[00107] Любая из этих последовательностей, а также их фрагменты и варианты, которые можно использовать при иммунизации нуклеиновыми кислотами для индукции иммунного ответа на саповирус, найдут применение в настоящих способах. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает варианты вышеуказанных последовательностей, которые идентичны им на по меньшей мере примерно 80-100%, включая любой процент идентичности в этом диапазоне, например 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99, 9%.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим иммуногенные фрагменты полипептида саповируса, полученные из любой из вышеуказанных последовательностей или их варианта. Полинуклеотиды также могут содержать встречающиеся в природе последовательности, кодирующие полипептиды, или могут представлять собой искусственные последовательности, не встречающиеся в природе.

[00108] Полинуклеотиды могут содержать не весь геном саповируса или, альтернативно, могут включать последовательность полной геномной РНК вируса. Например, полинуклеотиды могут содержать одну или более последовательностей из областей ORF1, ORF2 и ORF3 генома саповируса. Полинуклеотиды также могут содержать полную геномную РНК вируса или неполную геномную РНК вируса из нескольких генотипов и/или изолятов саповируса.

[00109] В вариантах осуществления полинуклеотиды содержат последовательность ORF1, кодирующую полноразмерный полипротеин саповируса. В других вариантах осуществления полинуклеотиды содержат одну или более частей последовательности ORF1 саповируса.

[00110] В другом примере полинуклеотид может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую часть полипротеина саповируса.

[00111] В вариантах осуществления полинуклеотиды содержат последовательности, кодирующие один или более капсидных белков саповируса. Например, полинуклеотиды могут содержать одну или более последовательностей, кодирующих структурные белки (например, VP1, VP2, VP10) саповируса. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды содержат последовательности, кодирующие по меньшей мере два капсидных белка из множества генотипов и/или изолятов саповируса.

[00112] В вариантах осуществления полинуклеотиды содержат одну или более последовательностей саповируса, кодирующих капсидные белки одного или более изолятов саповируса. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды содержат одну или более последовательностей, кодирующих капсидные белки одного или более изолятов саповируса.

[00113] В вариантах осуществления настоящего изобретения предложены полинуклеотиды, кодирующие мультиэпитопный слитый белок, раскрытый в настоящем описании. Мультиэпитопные слитые белки могут содержать последовательности одного или более генотипов и/или изолятов саповируса.

[00114] Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть получены многими способами (например, путем химического синтеза, из геномных библиотек или библиотек кДНК, из самого организма и т.д.) и могут принимать различные формы (например, одноцепочечные, двухцепочечные, векторы, зонды и т.п.). В вариантах осуществления нуклеиновые кислоты получают по существу в чистом виде (т.е. по существу свободными от других нуклеиновых кислот клеток-хозяев или нуклеиновых кислот, не относящихся к клеткам-хозяевам).

[00115] Например, нуклеиновые кислоты могут быть получены путем скрининга кДНК и/или геномных библиотек из клеток, инфицированных вирусом, или путем получения гена из вектора, о котором известно, что он включает этот ген. Например, представляющие интерес полинуклеотиды могут быть выделены из геномной библиотеки, полученной из вирусной РНК, присутствующей, например, в образцах стула или рвоты инфицированного человека. Альтернативно, нуклеиновые кислоты саповируса могут быть выделены из организма инфицированных людей или других млекопитающих или из образцов стула или рвоты, собранных у инфицированных людей. Вирусы можно выращивать в клетках LLC-PK в присутствии кишечной жидкости, содержащей желчные кислоты. Для амплификации полинуклеотидов либо из геномной РНК саповируса, либо из кодирующей ее кДНК может быть использован метод амплификации, такой как ПЦР. Альтернативно, полинуклеотиды можно синтезировать в лаборатории, например, с использованием автоматического синтезатора. Нуклеотидную последовательность можно сконструировать с использованием соответствующих кодонов для получения конкретной желаемой аминокислотной последовательности. Обычно выбирают предпочтительные кодоны для предполагаемого хозяина, в котором будет экспрессироваться последовательность. Полная последовательность представляющего интерес полинуклеотида может быть собрана из перекрывающихся олигонуклеотидов, полученных стандартными способами, и собрана в полную кодирующую последовательность. Полинуклеотиды могут представлять собой РНК или одно- или двухцепочечную ДНК. В вариантах осуществления полинуклеотиды выделяют в чистом виде, не содержащем другие компоненты, такие как белки и липиды.

[00116] Таким образом, конкретные нуклеотидные последовательности могут быть получены из векторов, несущих желаемые последовательности, или могут быть синтезированы полностью или частично с помощью различных методов синтеза олигонуклеотидов, известных в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез и методы полимеразной цепной реакции (ПЦР), где это применимо. В частности, одним из способов получения нуклеотидных последовательностей, кодирующих желаемые последовательности, является отжиг комплементарных наборов перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов, полученных в обычном автоматизированном синтезаторе полинуклеотидов, с последующим лигированием соответствующей ДНК-лигазой и амплификацией лигированной нуклеотидной последовательности посредством ПЦР.

Продуцирование иммуногенных полипептидов

[00117] Полипептиды, раскрытые в настоящем описании, могут быть получены любым подходящим способом (например, рекомбинантной экспрессией, очисткой из клеточной культуры, химическим синтезом и т.п.) и в различных формах (например, нативных, слитых, негликозилированных, липидированных и т.п.). Такие полипептиды включают полипептиды природного происхождения, полипептиды, полученные рекомбинантный способом, полипептиды, полученные синтетическим способом, или полипептиды, полученные комбинацией этих способов. Способы получения таких полипептидов хорошо известны специалистам. Полипептиды получают по существу в чистой форме (т.е. по существу свободными от других белков клетки-хозяина или белков, не относящихся к клеткам-хозяевам).

[00118] Полипептиды могут быть успешно синтезированы химическим путем любым из нескольких способов, известных специалистам в области пептидов. Как правило, в этих способах используется последовательное добавление к растущей пептидной цепи одной или более аминокислот. Обычно либо амино, либо карбоксильная группа первой аминокислоты защищена подходящей защитной группой. Затем защищенную или дериватизированную аминокислоту можно либо присоединить к инертной твердой подложке, либо использовать в растворе путем добавления следующей аминокислоты в последовательности, имеющей комплементарную (амино- или карбоксильную) группу, защищенную соответствующим образом, в условиях, обеспечивающих образование амидной связи. После этого защитную группу удаляют из вновь добавленного аминокислотного остатка, и добавляют следующую аминокислоту (защищенную надлежащим образом) и т.д. После связывания желаемых аминокислот в правильную последовательность, любые оставшиеся защитные группы (и любую твердую подложку, если используются методы твердофазного синтеза) удаляют последовательно или одновременно с получением конечного полипептида. Путем простой модификации этой общей процедуры к растущей цепи можно добавлять более одной аминокислоты за один раз, например, путем связывания (в условиях, которые не приводят к рацемизации хиральных центров) защищенного трипептида с защищенным должным образом дипептидом с образованием пентапептида после снятия защиты.

[00119] Типичные защитные группы включают трет-бутилоксикарбонил (Boc), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), бензилоксикарбонил (Cbz); п-толуолсульфонил (Тх); 2,4-динитрофенил; бензил (Bzl); бифенилизопропилоксикарбоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, о-бромбензилоксикарбонил, циклогексил, изопропил, ацетил, о-нитрофенилсульфонил и т.п. Типичными твердыми подложками являются сшитые полимерные носители. Они могут включать полимеры на основе сшитого сополимера стирола с дивинилбензолом, например, сополимеры дивинилбензола и гидроксиметилстирола, сополимеры дивинилбензола и хлорметилстирола и сополимеры дивинилбензола и бензгидриламинополистирола.

[00120] Полипептиды по настоящему изобретению также могут быть химически получены другими способами, такими как способ множественного одновременного синтеза пептидов.

[00121] Альтернативно, описанные выше иммуногенные полипептиды, полипротеины и мультиэпитопные слитые белки могут быть получены рекомбинантным способом. После выделения или синтеза кодирующих последовательностей желаемых белков их можно клонировать в любой подходящий вектор или репликон для экспрессии. Специалистам в данной области известны многочисленные векторы клонирования, и подбор подходящего вектора клонирования является вопросом выбора. В данной области техники доступны разнообразные экспрессионные системы на основе бактерий, дрожжей, растений, млекопитающих и насекомых, и можно использовать любую такую экспрессионную систему. Необязательно, полинуклеотид, кодирующий эти белки, можно транслировать в бесклеточной трансляционной системе. Такие способы хорошо известны в данной области.

[00122] Примеры рекомбинантных ДНК-векторов для клонирования и клеток-хозяев, которые могут быть ими трансформированы, включают бактериофаг λ (Е. coli), pBR322 (Е. coli), pACYC177 (Е. coli), pKT230 (грамотрицательные бактерии), pGV1106 (грамотрицательные бактерии), pLAFR1 (грамотрицательные бактерии), рМЕ290 (грамотрицательные бактерии, не относящиеся к Е. coli), pHV14 (Е. coli и Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) и вирус бычьей папилломы (клетки млекопитающих).

[00123] Также могут быть использованы экспрессионные системы на основе клеток насекомых, такие как бакуловирусные системы, они известны специалистам в данной области и описаны, например, Summers и Smith в Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Материалы и методы для экспрессионных систем на основе бакуловирусов/клеток насекомых коммерчески доступны в виде наборов, помимо прочего, от Invitrogen, San Diego, СА (набор «МахВас»).

[00124] Для продуцирования иммуногенных белков также можно использовать растительные экспрессионные системы. Как правило, для трансфекции растительных клеток гетерологичными генами в таких системах используются векторы на основе вирусов.

[00125] Вирусные системы, такие как система инфекции/трансфекции на основе коровьей оспы, также можно использовать в рамках настоящего изобретения, раскрытым в настоящем описании. В этой системе клетки сначала трансфицируют in vitro рекомбинантным вирусом коровьей оспы, который кодирует РНК-полимеразу бактериофага Т7. Эта полимераза демонстрирует исключительную специфичность, поскольку она транскрибирует только матрицы, несущие промоторы Т7. После заражения клетки трансфицируют представляющей интерес ДНК, управляемой промотором Т7. Полимераза рекомбинантного вируса коровьей оспы, экспрессируемая в цитоплазме, транскрибирует трансфицированную ДНК в РНК, которая затем транслируется в белок с помощью трансляционного аппарата хозяина. Этот метод обеспечивает кратковременное цитоплазматическое продуцирование больших количеств РНК и продукта(ов) ее трансляции.

[00126] Ген может быть помещен под контроль промотора, сайта связывания рибосомы (для бактериальной экспрессии) и, необязательно, оператора (совместно называемых в настоящем описании «регуляторными» элементами) для транскрипции последовательности ДНК, кодирующей желаемый иммуногенный полипептид, в РНК в клетке-хозяине, трансформированной вектором, содержащим эту экспрессионную конструкцию. Кодирующая последовательность может содержать или может не содержать сигнальный пептид или лидерную последовательность. В рамках настоящего изобретения можно использовать как встречающиеся в природе сигнальные пептиды, так и гетерологичные последовательности. Лидерные последовательности могут быть удалены в организме хозяина в ходе посттрансляционной обработки. См., например, патенты США №№4431739; 4425437; 4338397, каждый из которых включен в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки. Такие последовательности включают, без ограничения, лидерную последовательность tpa, а также сигнальную последовательность меллитина медоносной пчелы.

[00127] Также могут быть желательны другие регуляторные последовательности, которые позволяют регулировать экспрессию белковых последовательностей относительно роста клетки-хозяина. Такие регуляторные последовательности известны специалистам в данной области, и примеры включают последовательности, которые вызывают включение или выключение экспрессии гена в ответ на химический или физический стимул, включая присутствие регуляторного соединения. В векторе также могут присутствовать другие типы регуляторных элементов, например, энхансерные последовательности.

[00128] Контрольные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью перед вставкой в вектор. Альтернативно, кодирующую последовательность можно клонировать непосредственно в вектор экспрессии, который уже содержит контрольные последовательности и соответствующий сайт рестрикции.

[00129] В вариантах осуществления может оказаться необходимым модифицировать кодирующую последовательность таким образом, чтобы ее можно было прикрепить к контрольным последовательностям с соответствующей ориентацией; т.е. сохранить правильную рамку считывания. Желательным также может быть получение мутантов или аналогов иммуногенных полипептидов. Мутанты или аналоги могут быть получены путем делеции части последовательности, кодирующей белок, путем вставки последовательности и/или путем замены одного или более нуклеотидов в последовательности. Методы модификации нуклеотидных последовательностей, такие как сайт-направленный мутагенез, хорошо известны специалистам в данной области.

[00130] Вектор экспрессии затем используют для трансформации соответствующей клетки-хозяина. В данной области известно несколько клеточных линий млекопитающих, которые включают иммортализованные клеточные линии, доступные из Американской коллекции типовых культур (АТСС), такие как, без ограничения, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка (см. ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2), а также другие. Аналогично, с раскрытыми в настоящем описании экспрессионными конструкциями могут быть использованы бактериальные хозяева, такие как Е. coli, Bacillus subtilis и Streptococcus spp. Дрожжи-хозяева, используемые в рамках настоящего изобретения, включают, без ограничения, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe и Yarrowia lipolytica. Клетки насекомых, которые можно использовать с векторами экспрессии на основе бакуловируса, включают, без ограничения, клетки Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni.

[00131] В зависимости от выбранной экспрессионной системы и хозяина белки, раскрытые в настоящем описании, продуцируются растущими клетками-хозяевами, трансформированными описанным выше вектором экспрессии, в условиях, обеспечивающих экспрессию представляющего интерес белка. Выбор подходящих условий для роста находится в компетенции специалиста в данной области. Затем клетки разрушают с помощью химических, физических или механических средств, лизирующих клетки, сохраняя при этом иммуногенные полипептиды саповируса практически нетронутыми. Внутриклеточные белки также можно получить путем удаления компонентов из клеточной стенки или мембраны, например, с помощью детергентов или органических растворителей, приводя в результате к утечке иммуногенных полипептидов.

[00132] Например, способы разрушения клеток, используемые в рамках настоящего изобретения, раскрытые в настоящем описании, включают, без ограничения: соникацию или обработку ультразвуком; перемешивание; жидкую или твердую экструзию; термическую обработку; замораживание-оттаивание; сушку; взрывную декомпрессию; осмотический шок; обработку литическими ферментами, включая протеазы, такие как трипсин, нейраминидаза и лизоцим; щелочную обработку; и использование детергентов и растворителей, таких как соли желчных кислот, додецилсульфат натрия, тритон, NP40 и CHAPS. Конкретный способ, используемый для разрушения клеток, во многом является вопросом выбора и будет зависеть от типа клеток, в которых экспрессируется полипептид, условий культивирования и любой используемой предварительной обработки.

[00133] После разрушения клеток клеточный дебрис удаляют, как правило, центрифугированием, а продуцированные внутри клетки иммуногенные полипептиды саповируса подвергают дальнейшей очистке стандартными способами очистки, такими как, без ограничения, колоночная хроматография, ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, электрофорез, ВЭЖХ, иммуноабсорбентные методы, аффинная хроматография, иммунопреципитация и т.п.

[00134] Например, один из способов получения внутриклеточных иммуногенных полипептидов саповируса, представленных в настоящем описании, включает аффинную очистку, например, с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием специфических антител. Выбор подходящей аффинной смолы находится в компетенции специалистов в данной области. После аффинной очистки иммуногенные полипептиды могут быть дополнительно очищены обычными способами, хорошо известными в данной области, например, любым описанным выше способом.

[00135] Может быть желательным продуцирование нескольких полипептидов одновременно (например, структурных и/или неструктурных белков из одного или более вирусных штаммов или вирусных полипептидов в комбинации с полипептидными адъювантами). Продуцирование двух или более разных полипептидов можно легко осуществить, например, путем котрансфекции клеток-хозяев конструкциями, кодирующими разные полипептиды. Котрансфекция может быть осуществлена либо в транс-, либо цис-форме, т.е. с использованием отдельных векторов или с использованием одного вектора, кодирующего полипептиды. Если используется один вектор, экспрессия полипептидов может управляться одним набором регуляторных элементов или, альтернативно, последовательности, кодирующие полипептиды, могут присутствовать в векторе в отдельных экспрессионных кассетах, регулируемых отдельными регуляторными элементами.

[00136] Полипептиды, раскрытые в настоящем описании, могут быть прикреплены к твердой подложке. Твердые подложки, которые можно использовать на практике в рамках настоящего изобретения, раскрытым в настоящем описании, включают субстраты, такие как нитроцеллюлоза (например, в форме мембраны или лунки для микротитрования); поливинилхлорид (например, листы или лунки для микротитрования); полистирольный латекс (например, гранулы или планшеты для микротитрования); поливинилидинфторид; диазотированная бумага; нейлоновые мембраны; активированные гранулы, магнитно-чувствительные гранулы и т.п.

[00137] Обычно сначала обеспечивают взаимодействие твердой подложки с твердофазным компонентом (например, одним или более антигенами саповируса) в подходящих условиях связывания, при которых происходит иммобилизация компонента на подложке в достаточной степени. Иногда иммобилизацию антигена на подложке можно усилить путем связывания антигена сначала с белком с улучшенными связывающими свойствами. Подходящие связывающие белки включают, без ограничения, макромолекулы, такие как сывороточные альбумины, включая альбумин бычьей сыворотки (BSA), гемоцианин улитки, молекулы иммуноглобулина, тиреоглобулин, овальбумин и другие белки, хорошо известные специалистам в данной области. Другие молекулы, которые можно использовать для связывания антигенов с подложкой, включают полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и т.п. Такие молекулы и способы связывания этих молекул с антигенами хорошо известны специалистам в данной области.

[00138] При желании полипептиды можно пометить традиционными методами. Подходящие метки включают флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²Р и ¹²⁵I), реагенты для определения электронной плотности, ферменты и лиганды, имеющие специфические партнеры по связыванию. Ферменты обычно детектируют по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно определяют по ее способности превращать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, который можно оценить количественно с помощью спектрофотометра. «Партнер по специфическому связыванию» относится к белку, который способен связываться с молекулой-лигандом с высокой специфичностью, как, например, в случае антигена и моноклонального антитела, специфичного к этому антигену. Другие партнеры по специфическому связыванию включают биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А, а также многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Могут быть использованы одна метка или комбинация меток, как раскрыто в настоящем описании.

[00139] Раскрытые в настоящем описании композиции, после их получения, можно вводить непосредственно субъекту (например, как описано выше) или, альтернативно, доставлять ex vivo в клетки, полученные от субъекта, с помощью описанных выше способов.

Иммуногенные композиции

[00140] Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим один или более иммуногенных полипептидов и/или полипротеинов, слитых с мультиэпитопными белками, раскрытыми в настоящем описании. В одном составе можно смешивать вместе различные полипептиды, полипротеины и белки, состоящие из множества слитых эпитопов. В таких комбинациях антиген иммуногенной композиции может присутствовать более чем в одном полипептиде или полипептиде с множественным эпитопом или полипротеине. В одном из аспектов иммуногенные композиции, содержащие саповирус VP1, включают лизаты экспрессируемых бакуловирусом клеток-хозяев насекомых. В родственном аспекте указанные лизаты подвергают различным уровням фракционирования или оставляют нефракционированными, при этом экспрессированный белок модифицируют или не модифицируют относительно его экспрессированного состояния (например, интактного с меткой His_n).

[00141] Иммуногенные композиции могут содержать смесь полипептидов, которые, в свою очередь, можно доставлять с помощью одного и того же или разных носителей. Антигены можно вводить отдельно или в комбинации, например, в виде профилактических (т.е. для предотвращения инфекции) или терапевтических (для лечения инфекции) иммуногенных композиций. Для достижения желаемых эффектов иммуногенную композицию можно вводить более одного раза (например, введение «примирующей дозы» с последующими одной или более «бустерными дозами»). Одну и ту же композицию можно вводить на одном или более этапах примирующей иммунизации и одном или более этапах бустерной иммунизации. Альтернативно, для примирующей иммунизации и бустерной иммунизации можно использовать разные композиции.

[00142] Иммуногенные композиции обычно включают один или более «фармацевтически приемлемых наполнителей или носителей», таких как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.п. Кроме того, в таких носителях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные вещества для регулирования рН и т.п.

[00143] Обычно, в дополнение к упомянутым выше компонентам иммуногенные композиции содержат один или более «фармацевтически приемлемых носителей». К ним относятся любые носители, которые сами не индуцируют выработку антител, вредных для индивидуума, получающего композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны специалистам в данной области. Композиция также может содержать разбавитель, такой как вода, физиологический раствор, глицерин и т.п. Кроме того, может присутствовать вспомогательное вещество, такое как смачивающий или эмульгирующий агент, буферное вещество для регулирования рН и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых компонентов доступно в Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20-е изд., ISBN: 0683306472.

[00144] В раскрытых в настоящем описании композициях также могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например, минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты или сульфаты, а также соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты или бензоаты. Особенно полезными белковыми субстратами являются сывороточные альбумины, гемоцианин улитки, молекулы иммуноглобулина, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный анатоксин и другие белки, хорошо известные специалистам в данной области. Описанные композиции также могут содержать жидкости или наполнители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, декстроза, этанол или т.п., отдельно или в комбинации, а также такие вещества, как смачивающие агенты, эмульгирующие агенты или буферные агенты для регулирования рН. Антигены также могут быть адсорбированы, захвачены или иным образом связаны с липосомами и дисперсными носителями, такими как PLG.

[00145] Антигены могут быть конъюгированы с белком-носителем для повышения иммуногенности. Это особенно полезно в композициях, в которых используется сахаридный или углеводный антиген.

[00146] Белки-носители могут включать, без ограничения, бактериальные токсины или токсоиды, такие как дифтерийный или столбнячный анатоксины. Можно использовать дифтерийный анатоксин CRM₁₉₇. Другие полипептиды-носители включают белок внешней мембраны N. meningitidis (ЕР-А-0372501), синтетические пептиды (ЕР-А-0378881 и ЕР-А-0427347), белки теплового шока (WO 93/17712 и WO 94/03208), белки pertussis (WO 98/58668 и ЕР-А-0471177), белок D из Н. influenzae (WO 00/56360), цитокины (WO 91/01146), лимфокины, гормоны, факторы роста, токсин А или В из С.difficile (WO 00/61761), белки, поглощающие железо, такие как белки-переносчики (WO 01/72337), и т.д. Если смесь содержит капсульный сахарид обеих серогрупп А и С, то соотношение (мас./мас.) сахарид MenA:сахарид MenC превышает 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Разные сахариды могут быть конъюгированы с одним и тем же или с разными типами белка-носителя. При необходимости, можно использовать любую подходящую реакцию конъюгации с любым подходящим линкером.

[00147] Иммуногенные композиции, включая описанные вакцины, можно вводить в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами. Например, вакцина, раскрытая в настоящем документе, может включать адъювант. Адъюванты включают, без ограничения, один или более из описанных ниже адъювантов.

Минерал-содержащие композиции

[00148] Композиции, содержащие минералы, подходящие для использования в качестве адъювантов, раскрытых в настоящем описании, включают минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Соли, раскрытые в настоящем описании, включают минеральные соли, такие как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.п., или смеси различных минеральных соединений (например, смесь фосфата и гидроксидного адъюванта, необязательно с избытком фосфата), при этом соединения имеют любую подходящую форму (например, гелевую, кристаллическую, аморфную и т.п.). Композиции, содержащие минералы, также могут быть составлены в виде частиц соли металла (WO 00/23105).

[0 014 9] Соли алюминия могут быть включены в вакцины таким образом, чтобы доза Al³⁺ составляла от 0,2 до 1,0 мг на дозу.

[00150] В вариантах осуществления адъювантом на основе алюминия для использования, как раскрыто в настоящем описании, являются квасцы (сульфат алюминия-калия (AlK(SO₄)₂)) или производное квасцов, например, образующееся in situ путем смешивания антигена в фосфатном буфере с квасцами с последующим титрованием и осаждением основанием, таким как гидроксид аммония или гидроксид натрия.

[00151] Другим адъювантом на основе алюминия для использования в вакцинных составах по настоящему изобретению является адъювант на основе гидроксида алюминия (Al(ОН)₃) или кристаллический оксигидроксид алюминия (AlOOH), который представляет собой превосходный адсорбент с площадью поверхности приблизительно 500 м²/г. Альтернативно предлагается адъювант на основе фосфата алюминия (AlPO₄) или гидроксифосфат алюминия, который содержит фосфатные группы вместо некоторых или всех гидроксильных групп адъюванта на основе гидроксида алюминия. В вариантах осуществления предлагаемые в настоящем изобретении адъюванты на основе фосфата алюминия являются аморфными и растворимыми в кислых, основных и нейтральных средах.

[00152] В вариантах осуществления изобретения адъювант, раскрытый в настоящем описании, содержит как фосфат алюминия, так и гидроксид алюминия. В одном из аспектов содержание фосфата алюминия в адъюванте выше, чем гидроксида алюминия, где массовое соотношение фосфата алюминия к гидроксиду алюминия составляет, например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или более 9:1. Еще более конкретно, соли алюминия в вакцине присутствуют в количестве от 0,4 до 1,0 мг на дозу вакцины, или от 0,4 до 0,8 мг на дозу вакцины, или от 0,5 до 0,7 мг на дозу вакцины, или примерно 0,6 мг на дозу вакцины.

[00153] Как правило, адъювант(ы) на основе алюминия или соотношение нескольких адъювантов на основе алюминия, таких как фосфат алюминия и гидроксид алюминия, выбирают путем оптимизации электростатического притяжения между молекулами таким образом, чтобы антиген нес заряд, противоположный заряду адъюванта при желаемом рН. Например, при рН 7,4 адъювант на основе фосфата алюминия (iep=4) адсорбирует лизоцим, но не альбумин. Если целью является альбумин, следует выбрать адъювант на основе гидроксида алюминия (т.е. 11,4). Альтернативно, предварительная обработка гидроксида алюминия фосфатом снижает его изоэлектрическую точку, что делает его предпочтительным адъювантом для более основных антигенов.

Масляные эмульсии

[00154] Масляно-эмульсионные композиции, подходящие для использования в качестве адъювантов, могут включать водно-скваленовые эмульсии, такие как MF59 (5% сквалена, 0,5% TWEEN 80™ и 0,5% SPAN 85™, полученные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлюидизатора). См. WO 90/14837. MF59 используется в качестве адъюванта в трехвалентной субъединичной вакцине FLUAD™ против вируса гриппа.

[00155] В частности, адъювантами для использования в композициях являются субмикронные эмульсии масло-в-воде. Субмикронные эмульсии масло-в-воде для использования в настоящем изобретении могут представлять собой эмульсии сквален/вода, необязательно содержащие различные количества МТР-РЕ, такие как субмикронная эмульсия масло-в-воде, содержащая 4-5% мас./об. сквалена, 0,25-1,0% мас./об. TWEEN 80™ (моноолеат полиоксиэтиленсорбитан) и/или 0,25-1,0% SPAN 85™ (триолеат сорбитан) и, необязательно, N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглуатминил-L-аланин-2-(β-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), например, субмикронная эмульсия масло-в-воде, известная как «MF59» (международная публикация WO 90/14837; патенты США №№6299884 и 6451325). MF59 содержит 4-5% мас./об. сквалена (например, 4,3%), 0,25-0,5% мас./об. TWEEN 80™ и 0,5% мас./об. SPAN 85™ и необязательно различные количества МТР-РЕ, состав которой получают в виде субмикронных частиц с помощью микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели HOY (Microfluidics, Newton, Mass.). Например, МТР-РЕ может присутствовать в количестве примерно 0-500 мкг/доза, 0-250 мкг/доза и 0-100 мкг/доза. Используемый в настоящем описании термин «MF59-0» относится к указанной выше субмикронной эмульсии масло-в-воде, не содержащей МТР-РЕ, тогда как термин MF59-MTP обозначает состав, который содержит МТР-РЕ. Например, «MF59-100» содержит 100 мкг МТР-РЕ на дозу и т.д. MF69 является еще одной субмикронной эмульсией масло-в-воде, используемой в настоящем изобретении, которая содержит 4,3% мас./об. сквалена, 0,25% мас./об. TWEEN 80™ и 0,75% мас./об. SPAN 85™ и необязательно МТР-РЕ. Еще одной субмикронной эмульсией масло-в-воде является MF75, также известная как SAF, которая содержит 10% сквалена, 0,4% TWEEN 80™, 5% блокированного плюроником полимера L121 и thr-MDP, и которая также микрофлюидизирована в субмикронную эмульсию. MF75-MTP обозначает состав MF75, который включает МТР, например, в количестве от 100 до 400 мкг МТР-РЕ на дозу.

[00156] Субмикронные эмульсии масло-в-воде, способы их получения и иммуностимулирующие агенты, такие как мурамиловые пептиды, для использования в композициях, подробно описаны в международной публикации WO 90/148 37 и патентах США №№6299884 и 6451325.

[00157] В качестве адъювантов также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).

Сапониновые составы

[00158] В качестве адъювантов также можно использовать составы на основе сапонинов. Сапонины представляют собой гетерологичную группу стеролгликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветах широкого спектра видов растений. Широкие исследования проводятся по изучению сапонинов, выделенных из коры дерева Quillaia saponaria Molina, в качестве адъювантов. Сапонины также могут быть коммерчески получены из Smilax ornata (сарсаприллы), Gypsophilla paniculata (фата невесты) и Saponaria officianalis (мыльный корень). Составы сапонинового адъюванта включают очищенные составы, такие как QS21, а также липидные составы, такие как ISCOM.

[00159] Композиции на основе сапонинов были очищены с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии (HP-TLC) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC). С помощью этих методов были идентифицированы конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-А, QH-B и QH-C. В вариантах осуществления сапонин представляет собой QS21. Способ получения QS21 раскрыт в патенте США №5057540. Составы на основе сапонинов также могут содержать стерол, такой как холестерин (см. WO 96/33739).

[00160] Комбинации сапонинов и холестеринов можно использовать для образования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM). ISCOM обычно также включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. В ISCOM можно использовать любой известный сапонин. В вариантах осуществления ISCOM включает один или более из Quil A, QHA и QHC. ISCOM дополнительно описаны в ЕР0109942, WO 96/11711 и WO 96/33739. В составе ISCOMS необязательно могут отсутствовать дополнительные детергенты. См. WO 00/07621. Бактериальные или микробные производные

[00161] Адъюванты, подходящие для использования, как раскрыто в настоящем описании, включают бактериальные или микробные производные, такие как:

[00162] (1) Нетоксичные производные энтеробактериальных липополисахаридов (LP).

[00163] Такие производные включают монофосфориллипид А (MPL) и 3-О-деацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-De-О-ацилированного монофосфориллипида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Одна из форм «малых частиц» 3-De-O-ацилированного монофосфориллипида А раскрыта в ЕР 0689454. Такие «малые частицы» 3dMPL имеют достаточно малый размер, чтобы их можно было стерильно фильтровать через мембрану с размером пор 0,22 микрона (см. ЕР 0689454). Другие нетоксичные производные LPS включают имитаторы монофосфориллипида А, такие как аминоалкилглюкозаминидфосфатные производные, например, RC-52 9.

[00164] (2) Производные липида А.

[00165] Производные липида А включают производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174.

[00166] (3) Иммуностимулирующие олигонуклеотиды.

[00167] Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, подходящие для использования в качестве адъювантов, могут включать нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (последовательность, содержащую неметилированный цитозин, за которым следует гуанозин, и связанную фосфатной связью). Также было показано, что бактериальные двухцепочечные РНК или олигонуклеотиды, содержащие палиндромные или поли(dC) последовательности, обладают иммуностимулирующим действием.

[00168] CpG могут включать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Гуанозин необязательно может быть замещен аналогом, таким как 2'-дезокси-7-деазагуанозин.

[00169] Последовательность CpG может быть направлена на TLR9, например, мотив GTCGTT или TTCGTT. Последовательность CpG может быть специфичной для индукции Th1-зависимого иммунного ответа, такая как CpG-A ODN, или она может быть более специфичной для индукции В-клеточного ответа, такая как CpG-B ODN. В вариантах осуществления CpG представляет собой CpG-A ODN.

[00170] В вариантах осуществления CpG-олигонуклеотид может быть сконструирован таким образом, чтобы его 5'-конец был доступен для распознавания рецептором. К его 3'-концу необязательно могут быть присоединены две олигонуклеотидные последовательности CpG с образованием «иммуномеров».

[00171] (4) АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксицированные производные.

[00172] В качестве адъювантов можно использовать бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксицированные производные. В вариантах осуществления белок может быть получен из Е. coli (т.е. термолабильный энтеротоксин Е. coli «LT»), холеры («СТ») или коклюша («РТ»). Использование детоксицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозных адъювантов описано в WO 95/17211, а в качестве парентеральных адъювантов - в WO 98/42375. В вариантах осуществления адъювант представляет собой детоксицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LTR192G.

Биоадгезивы и мукоадгезивы

[00173] В качестве адъювантов также могут быть использованы биоадгезивы и мукоадгезивы. Подходящие биоадгезивы включают микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты или мукоадгезивы, такие как сшитые производные полиакриловой кислоты, поливиниловый спирт, поливинилпирлидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлозу. В качестве адъювантов также можно использовать хитозан и его производные. Например, WO99/27 960.

Мурамиловые пептиды

[0017 4] Примеры мурамиловых пептидов, подходящих для использования в качестве адъювантов, включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-норммурамил-1-аланил-d-изоглутамин (nor-MDP) и N-ацетилмурамил-1-аланил-d-изоглутаминил-1-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-s-н-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ).

Имидазохинолиновые соединения.

[00175] Примеры имидазохинолиновых соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов, включают имихимод и его аналоги (см., например, патенты США №№4689338, 5389640, 5268376, 4929624, 5266575, 5352784, 5494916, 5482936, 5346905, 5395937, 5238944 и 5525612).

Тиосемикарбазоновые соединения.

[00176] Примеры тиосемикарбазоновых соединений, а также способы получения составов, производства и скрининга соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов, включают способы, описанные в WO 04/60308. Тиосемикарбазоны особенно эффективны при стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для выработки цитокинов, таких как TNF-α.

Триптантриновые соединения.

[00177] Примеры триптантриновых соединений, а также способы получения составов, производства и скрининга соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов, раскрытых в настоящем описании, включают способы, описанные в WO 04/64759. Триптантриновые соединения особенно эффективны при стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для выработки цитокинов, таких как TNF-α.

[00178] К композициям, раскрытым в настоящем описании, могут быть применены комбинации аспектов одного или более идентифицированных выше адъювантов. Например, могут быть использованы следующие адъювантные композиции:

[00179] (1) сапонин и эмульсия масло-в-воде (WO 99/11241); (2) сапонин (например, QS21)+нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) (см. WO 94/00153); (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно, + стерин) (WO 98/57659); (5) комбинации 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями масло-в-воде (см. заявки на европейские патенты 0835318, 0735898 и 0761231); (6) SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% TWEEN 80™, 5% плюроник-содержащего полимера L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный до субмикронной эмульсии, либо подвергнутый встряхиванию с получением эмульсии частиц более крупного размера; (7) адъювантная система RIBI™ (RAS), (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквалена, 0,2% TWEEN 80™ и один или более компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфорилипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), MPL + CWS (DETOX™); и (8) одна или более минеральных солей (таких как соль алюминия) + нетоксичное производное LPS (такое как 3dPML); (9) одна или более минеральных солей (таких как соль алюминия) и один или более иммуностимулирующих олигонуклеотидов (таких как нуклеотидная последовательность, включающая мотив CpG) и один или более детоксицированных АДФ-рибозилирующих токсинов (таких как LT-K63 и LT-P72).

Дополнительные антигены

[00180] Композиции, раскрытые в настоящем описании, необязательно могут содержать один или более дополнительных полипептидных антигенов, которые получены не из белков саповируса. Такие антигены включают бактериальные, вирусные или паразитарные антигены.

[00181] В некоторых вариантах осуществления антиген саповируса комбинируют с одним или более антигенами, включая, без ограничения, антигены, полученные из бактерий или вирусов, таких как ортомиксовирус (грипп), пневмовирус (RSV), парамиксовирус (PIV и Mumps), морбилливирус (корь), тогавирус (краснуха), энтеровирус (полиомиелит), вирус гепатита В, коронавирус (SARS) и вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A), Moraxella cataralis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani (столбняк), Cornynebacterium diphtheriae (дифтерия), Haemophilus influenzae В (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) и E.coli.

[00182] В других вариантах осуществления антиген саповируса комбинируют с одним или более антигенами, включая, без ограничения, Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A), Moraxella cataralis, Bordetella pertussis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Clostridium tetani (столбняк), Cornynebacterium diphtheriae (дифтерия), Haemophilus influenzae В (Hib), Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В), Enterococcus faecalis, Helicobacter pylori, Clamydia pneumoniae, ортомиксовирус (грипп), пневмовирус (RSV), парамиксовирус (PIV и Mumps), морбилливирус (корь), тогавирус (краснуха), энтеровирус (полиомиелит), HBV, коронавирус (SARS), вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (CMV).

[00183] В других вариантах осуществления антиген саповируса комбинируют с одним или более антигенами, которые можно использовать в вакцине, предназначенной для защиты индивидуумов от патогенов, вызывающих диарейные заболевания. Такие антигены включают, без ограничения, ротавирус, Shigella spp., энтеротоксигенные антигены Escherichia coli (ЕТЕС), антигены Vibrio cholerae и Campylobacter jejuni. В вариантах осуществления один или более антигенов норовируса (Norovirus) могут быть получены из вируса Norwalk, вируса Snow Mountain и/или вируса Hawaii и объединены с антигеном ротавируса в иммуногенной композиции.

[00184] Антигены, которые могут найти применение в композициях по настоящему изобретению, включают, без ограничения, один или более из следующих антигенов, представленных ниже, или антигенов, полученных из одного или более из патогенов, перечисленных ниже.

Бактериальные антигены

[00185] Подходящие бактериальные антигены, раскрытые в настоящем описании, включают белки, полисахариды, липополисахариды и везикулы наружной мембраны, которые могут быть выделены, очищены или получены из бактерий. Кроме того, бактериальные антигены могут включать бактериальные лизаты и составы инактивированных бактерий. Бактериальные антигены могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии. Бактериальные антигены включают эпитопы, которые могут находиться на поверхности бактерий по меньшей мере на одном этапе их жизненного цикла. Бактериальные антигены могут быть консервативными среди множества серотипов. Бактериальные антигены включают антигены, полученные из одной или более бактерий, перечисленных ниже, а также конкретных примеров антигенов, указанных ниже.

[00186] Neisseria meningitides: Антигены Meningitides могут включать белки (например, идентифицированные в ссылках 1-7), сахариды (включая полисахарид, олигосахарид или липополисахарид) или везикулы внешней мембраны, очищенные или полученные из серогруппы N. meningitides, такой как А, С, W135, Y и/или В. Белковые антигены Meningitides могут быть выбраны из адгезивов, аутотранспортеров, токсинов, белков захвата Fe и белков, ассоциированных с мембраной (например, интегрального белка внешней мембраны).

[00187] Streptococcus pneumoniae: Антигены Streptococcus pneumoniae могут включать сахарид (включая полисахарид или олигосахарид) и/или белок из Streptococcus pneumoniae. Сахаридные антигены могут быть выбраны из серотипов 1, 2, 3, 4, 5, 6В, 7F, 8, 9N, 9V, 10А, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F и 33F. Белковые антигены могут быть выбраны из белка, идентифицированного в WO 98/18931, WO 98/18930, патенте США №6699703, патенте США №6800744, WO 97/43303 и WO 97/37026. Белки Streptococcus pneumoniae могут быть выбраны из семейства полигистидиновой триады (PhtX), семейства холинсвязывающих белков (CbpX), укороченных белков семейства CbpX, семейства LytX, укороченных белков семейства LytX, укороченных химерных белков CbpX-LytX, пневмолизина (Ply), PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 или Sp133.

[00188] Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A): Антигены стрептококка группы А могут включать белок, идентифицированный в WO 02/34771 или WO 2005/032582 (включая GAS 40), продукты слияния фрагментов белков GAS М (включая, описанные в WO 02/094851), белок, связывающий фибронектин (Sfb1), стрептококковый гем-ассоциированный белок (Shp) и стрептолизин S (SagA).

[00189] Moraxella cataralis: Антигены Moraxella включают антигены, идентифицированные в WO 02/18595 и WO 99/58562, антигены белков внешней мембраны (HMW-OMP), С-антиген и/или LPS.

[00190] Bordetella pertussis: Коклюшные антигены включают голотоксин petussis (РТ) и нитевидный гемагглютинин (FHA) из В. pertussis, необязательно также в комбинации с антигенами пертактин и/или агглютиногены 2 и 3.

[00191] Staphylococcus aureus: Антигены Staph aureus включают капсульные полисахариды S. aureus типов 5 и 8, необязательно конъюгированные с нетоксичным рекомбинантный экзотоксином A Pseudomonas aeruginosa, таким как STAPHVAX™, или антигены, полученные из поверхностных белков, инвазины (лейкоцидин, киназы, гиалуронидаза), поверхностные факторы, ингибирующие фагоцитарное поглощение (капсула, белок А), каротиноиды, продукты каталазы, белок А, коагулазу, фактор свертывания крови и/или повреждающие мембрану токсины (необязательно детоксицированные), которые лизируют мембраны эукариотических клеток (гемолизины, лейкотоксин, лейкоцидин).

[00192] Staphylococcus epidermis: Антигены S. epidermidis включают антиген, ассоциированный со слизью (SAA).

[00193] Clostridium tetani (столбняк): Столбнячные антигены включают столбнячный анатоксин (ТТ), который можно использовать в качестве белка-носителя в сочетании/конъюгированного с композициями по настоящему изобретению.

[00194] Cornynebacterium diphtheriae (дифтерия): Дифтерийные антигены включают дифтерийный токсин, в том числе детоксицированный, такой как CRM₁₉₇. Кроме того, для комбинации/совместного введения/конъюгации с композициями по настоящему изобретению предусмотрены антигены, которые способны модулировать, ингибировать рибозилирование АДФ или которые ассоциированы с ним. В качестве белков-носителей можно использовать дифтерийные анатоксины.

[00195] Haemophilus influenzae В (Hib): Антигены Hib включают сахаридный антиген Hib.

[00196] Pseudomonas aeruginosa: Антигены Pseudomonas включают эндотоксин А, белок Wzz, LPS P. aeruginosa, более конкретно LPS, выделенный из PAO1 (серотип O5), и/или белки внешней мембраны, включая белки внешней мембраны F (OprF).

[00197] Legionella pneumophila. Бактериальные антигены могут быть получены из Legionella pneumophila.

[00198] Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В): Антигены стрептококка группы В включают белковый или сахаридный антиген, идентифицированный в WO 02/34771, WO 03/093306, WO 04/041157 или WO 2005/002619 (включая белки GBS 80, GBS 104, GBS 27 6 и GBS 322, включая сахаридные антигены, полученные из серотипов Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII и VIII).

[00199] Neiserria gonorrhoeae: Антигены Gonorrhoeae включают белок Por (или порин), такой как PorB, транспортирующий связывающий белок, такой как TbpA и TbpB, белок мутности (такой как Ора), редукционно-модифицируемый белок (Rmp) и препараты на основе везикул наружной мембраны (OMV) (см., например, WO 99/24578, WO 99/36544, WO 99/57280, WO 02/079243).

[00200] Chlamydia trachomatis: Антигены Chlamydia trachomatis включают антигены, полученные из серотипов А, В, Ва и С (возбудители трахомы, причины слепоты), серотипов L₁, L₂ и L₃ (связанных с венерической лимфогранулемой) и серотипов D-K. Антигены Chlamydia trachomas могут также включать антиген, идентифицированный в WO 00/37494, WO 03/049762, WO 03/068811 или WO 05/002619, включая РерА (СТ045), LcrE (СТ089), ArtJ (СТ381), DnaK (СТ396), СТ398, OmpH-подобный (СТ242), L7/L12 (СТ316), OmcA (СТ444), AtosS (CT467), CT547, Eno (CT587), HrtA (CT823) и MurG (CT761).

[00201] Treponema pallidum (сифилис): Антигены сифилиса включают антиген TmpA.

[00202] Haemophilus ducreyi (вызывающий шанкроид): Антигены Ducreyi включают белок наружной мембраны (DsrA).

[00203] Enterococcus faecalis или Enterococcus faecium: Антигены включают трисахаридный повтор или другие антигены, полученные из Enterococcus, представленные в патенте США №6756361.

[00204] Helicobacter pylori: Антигены Н. pylori включают Cag, Vac, Nap, НорХ, HopY и/или уреазный антиген.

[00205] Staphylococcus saprophyticus: Антигены включают гемагглютинин массой 160 кДа антигена S. saprophyticus.

[00206] Антигены Yersinia enterocolitica включают LPS.

[00207] Е. coli: Антигены Е. coli могут быть получены из энтеротоксигенной Е. coli (ЕТЕС), энтероагрегационной Е. coli (EAggEC), диффузно-адгезивной Е. coli (DAEC), энтеропатогенной Е. coli (ЕРЕС) и/или энтерогеморрагической Е. coli (ЕНЕС).

[00208] Bacillus anthracis (сибирская язва): Антигены В. anthracis необязательно подвергают детоксикации и могут быть выбраны из А-компонентов (летальный фактор (LF) и фактор отека (EF)), оба из которых могут иметь общий В-компонент, известный как защитный антиген (РА).

[00209] Yersinia pestis (чума): Чумные антигены включают капсульный антиген F1.

[00210] Микобактерии туберкулеза: Туберкулезные антигены включают липопротеины, LPS, антигены BCG, слитый белок антигена 85 В (Ag85 В) и/или ESAT-6, необязательно в виде состава в катионных липидных везикулах, антигены, ассоциированные с изоцитратдегидрогеназой микобактерии туберкулеза (Mtb), и/или антигены МРТ51.

[00211] Риккетсии: Антигены включают белки внешней мембраны, включая белки внешней мембраны А и/или В (OmpB).

[00212] Listeria monocytogenes. Бактериальные антигены могут быть получены из Listeria monocytogenes.

[00213] Chlamydia pneumoniae: Антигены включают антигены, идентифицированные в WO 02/02606.

[00214] Холерный вибрион: Антигены включают протеиназные антигены, LPS, в частности, липополисахариды Vibrio cholerae II, O1 Inaba О-специфические полисахариды, V. cholera 0139, антигены вакцины IEM108 и/или токсин Zonula occludens (Zot).

[00215] Salmonella typhi (брюшной тиф): Антигены включают капсульные полисахариды, включая конъюгаты (Vi, т.е. Vax-TyVi).

[00216] Borrelia burgdorferi (болезнь Лайма): Антигены включают липопротеины (такие как OspA, OspB, OspC и OspD), другие поверхностные белки, такие как OspE-родственные белки (Erps), декорин-связывающие белки (такие как DbpA) и антигенно вариабельные белки VI, такие как антигены, связанные с белком антигенной изменчивости V1sE Р39 и Р13.

[00217] Porphyromonas gingivalis: Антигены включают белок наружной мембраны P. gingivalis (ОМР).

[00218] Klebsiella: Антигены включают ОМР, включая ОМР А, или полисахарид, необязательно конъюгированный со столбнячным анатоксином.

[00219] Дополнительные бактериальные антигены по настоящему изобретению могут представлять собой капсульные антигены, полисахаридные антигены или белковые антигены любого из вышеперечисленных. Дополнительные бактериальные антигены также могут включать препарат на основе везикул наружной мембраны (OMV). Кроме того, антигены включают живые, аттенуированные и/или очищенные версии любой из вышеупомянутых бактерий. Антигены по настоящему изобретению могут быть получены из грамотрицательных или грамположительных бактерий. Антигены по настоящему изобретению могут быть получены из аэробных или анаэробных бактерий.

[00220] Кроме того, любой из вышеуказанных сахаридов бактериального происхождения (полисахариды, LPS, LOS или олигосахариды) может быть конъюгирован с другим агентом или антигеном, таким как белок-носитель (например, CRM₁₉₇). Такая конъюгация может представлять собой прямую конъюгацию, осуществляемую путем восстановительного аминирования карбонильных групп сахарида аминогруппами белка, как предусмотрено в патенте США №5360897. Альтернативно, сахариды могут быть конъюгированы через линкер, например, посредством сукцинамидных или других связей.

Вирусные антигены

[00221] Вирусные антигены, подходящие для использования в раскрытых композициях, включают составы очищенных субъединиц, вирусные белки, которые могут быть выделены, очищены или получены из вируса, и вирусоподобные частицы (VLP). Вирусные антигены могут быть получены из вирусов, размноженных на клеточной культуре или другом субстрате. Альтернативно, вирусные антигены могут быть экспрессированы рекомбинантно. Вирусные антигены включают эпитопы, экспонированные на поверхности вируса по меньшей мере на одном этапе его жизненного цикла. Вирусные антигены могут быть консервативными среди множества серотипов или изолятов. Вирусные антигены включают антигены, полученные из одного или более вирусов, перечисленных ниже, а также конкретных примеров антигенов, указанных ниже.

[00222] Ортомиксовирус: Вирусные антигены могут быть получены из ортомиксовирусов, такого как вирусы гриппа А, В и С. Антигены ортомиксовирусов могут быть выбраны из одного или более вирусных белков, включая гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), нуклеопротеин (NP), матричный белок (M1), мембранный белок (М2), один или более компонентов транскриптазы (РВ1, РВ2 и РА). В вариантах осуществления антигены включают НА и NA.

[00223] Антигены гриппа могут быть получены из межпандемических (ежегодных) штаммов гриппа. Альтернативно, антигены гриппа могут быть получены из штаммов, потенциально способных вызвать пандемию или пандемическую вспышку (т.е., штаммы гриппа с новым гемгглютинином по сравнению с гемагглютинином в штаммах, циркулирующих настоящее время, или штаммы гриппа, которые являются патогенными среди птиц и могут быть переданы горизонтально в человеческую популяцию, или штаммы гриппа, которые являются патогенными для людей).

[00224] Вирусы семейства Paramyxoviridae: Вирусные антигены могут быть получены из вирусов Paramyxoviridae, таких как пневмовирусы (RSV), парамиксовирусы (PIV) и морбилливирусы (корь).

[00225] Пневмовирус: Вирусные антигены могут быть получены из пневмовируса, такого как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), бычий респираторно-синцитиальный вирус, вирус пневмонии мышей и вирус ринотрахеита индейки. В вариантах осуществления пневмовирус представляет собой RSV. Антигены пневмовируса могут быть выбраны из одного или более из следующих белков, включая поверхностные белки Fusion (F), гликопротеин (G) и малый гидрофобный белок (SH), матричные белки М и М2, белки нуклеокапсида N, Р и L и неструктурные белки NS1 и NS2. Антигены пневмовируса могут включать F, G и М. Антигены пневмовируса также могут быть введены в состав химерных вирусов или получены из них. Например, химерные вирусы RSV/PIV могут содержать компоненты как RSV, так и PIV.

[00226] Парамиксовирус: Вирусные антигены могут быть получены из парамиксовирусов, таких как вирус парагриппа типов 1-4 (PIV), эпидемического паротита, вирусов Sendai, обезьяньего вируса 5, вируса бычьего парагриппа и вируса болезни Ньюкасла. В вариантах осуществления парамиксовирус представляет собой PIV или эпидемический паротит. Антигены парамиксовируса могут быть выбраны из одного или более из следующих белков: гемагглютинин-нейраминидазы (HN), белков Fusion F1 и F2, нуклеопротеина (NP), фосфопротеина (Р), большого белка (L) и матричного белка (М). Белки парамиксовируса могут включать HN, F1 и F2. Антигены парамиксовируса также могут быть включены в состав химерных вирусов или получены из них. Например, химерные вирусы RSV/PIV могут содержать компоненты как RSV, так и PIV. Коммерчески доступные вакцины против паротита включают живой аттенуированный вирус паротита либо в моновалентной форме, либо в комбинации с вакцинами против кори и краснухи (MMR).

[00227] Морбилливирус: Вирусные антигены могут быть получены из морбилливируса, такого как корь. Антигены морбилливируса могут быть выбраны из одного или более из следующих белков: гемагглютинина (Н), гликопротеина (G), фактора Fusion (F), большого белка (L), нуклеопротеина (NP), полимеразного фосфопротеина (Р) и матричного белка (М). Коммерчески доступные вакцины против кори включают живой аттенуированный вирус кори, обычно в комбинации с эпидемическим паротитом и краснухой (MMR).

[00228] Пикорнавирус: Вирусные антигены могут быть получены из пикорнавирусов, таких как энтеровирусы, риновирусы, гепарнавирусы, кардиовирусы и афтовирусы. Можно использовать антигены, полученные из энтеровирусов, таких как полиовирус.

[00229] Энтеровирус: вирусные антигены могут быть получены из энтеровируса, такого как полиовирус типов 1, 2 или 3, вируса Коксаки А типов 1-22 и 24, вируса Коксаки В типов 1-6, эховируса (ECHO) типов 1-9, 11-27 и 29-34 и энтеровируса 68-71. В вариантах осуществления энтеровирус может представлять собой полиовирус. Антигены энтеровируса могут включать один или более из следующих капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Коммерчески доступные вакцины против полиомиелита включают инактивированную полиомиелитную вакцину (IPV) и пероральную полиомиелитную вакцину (OPV).

[00230] Гепарнавирус: Вирусные антигены могут быть получены из гепарнавируса, такого как вирус гепатита A (HAV). Коммерчески доступные вакцины против HAV включают инактивированную вакцину против HAV.

[00231] Тогавирус: Вирусные антигены могут быть получены из тогавируса, такого как рубивирус, альфавирус или артеривирус. Можно использовать антигены, полученные из рубивируса, такого как вирус краснухи. Антигены тогавируса могут быть выбраны из E1, Е2, Е3, С, NSP-1, NSPO-2, NSP-3 или NSP-4. Антигены тогавируса включают E1, Е2 или Е3. Коммерчески доступные вакцины против краснухи включают живой холодоадаптированный вирус, обычно в комбинации с вакцинами против паротита и кори (MMR).

[00232] Флавивирус: вирусные антигены могут быть получены из флавивирусов, таких как клещевой энцефалит (ТВЕ), денге (типы 1, 2, 3 или 4), желтая лихорадка, японский энцефалит, энцефалит Западного Нила, энцефалит Сент-Луиса, русский весенне-летний энцефалит, Повассанский (Powassan) энцефалит. Антигены флавивируса могут быть выбраны из PrM, М, С, Е, NS-1, NS-2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b и NS5. Антигены флавивируса могут включать PrM, М и Е. Коммерчески доступная вакцина против ТВЕ включает инактивированные вирусные вакцины.

[00233] Пестивирус: Вирусные антигены могут быть получены из пестивируса, такого как вирусная диарея крупного рогатого скота (BVDV), классическая чума свиней (CSFV) или пограничная болезнь (BDV).

[00234] Гепаднавирус: Вирусные антигены могут быть получены из гепаднавируса, такого как вирус гепатита В. Антигены гепаднавируса могут быть выбраны из поверхностных антигенов (L, М и S), ядерных антигенов (НВс, НВе). Коммерчески доступные вакцины против HBV включают субъединичные вакцины, содержащие белок поверхностного антигена S.

[00235] Вирус гепатита С: Вирусные антигены могут быть получены из вируса гепатита С (HCV). Антигены HCV могут быть выбраны из одного или более полипротеинов E1, Е2, Е1/Е2, NS345, ядерного полипротеина NS 345, ядра и/или пептидов из неструктурных областей.

[00236] Рабдовирус: Вирусные антигены могут быть получены из рабдовируса, такого как лиссавирус (вирус бешенства) и везикуловирус (VSV). Антигены рабдовируса могут быть выбраны из гликопротеина (G), нуклеопротеина (N), большого белка (L), неструктурных белков (NS). Коммерчески доступная вакцина против вируса бешенства содержит убитый вирус, выращенный на диплоидных клетках человека или клетках легких плода-резус.

[00237] Вирусы семейства Caliciviridae: Вирусные антигены могут быть получены из вирусов семейства Calciviridae, таких как вирус Norwalk, и вирусов, подобных Norwalk, таких как вирус Hawaii и вирус Snow Mountain.

[00238] Коронавирус: Вирусные антигены могут быть получены из коронавируса, SARS, респираторного коронавируса человека, птичьего инфекционного бронхита (IBV), вируса гепатита мышей (MHV) и вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней (TGEV). Антигены коронавируса могут быть выбраны из шиповидного белка (S), белка оболочки (Е), матричного белка (М), нуклеокапсидного белка (N) и гликопротеина гемагглютинин-эстеразы (НЕ). В некоторых вариантах осуществления антиген коронавируса получен из вируса SARS. Вирусные антигены SARS описаны в WO 04/92360;

[00239] Ретровирус: Вирусные антигены могут быть получены из ретровируса, такого как онковирус, лентивирус или спумавирус. Антигены онковируса могут быть получены из HTLV-1, HTLV-2 или HTLV-5. Лентивирусные антигены могут быть получены из ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Антигены ретровируса могут быть выбраны из gag, pol, env, tax, tat, rex, rev, nef, vif, vpu и vpr. Антигены ВИЧ могут быть выбраны из gag (p24gag и p55gag), env (gpl60 и gp41), pol, tat, nef, rev vpu, минипротеинов (например, с делениями p55gag и gpl4 0v). Антигены ВИЧ могут быть получены из одного или более из следующих штаммов: HIV_IIIb, HIV_SF2, HIV_LAV, HIV_LAI, HIV_MN, HIV-1_CM235, HIV-1_US4.

[00240] Реовирус: Вирусные антигены могут быть получены из реовируса, такого как ортореовирус, ротавирус, орбивирус или колтивирус. Антигены реовируса могут быть выбраны из структурных белков λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, σ1, σ2 или σ3 или неструктурных белков σNS, μNS или σ1s. Антигены реовируса могут быть получены из ротавируса. Антигены ротавируса могут быть выбраны из VP1, VP2, VP3, VP4 (или продуктов расщепления VP5 и VP8), NSP1, VP6, NSP3, NSP2, VP7, NSP4 или NSP5. Антигены ротавируса могут включать VP4 (или продукты расщепления VP5 и VP8) и VP7. См., например, WO 2005/021033, WO 2003/072716, WO 2002/11540, WO 2001/12797, WO 01/08495, WO 00/26380, WO 02/036172; которые включены в настоящее описание во всей своей полноте посредством ссылки.

[00241] Парвовирус: Вирусные антигены могут быть получены из парвовируса, такого как парвовирус В19. Антигены парвовируса могут быть выбраны из VP-1, VP-2, VP-3, NS-1 и NS-2. В вариантах осуществления антиген парвовируса представляет собой капсидный белок VP-2.

[00242] Вирус гепатита дельта (HDV): Вирусные антигены могут быть получены из HDV, в частности дельта-антигена HDV (см., например, патент США №5378814).

[00243] Вирус гепатита Е (HEV): Вирусные антигены могут быть получены из HEV.

[00244] Вирус гепатита G (HGV): Вирусные антигены могут быть получены из HGV.

[00245] Герпесвирус человека: Вирусные антигены могут быть получены из вируса герпеса человека, такого как вирусы простого герпеса (HSV), вирус ветряной оспы (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса человека 6 (HHV6), вирус герпеса человека 7 (HHV7) и вирус герпеса человека 8 (HHV8). Антигены вируса герпеса человека могут быть выбраны из предранних белков (а), ранних белков (В) и поздних белков (γ). Антигены HSV могут быть получены из штаммов HSV-1 или HSV-2. Антигены HSV могут быть выбраны из гликопротеинов gB, gC, gD и gH, слитого белка (gB) или белков, позволяющих ускользать от иммунного надзора (gC, gE или gI). Антигены VZV могут быть выбраны из белков ядра, нуклеокапсида, тегумента или оболочки. Живая аттенуированная вакцина VZV является коммерчески доступной. Антигены EBV могут быть выбраны из ранних антигенных белков (ЕА), вирусного капсидного антигена (VCA) и гликопротеинов мембранного антигена (МА). Антигены CMV могут быть выбраны из капсидных белков, гликопротеинов оболочки (таких как gB и дН) и белков тегумента.

[00246] Паповавирусы: Антигены могут быть получены из паповавирусов, таких как папилломавирусы и полиомавирусы. Папилломавирусы включают серотипы HPV 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 и 65. В вариантах осуществления антигены HPV получают из серотипов 6, 11, 16 или 18. Антигены HPV могут включать капсидные белки (L1) и (L2) или Е1-Е7 или продукты их слияния. Вирусы полиомавируса включают вирус BK и вирус JK. Антигены полиомавируса могут быть выбраны из VP1, VP2 или VP3.

[00247] Цирковирус: Антигены могут быть получены из цирковирусов, таких как цирковирус свиней (PCV) 1, PCV 2, PCV 3 и PCV 4.

Грибковые антигены

[00248] Подходящие грибковые антигены могут быть получены из одного или более грибов, представленных ниже.

[00249] Грибковые антигены могут быть получены из Dermatophytres, включая Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum и/или Trichophyton faviforme.

[00250] Грибковые патогены могут быть получены из Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp., Mucor spp., Absidia spp., Mortierella spp., Cunninghamella spp., Saksenaea spp., Alternaria spp., Curvularia spp., Helminthosporium spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp., Monolinia spp., Rhiizoctonia spp., Paecilomyces spp., Pithornyces spp. и Cladosporium spp.

[00251] Способы получения грибковых антигенов хорошо известны в данной области техники (см. патент США №6333164). В одном из способов солюбилизированную фракцию экстрагируют и отделяют от нерастворимой фракции, полученной из клеток грибов, у которых клеточная стенка практически удалена или по меньшей мере частично удалена, где способ включает этапы получения живых клеток грибов; получения клеток грибов, у которых клеточная стенка практически удалена или по меньшей мере частично удалена; разрушение клеток грибов, у которых клеточная стенка практически удалена или по меньшей мере частично удалена; получение нерастворимой фракции; и экстрагирование и отделение солюбилизированной фракции от нерастворимой фракции.

Респираторные антигены

[00252] Композиции, раскрытые в настоящем описании, могут включать один или более антигенов, полученных из патогена, вызывающего респираторное заболевание. Например, респираторные антигены могут быть получены из респираторного вируса, такого как ортомиксовирусы (грипп), пневмовирус (RSV), парамиксовирус (PIV), морбилливирус (корь), тогавирус (краснуха), VZV и коронавирус (SARS). Респираторные антигены могут быть получены из бактерий, вызывающих респираторные заболевания, таких как Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae, Bacillus anthracis и Moraxella catarrhalis. Примеры специфических антигенов, полученных из этих патогенов, описаны выше.

[00253] Иммуногенные композиции, раскрытые в настоящем описании, могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде инъекционных лекарственных форм либо в виде жидких растворов, либо суспензий. Также могут быть получены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией (например, лиофилизированная композиция или композиция, полученная распылительной сублимационной сушкой). Композиция может быть приготовлена для топического применения, например, в виде мази, крема или порошка. Композиция может быть приготовлена для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы или в виде спрея. Композиция может быть приготовлена для легочного введения, например, в виде ингалятора, с использованием мелкодисперсного порошка или спрея. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть приготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Получение таких фармацевтических композиций находится в компетенции обычного специалиста в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18th edition, 1990.

[00254] Композиция может быть в форме набора, разработанного для восстановления комбинированной композиции непосредственно перед введением пациенту. Такие наборы могут содержать один или более антигенов саповируса или нуклеиновых кислот, кодирующих такие антигены, в жидкой форме, а также любые дополнительные антигены и адъюванты, представленные в настоящем описании.

[00255] Иммуногенные композиции, содержащие описанные полипептидные антигены представляют собой вакцинные композиции. Значение рН таких композиций находится в пределах от 6 до 8, составляет примерно 7. рН можно поддерживать с помощью буфера. Композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиция может быть изотонической по отношению к субъекту. Вакцины по настоящему изобретению можно использовать либо профилактически, либо терапевтически, но обычно они являются профилактическими и могут применяться для лечения животных (включая сельскохозяйственных, диких, домашних и лабораторных млекопитающих).

[00256] Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов) и/или нуклеиновых кислот, кодирующих антиген(ы), а также любые другие компоненты, при необходимости. Под «иммунологически эффективным количеством» подразумевается, что введение такого количества индивидууму либо в виде однократной дозы, либо в виде части серии, является эффективным для лечения или профилактики. Это количество меняется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, возраста, таксономической группы индивидуума, подлежащего лечению (например, свиньи, крупного рогатого скота и т.п.), способности иммунной системы индивидуума синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим ветеринаром и других соответствующих факторов. Ожидается, что это количество будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен посредством рутинных испытаний.

Введение

[00257] Композиции, раскрытые в настоящем описании, обычно вводят непосредственно субъекту. Прямая доставка может осуществляться путем парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или через слизистую оболочку, например, ректально, перорально (например, таблетки, спрей), вагинально, топически, трансдермально (см., например, WO 99/27961) или чрескожно (см., например, WO 02/074244 и WO 02/064162), интраназально (см., например, WO 03/028760), путем глазного, ушного, легочного введения или другого введения через слизистую оболочку. Иммуногенные композиции также можно вводить топически путем прямого переноса на поверхность кожи. Топическое введение можно осуществить без использования каких-либо устройств или путем контактирования обнаженной кожи с иммуногенной композицией посредством повязки или устройства, подобного повязке (см., например, патент США №6348450).

[00258] В вариантах осуществления способ введения может быть парентеральным, мукозальным или комбинацией мукозальной и парентеральной иммунизации. В одном из аспектов способ введения представляет собой парентеральную, мукозальную иммунизацию или комбинацию мукозальной и парентеральной иммунизаций путем проведения в общей сложности 1-2 вакцинаций с интервалом 1-3 недели. В одном из аспектов путь введения включает, без ограничения, пероральную доставку, внутримышечную доставку и комбинацию пероральной и внутримышечной доставки.

[00259] Уже было продемонстрировано, что слизистые и системные иммунные ответы на антигены, такие как антигены Helicobacter pylori, могут быть усилены посредством примирующей иммунизации слизистой оболочки с последующей системной бустерной иммунизацией. В вариантах осуществления способ лечения инфекции, вызванной саповирусом, включает введение в слизистую оболочку нуждающемуся в этом субъекту первой иммуногенной композиции, содержащей один или более антигенов саповируса, с последующим парентеральным введением терапевтически эффективного количества второй иммуногенной композиции, содержащей один или более антигенов саповируса.

[00260] Иммуногенная композиция может быть использована для стимуляции системного иммунитета и/или мукозального иммунитета, для стимуляции усиленного системного иммунитета и/или мукозального иммунитета.

[00261] В вариантах осуществления иммунный ответ характеризуется индукцией сывороточного IgG- и/или кишечного IgA-иммунного ответа.

[00262] Как отмечалось выше, могут быть использованы способы прайм-бустер иммунизации, в которых один или более векторов доставки генов и/или полипептидные антигены доставляются на этапе «примирующей иммунизации», а затем один или более вторых векторов доставки генов и/или полипептидные антигены доставляются на этапе «бустерной иммунизации». В некоторых вариантах осуществления за примирующей и бустерной иммунизациями одним или более векторами доставки генов или полипептидными антигенами, представленными в настоящем описании, следует дополнительная бустерная стимуляция одной или более полипептид-содержащими композициями (например, полипептидами, содержащими саповирусные антигены).

[00263] В любом способе, включающем совместное введение, различные композиции можно доставлять в любом порядке. Таким образом, в вариантах осуществления, включающих доставку множества разных композиций или молекул, все нуклеиновые кислоты необязательно должны доставляться раньше полипептидов. Например, этап примирующей иммунизации может включать доставку одного или более полипептидов, а бустерная стимуляция включает доставку одной или более нуклеиновых кислот и/или одного или более полипептидов. За многократными введениями полипептидов могут следовать многократные введения нуклеиновых кислот, или введения полипептидов и нуклеиновых кислот могут осуществляться в любом порядке. Таким образом, один или более векторов доставки генов, представленных в настоящем описании, и один или более представленных в настоящем описании полипептидов можно вводить совместно в любом порядке и любым способом введения. Следовательно, для индукции иммунной реакции может быть использована любая комбинация полинуклеотидов и полипептидов, представленных в настоящем описании.

Режим дозирования

[00264] Лечение путем дозирования может осуществляться в соответствии со схемой однократного введения дозы или схемой введения многократных доз. Многократные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустерной иммунизации. В схеме введения многократных доз различные дозы могут вводиться одним и тем же или разными путями, например, путем парентеральной примирующей иммунизации и мукозальной бустерной иммунизации, мукозальной примирующей иммунизации и парентеральной бустерной иммунизации и т.п.

[00265] В вариантах осуществления режим дозирования повышает авидность гуморального ответа, что приводит к образованию антител с нейтрализующими характеристиками. Для оценки нейтрализующих антител можно использовать анализ нейтрализации in vitro.

[00266] Существуют убедительные доказательства корреляции между уровнями антител в сыворотке и защитой от заболевания, вызванного саповирусом.

Тесты для определения эффективности иммунного ответа

[00267] Один из способов оценки эффективности терапевтического лечения включает мониторинг инфекции после введения раскрытой композиции. Один из способов оценки эффективности профилактического лечения включает мониторинг иммунных ответов против антигенов в описанных композициях после введения композиции.

[00268] Другим способом оценки иммуногенности белков-компонентов иммуногенных композиций по настоящему изобретению является рекомбинантная экспрессия белков и скрининг сыворотки крови пациента или секретов слизистой оболочки с помощью иммуноблоттинга. Положительная реакция между белком и сывороткой пациента указывает на то, что у пациента ранее выработался иммунный ответ на рассматриваемый белок, т.е., белок является иммуногеном. Этот способ также можно использовать для идентификации иммунодоминантных белков и/или эпитопов.

[00269] Другой способ проверки эффективности терапевтического лечения включает мониторинг инфекции после введения композиций по настоящему изобретению. Один из способов проверки эффективности профилактического лечения включает мониторинг как системного (например, мониторинг уровня продуцирования IgG1 и IgG2a), так и мукозального (например, мониторинг уровня продуцирования IgA) иммунных ответов против антигенов, содержащихся в композициях по настоящему изобретению, после введения композиции. Обычно специфичные для сыворотки антитела определяют после иммунизации, но до заражения, тогда как специфичные для слизистой оболочки антитела определяют после иммунизации и после заражения.

[00270] Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут быть оценены на животных моделях in vitro и in vivo до введения в организм хозяина. Особенно полезные мышиные модели включают модели, в которых после внутрибрюшинной иммунизации следует либо внутрибрюшинное, либо интраназальное введение.

[00271] Эффективность иммуногенных композиций по настоящему изобретению также может быть определена in vivo путем инфицирования животных моделей, например, морских свинок или мышей или макак-резус, иммуногенными композициями. Иммуногенные композиции могут происходить, либо нет, из тех же штаммов, которые использовали для контрольного заражения. В вариантах осуществления иммуногенные композиции могут быть получены с использованием тех же штаммов, что штаммы, использованные для контрольного заражения.

[00272] Модели эффективности in vivo включают, без ограничения: (i) мышиную модель инфицирования человеческими штаммами; (ii) мышиную модель заболевания, которая представляет собой мышиную модель, инфицированную адаптированным к мышам штаммом, таким как штаммы, которые, в частности, вирулентны для мышей, и (iii) модель на приматах с использованием человеческих изолятов. Также доступна модель заражения человека, поддерживаемая NIH и Центром по контролю заболеваний (CDC).

[00273] Иммунный ответ может представлять собой один или оба из иммунного ответа ТН1 и ответа ТН2. Иммунный ответ может представлять собой улучшенный, усиленный или измененный иммунный ответ. Иммунный ответ может представлять собой один или оба из системного иммунного ответа и мукозального иммунного ответа. В вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой усиленный системный ответ и/или мукозальный ответ.

[00274] Усиленный системный и/или мукозальный иммунитет отражается в виде усиления иммунного ответа ТН1 и/или ТН2. В вариантах осуществления усиленный иммунный ответ включает увеличение продуцирования IgG1 и/или IgG2a, и/или IgA. В некоторых вариантах осуществления мукозальный иммунный ответ представляет собой иммунный ответ ТН2. В одном из аспектов мукозальный иммунный ответ включает увеличение продуцирования IgA.

[00275] Активированные клетки ТН2 усиливают выработку антител и, следовательно, являются значимыми для ответа на внеклеточные инфекции. Активированные клетки ТН2 могут секретировать один или более из IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10. Иммунный ответ ТН2 может привести к выработке IgG1, IgE, IgA и В-клеток памяти для будущей защиты.

[00276] Иммунный ответ ТН2 типа может включать одно или более из увеличения уровня одного или более цитокинов, связанных с иммунным ответом ТН2 типа (таких как IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10), или увеличения продуцирования IgG1, IgE, IgA и В-клеток памяти. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ ТН2 типа будет включать увеличение продуцирования IgG1.

[00277] Иммунный ответ ТН1 типа может включать одно или более из увеличения CTL, увеличения уровня одного или более цитокинов, связанных с иммунным ответом ТН1 (таких как IL-2, IFNγ и TNFB), увеличения уровня активированных макрофагов, усиления активности NK или увеличения продуцирования IgG2a. В некоторых вариантах осуществления усиленный иммунный ответ ТН1 типа будет включать увеличение продуцирования IgG2a.

[00278] Иммуногенные композиции по настоящему изобретению, в частности, иммуногенную композицию, содержащую один или более антигенов по настоящему изобретению, можно использовать либо отдельно, либо в комбинации с другими антигенами, необязательно с иммунорегуляторным агентом, способным вызывать ответ Th1 и/или Th2 типа.

[00279] Иммуногенная композиция по настоящему изобретению также может содержать один или более иммунорегуляторных агентов, таких как минеральная соль, такая как соль алюминия, и олигонуклеотид, содержащий мотив CpG. В вариантах осуществления иммуногенная композиция включает как соль алюминия, так и олигонуклеотид, содержащий мотив CpG. Альтернативно, иммуногенная композиция включает АДФ-рибозилирующий токсин, такой как детоксицированный АДФ-рибозилирующий токсин, и олигонуклеотид, содержащий мотив CpG. В одном из аспектов один или более иммунорегуляторных агентов включают адъювант. Адъювант может быть выбран из одной или более групп, состоящих из адъюванта ТН1 и адъюванта ТН2, как дополнительно обсуждалось выше.

[00280] Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут вызывать как клеточно-опосредованный иммунный ответ, так и гуморальный иммунный ответ для эффективного противодействия инфекции. Этот иммунный ответ может индуцировать долговременные (например, нейтрализующие) антитела и клеточно-опосредованный иммунитет, который может быстро реагировать на воздействие одного или более инфекционных антигенов. Например, наличие нейтрализующих антител в образцах крови субъекта рассматривается как суррогатный параметр защиты, поскольку их образование имеет решающее значение для элиминации вируса при инфекциях ТВЕ.

Применение иммуногенных композиций в качестве лекарственных средств

[00281] Настоящее изобретение также относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства. Лекарственное средство может быть способным вызывать иммунный ответ у млекопитающего (т.е. оно представляет собой иммуногенную композицию) и может представлять собой вакцину. Настоящее изобретение также относится к применению настоящих композиций при производстве лекарственного средства для усиления иммунного ответа у млекопитающего. Лекарственное средство может представлять собой вакцину. В вариантах осуществления вакцину применяют для профилактики и/или лечения кишечной инфекции, такой как гастроэнтерит, включая острый гастроэнтерит. Гастроэнтерит может возникнуть в результате дисбаланса в переносе ионов и/или воды, приводя как к водянистой диарее, так и к перистальтике и/или моторике кишечника (рвоте).

[00282] Настоящее изобретение относится к способам индукции или усиления иммунного ответа с помощью описанных выше композиций. Иммунный ответ может быть защитным и может индуцировать выработку антител и/или формирование клеточного иммунитета (включая системный иммунитет и мукозальный иммунитет). Иммунные реакции включают бустерные реакции.

[00283] Настоящее изобретение также относится к способу повышения иммунного ответа у млекопитающего, который включает этап введения эффективного количества композиции по настоящему изобретению. Иммунный ответ может быть защитным и может включать выработку антител и/или клеточный иммунитет. В вариантах осуществления иммунный ответ включает один или оба из иммунного ответа ТН1 типа и иммунного ответа ТН2 типа. Этот способ может вызвать бустерную реакцию.

Наборы

[00284] Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим один или более контейнеров с композициями, представленными в настоящем описании. Композиции могут находиться в жидкой форме или могут быть лиофилизированными, как и отдельные антигены. Подходящие контейнеры для композиций включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, включая стекло или пластик. Контейнер может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций).

[00285] Набор может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера или раствор декстрозы. Он также может содержать другие материалы, полезные для конечного пользователя, включая другие фармацевтически приемлемые растворы для приготовления составов, такие как буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы или другие устройства для доставки. Набор может дополнительно включать третий компонент, содержащий адъювант.

[00286] Набор также может включать вкладыш в упаковку, содержащий письменные инструкции по способам индукции иммунитета или лечения инфекций. Вкладыш в упаковку может представлять собой неутвержденный проект вкладыша в упаковку или может быть вкладышем в упаковку, одобренным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) или другим регулирующим органом.

[00287] В вариантах осуществления устройство доставки предварительно заполнено иммуногенными композициями, представленными в настоящем описании.

Способы получения саповирус-специфических антител

[00288] Полипептиды саповируса, представленные в настоящем описании, можно использовать для получения саповирус-специфических поликлональных и моноклональных антител, которые специфически связываются/являются селективными по отношению к антигенам саповируса, соответственно. Поликлональные антитела можно получить путем введения полипептида саповируса млекопитающему, такому как мышь, кролик, коза или лошадь. Сыворотку иммунизированного животного собирают и антитела очищают от плазмы, например, осаждением сульфатом аммония с последующей хроматографией, включая аффинную хроматографию. Методы получения и обработки поликлональных антисывороток известны в данной области.

[00289] Также могут быть легко получены моноклональные антитела, направленные на саповирус-специфические эпитопы, присутствующие в полипептидах. Нормальные В-клетки млекопитающего, такого как мышь, иммунизированная полипептидом саповируса, можно слить, например, с НАТ-чувствительными клетками мышиной миеломы с получением гибридом. Гибридомы, продуцирующие саповирус-специфические антитела, можно идентифицировать с помощью RIA или ELISA и выделить путем клонирования в полутвердом агаре или путем ограничивающего разведения. Клоны, продуцирующие саповирус-специфические антитела, выделяют в ходе еще одного раунда скрининга.

[00290] Антитела, т.е. моноклональные, и антитела из поликлональных сывороток (поликлональные), которые направлены против эпитопов саповируса, особенно полезны для детектирования наличия антигенов саповируса в образце, таком как образец сыворотки человека, инфицированного саповирусом. В иммуноанализе на антиген саповируса можно использовать одно антитело или несколько антител. В иммуноанализе на антиген саповируса можно использовать, например, моноклональное антитело, направленное на эпитоп саповируса, комбинацию моноклональных антител, направленных на эпитопы одного полипептида саповируса, моноклональные антитела, направленные на эпитопы разных полипептидов саповируса, поликлональные антитела, направленные на один и тот же антиген саповируса, поликлональные антитела, направленные на разные антигены саповируса, или комбинацию моноклональных и поликлональных антител. Протоколы иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкурентных, прямых реакциях или анализах сэндвич-типа с использованием, например, меченого антитела. Метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными или радиоактивными.

[00291] Поликлональные или моноклональные антитела могут быть дополнительно использованы для выделения частиц или антигенов саповируса с помощью иммуноаффинных колонок. Антитела могут быть прикреплены к твердой подложке, например, путем адсорбции или ковалентной связи с сохранением антителами своей иммуноселективной активности. Необязательно могут быть включены спейсерные группы с тем, чтобы антигенсвязывающий сайт антитела оставался доступным. Иммобилизованные антитела затем можно использовать для связывания частиц или антигенов саповируса из биологического образца, такого как кровь или плазма. Связанные частицы или антигены саповируса извлекают из матрицы колонки, например, путем изменения рН.

[00292] Выделенные антигены можно секвенировать, а последовательности использовать для создания конструкций для рекомбинантной экспрессии выделенного антигена молекулярно-биологическими методами. В настоящем описании «конструкция» означает искусственно созданный сегмент нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), введенный в вектор, который можно использовать для включения генетического материала в ткань или клетку-мишень.

[00293] Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

ПРИМЕРЫ

[00294] Приведенные ниже примеры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

Материалы и методы:

[00295] 40 самок мышей Balb/c случайным образом распределяли по 10 клеткам по 4 мыши в каждой. Мышам дали возможность акклиматизироваться. Семь клеток с мышами (всего 28 мышей) вакцинировали подкожно дозой 0,2 мл, содержащей состав с VRx 19030 (рекомбинантный саповирусный белок; SEQ ID NO:2, серийный номер PV1070820), после смешивания с Emulsigen (серийный PV0080621). Остальные 3 клетки с мышами (всего 12 мышей) использовали в качестве невакцинированного контроля. Вакцинированных мышей повторно иммунизировали на 21-й день теми же сериями и обескровливали на 35-й день. Цельную кровь использовали для получения сыворотки. Сыворотку хранили в виде отдельных образцов, а также в виде пулов, которые формировали пропорционально для образцов от каждой из 4 мышей, содержащихся в конкретной клетке. Эти пулы рассматривали как один отдельный образец.

[00296] Сыворотку тестировали с помощью непрямого ELISA в двух экземплярах, где планшеты покрывали 0,1 мкг V19030 (рекомбинантный белок саповируса) или V19045 (рекомбинантный белок IAV-S Н3), разведенные в карбонатном буфере для покрытия. Планшеты промывали PBS-T 3 раза. Затем планшеты с антигеном блокировали 1% поливиниловым спиртом, разведенным в PBS, в течение 1 часа при 37°С. Блокирующий раствор удаляли. Пятикратные серийные разведения сывороток, начиная с 1:1000, выполняли в двух экземплярах. Сыворотку инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали PBS-T 3 раза. Конъюгат козьего анти-мышиного IgG (H+L) с пероксидазой хрена (HRP) разводили в соотношении 1:10000 (таблица 1) или 1:175000 (таблица 2), добавляли в планшеты и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Планшеты промывали PBS-T 3 раза. В планшеты добавляли субстрат ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) и инкубировали при RT (комнатной температуре) в течение 3 минут (Таблица 1) или 6,5 минут (Таблица 2). Реакцию в планшетах останавливали 1 н. H₂SO₄ (серной кислотой) и измеряли OD при 450 нм. В качестве контроля использовали невакцинированных мышей, а также только антитело 1°, только антитело 2° и только покрывающий антиген. Значения, полученные из лунок с повторами, усредняли.

[00297] Таблица 1 (Сравнение ответа на гомологичный и гетерологичный покрывающий антиген у вакцинированных и невакцинированных животных).

Гомологичный покрывающий антиген (рекомбинантно экспрессированный саповирус) Гетерологичный покрывающий антиген (рекомбинантно экспрессированный IAV- S) Разведение
1° Ab Пул вакцинированных (Ср. OD) Пул невакцинированных (Ср. OD) Пул вакцинированных (Ср. OD) Пул невакцинированных (Ср.
OD) 1:1000 1,70 0,13 0,59 0,08 1:5000 1,24 0,10 0,37 0,07 1:25000 0,55 0,08 0,16 0,06 1:125000 0,19 0,08 0,08 0,06 1:625000 0,11 0,08 0,06 0,07 1:3125000 0,09 0,08 0,06 0,07 1:15625000 0,11 0,09 0,07 0,07

OD
покрывающего Ag+1°+2° OD
покрывающего Ag+1° OD
покрывающего Ag+2° OD только покрывающего Ag Гомологичный покрывающий антиген (рекомбинантно экспрессированный саповирус) 0,17 0,05 0,10 0,05 Гетерологичный покрывающий антиген (рекомбинантно экспрессированный IAV- S) 0,10 0,04 0,07 0,04

[00298] Таблица 2 (Иммунный ответ на рекомбинантный белок саповируса).

Вакцинированные (пул на клетку) Контроль (пул на клетку) Разведение сыворотки Среднее значение (OD)
вакцинированных Среднее значение (OD)
невакцинированных 860 861 862 863 864 865 866 867 868 869 1:1000 0,812 0,083 0,795 0,846 0,794 0,856 0,835 0,820 0,743 0,082 0,087 0,079 1:5000 0,437 0,065 0,393 0,434 0,417 0,431 0,468 0,463 0,451 0,064 0,069 0,063 1:25000 0,178 0,070 0,168 0,168 0,157 0,179 0,186 0,199 0,190 0,064 0,071 0,075 1:125000 0,105 0,072 0,099 0,107 0,098 0,101 0,107 0,120 0,109 0,070 0,077 0,071 1:625000 0,085 0,071 0,086 0,079 0,082 0,085 0,087 0,094 0,087 0,073 0,071 0,071 1:3125000 0,086 0,074 0,105 0,082 0,082 0,082 0,085 0,096 0,075 0,070 0,077 0,075 1:15625000 0,088 0,089 0,095 0,086 0,082 0,085 0,088 0,098 0,082 0,094 0,089 0,083

Результаты:

[00299] Как видно из Таблиц 1 и 2, вакцинированные мыши в ответ на гомологичный антиген показали более высокий иммунологический ответ по сравнению с невакцинированными. При сравнении с гетерологичным белком, генерируемым на платформе бакуловируса, вакцинированные мыши показали ограниченный ответ, вероятно, из-за самого бакуловируса.

[00300] На фиг.1 показан специфический иммунный ответ на белок саповируса. На фиг.2 показана реакция вакцинированных и невакцинированных мышей на гомологичный белок.

[00301] Вся патентная литература, цитированная в настоящем описании, полностью включена в настоящее описание посредством ссылки.

--->

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> VST LLC dba Medgene Labs

Young, Alan

<120> САПОВИРУСНЫЕ ВАКЦИНЫ

<130> MEDG-A-SAPOVIRUS-PCT

<140> TBD

<141> 2022-06-28

<150> 63/215,571

<151> 2021-06-28

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1714

<212> ДНК

<213> САПОВИРУС

<400> 1

aagcgttact gaattcatgg aggcgcctgc cccaacccgt tcggtggcga gcaacccaga 60

gggtactcaa accagcaatg aatccaggcc agtccagcca gccgggccca tgcccgtggc 120

cgcagcccag gcccttgaga tggctgttgc cactggacaa gtcaatgaca ccatccccag 180

tgtagttaga gaaactttca gcacctacac caatgtcact tggactacac gtcagccagc 240

aggaaccctg ctcgcccgga tgaccctagg gccaggcctg aatccctaca cactccacct 300

gtccgccatg tgggccggct ggggagggtc atttgaaatt aaggtggtga tatcggggtc 360

tggcttgtat gcaggcaaat tgctgtgcgc actcatacca cctggggtag accccagtgc 420

tgtggaccag cccggggctt ttccccatgc acttgtggat gcgcgcatca ctgagggcgt 480

caccttcacc cttggggatg tcagggcagt ggattaccac gaaacaggag ctggtgggac 540

catcgcttgc ttggcactct atgtgtacca accactcatc aacccctttg aaactgcttt 600

gtcagccgcc atggtgacaa tcgagacccg ccctggccca gactttgggt tcaccctgct 660

caagcctccc aaccaaacca tggaggcggg acttgatccc agatcgctcc tgccccgcac 720

ggcaaggaca ctgcggggaa acaggtttgg cagacccatc acagccgtgg tcatagtcgg 780

catggcacac cagatcaaca ggcacttctc agccgagggc accacgcttg gctggtccac 840

agccccgatt ggtccttgtg tgggacgcat caattccagg tacaccaaca acggcggcct 900

cgccgtgctc tcaatgcaac ccctgagcaa tgggcccctt taccccaaca ttatcaacca 960

ctacccagat gtggctgctt ctaaagcatt caacacaagc actagcctga gtgacaacac 1020

cacgtgtggt gggggaccta tggtgatctt caatgatgtg ggtgatgtgg ttgagactgt 1080

gtcctaccaa atgagattta tagcctcaca agccacctcc caaacaccca caatcgttga 1140

ctacatcaat gcaacatcaa tgggattgtg cagttttggc aactctcggg gggactttgg 1200

ctcaggccag ctcaatgtgg gcgttgagtt gacctacacc tgtggcacca cagcgatcaa 1260

tgagaaagtc actacgttca tggatcgcca atacacattt ggtgcacagg ggcccaataa 1320

tatcatgctc tgggtggaga ctgtactcgg cacgcacacg ggcaacaaca ctgtgtacag 1380

ctcgcaaccc gacactgtgt ctgccgcact gcagggtcag ccctacaaca taccagatgg 1440

gtacatggct gtgtggaatg ttaatgcaga cagtgccgat ttccagatag gcctgaggcg 1500

cgatggcttc tttgtcacca gtggggccat tggcacgcgc atgaccatct cagaggacac 1560

caccttcacc tacgctggca ttttcaccct caccaccccc ctcattggac caagtgggat 1620

gacaggacgg tcccttcaca gctcacgaaa gggcgaaaac ttgtactttc aaggccatca 1680

ccatcaccat cactaggcgg ccgcagcatt tact 1714

<210> 2

<211> 559

<212> Белок

<213> САПОВИРУС

<400> 2

Met Glu Ala Pro Ala Pro Thr Arg Ser Val Ala Ser Asn Pro Glu Gly

1 5 10 15

Thr Gln Thr Ser Asn Glu Ser Arg Pro Val Gln Pro Ala Gly Pro Met

20 25 30

Pro Val Ala Ala Ala Gln Ala Leu Glu Met Ala Val Ala Thr Gly Gln

35 40 45

Val Asn Asp Thr Ile Pro Ser Val Val Arg Glu Thr Phe Ser Thr Tyr

50 55 60

Thr Asn Val Thr Trp Thr Thr Arg Gln Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ala

65 70 75 80

Arg Met Thr Leu Gly Pro Gly Leu Asn Pro Tyr Thr Leu His Leu Ser

85 90 95

Ala Met Trp Ala Gly Trp Gly Gly Ser Phe Glu Ile Lys Val Val Ile

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Cys Ala Leu Ile Pro

115 120 125

Pro Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Asp Gln Pro Gly Ala Phe Pro His

130 135 140

Ala Leu Val Asp Ala Arg Ile Thr Glu Gly Val Thr Phe Thr Leu Gly

145 150 155 160

Asp Val Arg Ala Val Asp Tyr His Glu Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ile

165 170 175

Ala Cys Leu Ala Leu Tyr Val Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Pro Phe Glu

180 185 190

Thr Ala Leu Ser Ala Ala Met Val Thr Ile Glu Thr Arg Pro Gly Pro

195 200 205

Asp Phe Gly Phe Thr Leu Leu Lys Pro Pro Asn Gln Thr Met Glu Ala

210 215 220

Gly Leu Asp Pro Arg Ser Leu Leu Pro Arg Thr Ala Arg Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Asn Arg Phe Gly Arg Pro Ile Thr Ala Val Val Ile Val Gly Met

245 250 255

Ala His Gln Ile Asn Arg His Phe Ser Ala Glu Gly Thr Thr Leu Gly

260 265 270

Trp Ser Thr Ala Pro Ile Gly Pro Cys Val Gly Arg Ile Asn Ser Arg

275 280 285

Tyr Thr Asn Asn Gly Gly Leu Ala Val Leu Ser Met Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Asn Gly Pro Leu Tyr Pro Asn Ile Ile Asn His Tyr Pro Asp Val Ala

305 310 315 320

Ala Ser Lys Ala Phe Asn Thr Ser Thr Ser Leu Ser Asp Asn Thr Thr

325 330 335

Cys Gly Gly Gly Pro Met Val Ile Phe Asn Asp Val Gly Asp Val Val

340 345 350

Glu Thr Val Ser Tyr Gln Met Arg Phe Ile Ala Ser Gln Ala Thr Ser

355 360 365

Gln Thr Pro Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn Ala Thr Ser Met Gly Leu

370 375 380

Cys Ser Phe Gly Asn Ser Arg Gly Asp Phe Gly Ser Gly Gln Leu Asn

385 390 395 400

Val Gly Val Glu Leu Thr Tyr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Ile Asn Glu

405 410 415

Lys Val Thr Thr Phe Met Asp Arg Gln Tyr Thr Phe Gly Ala Gln Gly

420 425 430

Pro Asn Asn Ile Met Leu Trp Val Glu Thr Val Leu Gly Thr His Thr

435 440 445

Gly Asn Asn Thr Val Tyr Ser Ser Gln Pro Asp Thr Val Ser Ala Ala

450 455 460

Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Asn Ile Pro Asp Gly Tyr Met Ala Val Trp

465 470 475 480

Asn Val Asn Ala Asp Ser Ala Asp Phe Gln Ile Gly Leu Arg Arg Asp

485 490 495

Gly Phe Phe Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly Thr Arg Met Thr Ile Ser

500 505 510

Glu Asp Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Leu Thr Thr Pro

515 520 525

Leu Ile Gly Pro Ser Gly Met Thr Gly Arg Ser Leu His Ser Ser Arg

530 535 540

Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His

545 550 555

<210> 3

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 3

gtctgcgagc agttgttt 18

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 4

agctcctgtt tcgtggtaat c 21

<210> 5

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 5

acaccaatgt cacttggact ac 22

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 6

tcaaccacat cacccacatc 20

<210> 7

<211> 1712

<212> ДНК

<213> САПОВИРУС

<400> 7

accgagctcg aattcatgga ggctcccgcg cctacaagac cagtcgcatc gaatccagaa 60

ggtacacaaa catctaatga aagccgccca gttcaacccg ccggcccgat gcctgtagcg 120

acagcacagg ccctggaaat ggcggtggca acaggtcagg ttaatgacac gatcccgagt 180

gtcgtcagag aaactttcag cacttacaca aacgtaacgt ggaccactcg ccagcccgca 240

ggaacgctgt tggcgcgcat gtcgcttggt ccgggtctca acccatacac cttgcacctt 300

tcagcgatgt gggcaggatg gggcggctcc ttcgaaataa aggtaattat ctcgggatcg 360

ggactctacg ccggaaaact cctttgcgcg ctcatacctc ccggtgtgga cccgtcggct 420

gtggatcaac caggtgcctt tcctcacgct ctggtggatg cccgtatcac tgagggcgtg 480

actttcactc tcggagacgt ccgcgctgta gattaccatg aaacaggagc gggcggtact 540

atcgcctgcc ttgcactgta cgtataccaa ccactgatca atccatttga gaccgcgctt 600

tccgctgcta tggtcacgat cgaaacacgt cccggaccgg actttggttt cactcttttg 660

aagcccccta accagacaat ggaagctggt ttggatccac gctctctgct cccgagaaca 720

gcgcgcactc tgagaggaaa caggttcgga agaccgatca ctggcgttgt gatagtcggc 780

atggcccatc agattaatcg tcacttttcg gcacagggaa ccacgcttgg atggtcaact 840

gcccctatag gcccatgtgt cggcaggata aattctaagt tcacgaatac aaatggccct 900

gcagtactga gcctgcagcc cctgtctaat ggacctctct atcctaatat tattaatcac 960

tacccagatg tggcggctag tagagctttc aacacgtcta ctagtttggg agcggacacc 1020

acttgcggag gaggaccaat ggttgtgttc aacgacgtgg gcgatgtagt cgagaccgta 1080

tcatatcaga tgagatttat agcgtcccaa gcaacatccc aaacgccaac gttggtggac 1140

tacatcaacg cgacctcgat ggctgtctgt agctatggca actcacgcgg cgatttcggt 1200

tcgggtcagt tgaatgttgg tgtcgaactc acctatacgt gtggcactac tgctatcaat 1260

gaaaaagtca ctacctttat ggatcgtcag tacaccttcg gtgcccaggg accgaacaac 1320

ataatgctct gggtagaaac ggttcttggt acccacactg gcaacaacac agtgtacagt 1380

tcacaacctg acacggtatc tgcggccttg caaggccagc cgtataacat ccctgatggc 1440

tacatggcgg tatggaacgt aaatgctgac tctgcagact tccaaatcgg cctccgcagg 1500

gacggtttct tcgttacatc gggcgcaatt ggaactagaa tgacgatctc ggaggacaca 1560

acgtttacat acgccggtat gtttaccctt accacgccgt tgattggacc ttcaggtatg 1620

actggtcgtt cactccattc gagtcaaaag ggcgaaaact tgtactttca aggccatcac 1680

catcaccatc actaggcggc cgcttaatta at 1712

<210> 8

<211> 559

<212> Белок

<213> САПОВИРУС

<400> 8

Met Glu Ala Pro Ala Pro Thr Arg Pro Val Ala Ser Asn Pro Glu Gly

1 5 10 15

Thr Gln Thr Ser Asn Glu Ser Arg Pro Val Gln Pro Ala Gly Pro Met

20 25 30

Pro Val Ala Thr Ala Gln Ala Leu Glu Met Ala Val Ala Thr Gly Gln

35 40 45

Val Asn Asp Thr Ile Pro Ser Val Val Arg Glu Thr Phe Ser Thr Tyr

50 55 60

Thr Asn Val Thr Trp Thr Thr Arg Gln Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ala

65 70 75 80

Arg Met Ser Leu Gly Pro Gly Leu Asn Pro Tyr Thr Leu His Leu Ser

85 90 95

Ala Met Trp Ala Gly Trp Gly Gly Ser Phe Glu Ile Lys Val Ile Ile

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Cys Ala Leu Ile Pro

115 120 125

Pro Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Asp Gln Pro Gly Ala Phe Pro His

130 135 140

Ala Leu Val Asp Ala Arg Ile Thr Glu Gly Val Thr Phe Thr Leu Gly

145 150 155 160

Asp Val Arg Ala Val Asp Tyr His Glu Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ile

165 170 175

Ala Cys Leu Ala Leu Tyr Val Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Pro Phe Glu

180 185 190

Thr Ala Leu Ser Ala Ala Met Val Thr Ile Glu Thr Arg Pro Gly Pro

195 200 205

Asp Phe Gly Phe Thr Leu Leu Lys Pro Pro Asn Gln Thr Met Glu Ala

210 215 220

Gly Leu Asp Pro Arg Ser Leu Leu Pro Arg Thr Ala Arg Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Asn Arg Phe Gly Arg Pro Ile Thr Gly Val Val Ile Val Gly Met

245 250 255

Ala His Gln Ile Asn Arg His Phe Ser Ala Gln Gly Thr Thr Leu Gly

260 265 270

Trp Ser Thr Ala Pro Ile Gly Pro Cys Val Gly Arg Ile Asn Ser Lys

275 280 285

Phe Thr Asn Thr Asn Gly Pro Ala Val Leu Ser Leu Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Asn Gly Pro Leu Tyr Pro Asn Ile Ile Asn His Tyr Pro Asp Val Ala

305 310 315 320

Ala Ser Arg Ala Phe Asn Thr Ser Thr Ser Leu Gly Ala Asp Thr Thr

325 330 335

Cys Gly Gly Gly Pro Met Val Val Phe Asn Asp Val Gly Asp Val Val

340 345 350

Glu Thr Val Ser Tyr Gln Met Arg Phe Ile Ala Ser Gln Ala Thr Ser

355 360 365

Gln Thr Pro Thr Leu Val Asp Tyr Ile Asn Ala Thr Ser Met Ala Val

370 375 380

Cys Ser Tyr Gly Asn Ser Arg Gly Asp Phe Gly Ser Gly Gln Leu Asn

385 390 395 400

Val Gly Val Glu Leu Thr Tyr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Ile Asn Glu

405 410 415

Lys Val Thr Thr Phe Met Asp Arg Gln Tyr Thr Phe Gly Ala Gln Gly

420 425 430

Pro Asn Asn Ile Met Leu Trp Val Glu Thr Val Leu Gly Thr His Thr

435 440 445

Gly Asn Asn Thr Val Tyr Ser Ser Gln Pro Asp Thr Val Ser Ala Ala

450 455 460

Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Asn Ile Pro Asp Gly Tyr Met Ala Val Trp

465 470 475 480

Asn Val Asn Ala Asp Ser Ala Asp Phe Gln Ile Gly Leu Arg Arg Asp

485 490 495

Gly Phe Phe Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly Thr Arg Met Thr Ile Ser

500 505 510

Glu Asp Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Gly Met Phe Thr Leu Thr Thr Pro

515 520 525

Leu Ile Gly Pro Ser Gly Met Thr Gly Arg Ser Leu His Ser Ser Gln

530 535 540

Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His

545 550 555

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 9

agcttccatt gtctggttag g 21

<210> 10

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 10

ccaaccactg atcaatccat ttg 23

<210> 11

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 11

aagtctgcag agtcagcatt ta 22

<210> 12

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 12

ttggtgtcga actcacctat ac 22

<210> 13

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 13

cgctctaaca taccacccta aa 22

<210> 14

<211> 1712

<212> ДНК

<213> САПОВИРУС

<400> 14

accgagctcg aattcatgga agccccagca cccacccgca gcgttgcttc gaaccctgaa 60

ggaacacaaa catcgaatga gtctcgccct gttcagcccg ctggaccgat gccggtagct 120

accgcacagg ctctcgaaat ggcagttgct acaggccagg taaacgatac aataccatcc 180

gttgtccgtg aaacctttag tacttatacg aatgtgacat ggacaactcg ccaacccgcc 240

ggtacgcttc tggccaggat gacacttggt cctggcctca atccctatac attgcacctc 300

tcggccatgt gggccggctg gggcggttcc ttcgagatta aggtggtaat ctcgggttcc 360

ggtctgtatg caggaaaatt gctttgtgca ttgattccac ctggcgttga tccctcagcg 420

gtagatcagc caggcgcttt cccgcatgca ttggttgatg cgcgtataac ggaaggagtt 480

acgttcacgt tgggcgatgt ccgcgcggtt gactatcacg agaccggcgc gggaggaaca 540

atagcatgcc tggcgcttta tgtttatcaa ccactgatta acccgtttga aacagccttg 600

agtgcagcta tggtcacaat tgagacgaga ccgggtccag actttggttt tacattgctc 660

aagccgccaa accaaaccat ggaggccggt cttgaccccc gctcgctgtt gcctaggact 720

gcacgcacac tgagaggcaa cagattcgga cgtccgataa cgggcgtagt aatagtgggt 780

atggcccacc aaataaatag acacttctca gcacaaggaa ctacgttggg ttggtcaact 840

gcaccaatag gcccttgtgt tggcagaata aacagtcgtt atacgaacag cggaggtctg 900

gcggtgctgt cgatgcaacc tctctcgaac ggacccctct atccaaatat tattaatcac 960

tacccggatg tcgccgcatc taaggcattt aacacctcaa cttctctctc tgattctact 1020

acgtgcggcg gcggtccgat ggtcatcttc aatgatgtcg gagacgtagt tgaaacagtc 1080

tcctatcaaa tgagatttat agcgtctcag gccacaagcc agactccgac tcttgtggat 1140

tacatcaacg caacgtcaat gggcctcgtc tcgtttggta atagccgtgg cgactttggc 1200

tcgggccaac ttaatgcggg cgtggaactg acatatacgt gcggtaacac tgctattaac 1260

gaaaaggtta ccacctttat ggacaggcag tacaccttcg gcgcacaagg tcccaataat 1320

atcatgctgt gggttgagac agtgttgggt acacacaccg gaaataatac ggtttattcc 1380

tctcagcctg acacagtttc agccgccctc caaggtcagc cctacaatat ccctgacgga 1440

tacatggcag tttggaacgt aaacgcagat agtgcagatt ttcagatcgg ccttagacgt 1500

gatggctttt tcgttacaag cggcgcaata ggcacacgca tgaccatctc tgaagatact 1560

acattcacgt atgcaggtat cttcacgctg actacacccc tcatcggacc gtctggtatg 1620

acgggcagaa gtttgcacaa ctcgaggaag ggcgaaaact tgtactttca aggccatcac 1680

catcaccatc actaggcggc cgcttaatta at 1712

<210> 15

<211> 559

<212> Белок

<213> САПОВИРУС

<400> 15

Met Glu Ala Pro Ala Pro Thr Arg Ser Val Ala Ser Asn Pro Glu Gly

1 5 10 15

Thr Gln Thr Ser Asn Glu Ser Arg Pro Val Gln Pro Ala Gly Pro Met

20 25 30

Pro Val Ala Thr Ala Gln Ala Leu Glu Met Ala Val Ala Thr Gly Gln

35 40 45

Val Asn Asp Thr Ile Pro Ser Val Val Arg Glu Thr Phe Ser Thr Tyr

50 55 60

Thr Asn Val Thr Trp Thr Thr Arg Gln Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ala

65 70 75 80

Arg Met Thr Leu Gly Pro Gly Leu Asn Pro Tyr Thr Leu His Leu Ser

85 90 95

Ala Met Trp Ala Gly Trp Gly Gly Ser Phe Glu Ile Lys Val Val Ile

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Cys Ala Leu Ile Pro

115 120 125

Pro Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Asp Gln Pro Gly Ala Phe Pro His

130 135 140

Ala Leu Val Asp Ala Arg Ile Thr Glu Gly Val Thr Phe Thr Leu Gly

145 150 155 160

Asp Val Arg Ala Val Asp Tyr His Glu Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ile

165 170 175

Ala Cys Leu Ala Leu Tyr Val Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Pro Phe Glu

180 185 190

Thr Ala Leu Ser Ala Ala Met Val Thr Ile Glu Thr Arg Pro Gly Pro

195 200 205

Asp Phe Gly Phe Thr Leu Leu Lys Pro Pro Asn Gln Thr Met Glu Ala

210 215 220

Gly Leu Asp Pro Arg Ser Leu Leu Pro Arg Thr Ala Arg Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Asn Arg Phe Gly Arg Pro Ile Thr Gly Val Val Ile Val Gly Met

245 250 255

Ala His Gln Ile Asn Arg His Phe Ser Ala Gln Gly Thr Thr Leu Gly

260 265 270

Trp Ser Thr Ala Pro Ile Gly Pro Cys Val Gly Arg Ile Asn Ser Arg

275 280 285

Tyr Thr Asn Ser Gly Gly Leu Ala Val Leu Ser Met Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Asn Gly Pro Leu Tyr Pro Asn Ile Ile Asn His Tyr Pro Asp Val Ala

305 310 315 320

Ala Ser Lys Ala Phe Asn Thr Ser Thr Ser Leu Ser Asp Ser Thr Thr

325 330 335

Cys Gly Gly Gly Pro Met Val Ile Phe Asn Asp Val Gly Asp Val Val

340 345 350

Glu Thr Val Ser Tyr Gln Met Arg Phe Ile Ala Ser Gln Ala Thr Ser

355 360 365

Gln Thr Pro Thr Leu Val Asp Tyr Ile Asn Ala Thr Ser Met Gly Leu

370 375 380

Val Ser Phe Gly Asn Ser Arg Gly Asp Phe Gly Ser Gly Gln Leu Asn

385 390 395 400

Ala Gly Val Glu Leu Thr Tyr Thr Cys Gly Asn Thr Ala Ile Asn Glu

405 410 415

Lys Val Thr Thr Phe Met Asp Arg Gln Tyr Thr Phe Gly Ala Gln Gly

420 425 430

Pro Asn Asn Ile Met Leu Trp Val Glu Thr Val Leu Gly Thr His Thr

435 440 445

Gly Asn Asn Thr Val Tyr Ser Ser Gln Pro Asp Thr Val Ser Ala Ala

450 455 460

Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Asn Ile Pro Asp Gly Tyr Met Ala Val Trp

465 470 475 480

Asn Val Asn Ala Asp Ser Ala Asp Phe Gln Ile Gly Leu Arg Arg Asp

485 490 495

Gly Phe Phe Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly Thr Arg Met Thr Ile Ser

500 505 510

Glu Asp Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Leu Thr Thr Pro

515 520 525

Leu Ile Gly Pro Ser Gly Met Thr Gly Arg Ser Leu His Asn Ser Arg

530 535 540

Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His

545 550 555

<210> 16

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 16

ccttgtgctg agaagtgtct at 22

<210> 17

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 17

tgatccctca gcggtagat 19

<210> 18

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 18

tctcaaccca cagcatgata tt 22

<210> 19

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 19

gactccgact cttgtggatt ac 22

<210> 20

<211> 1712

<212> ДНК

<213> САПОВИРУС

<400> 20

accgagctcg aattcatgga ggcgcctgcg cctgcccgct ccgctgcatc caatccagaa 60

ggaacacaga cctccaatga atcgcgcccc gtgcaacctg ctggaccaat gccggtagcg 120

acagcacaag cactcgagat ggctgttgct accggtcaag taaacgacac gatcccctcg 180

gttgttagag aaacattcag cacttacact aatgtcacct ggaccacccg tcaaccggcg 240

ggaacgctgc tggctcgtat gactttgggc ccaggcctca acccttacac gcttcacctt 300

tcggcgatgt gggccggatg gggcggaagc ttcgagatta aagtggtaat ctcaggctct 360

ggtctttatg cgggaaagct gctgtgtgcg ctcattccac cgggagtaga tccgagtgcc 420

gtggatcagc ccggtgcatt cccgcatgcc cttgtggacg caagaacgac cgagggcgtg 480

acatttacgc ttggagatgt tcgcgcagtc gattaccatg agactggagc cggtggaacc 540

atagcctgcc tcgctctcta cgtgtaccaa ccacttatta atccgttcga aacaacactc 600

tcggcggcta tggtcacaat cgagaccagg ccaggacccg acttcggctt tactttgctc 660

aaaccaccta atcaaaccat ggaggccggt cttgatccac gcagcctgct gccgcgtact 720

gctaggacgt tgcgcggaaa taggtttggc agacccataa ccgcagtcgt aattgttggc 780

atggctcatc agataaatcg ccatttctcc gctgaaggta ccactttggg atggagcacg 840

gcccctattg gaccatgtgt aggcagaata aacagtcgtt atacgaataa cggaggcttg 900

gcagttttgt caatgcaacc tttgagtaat ggacccctgt atccgaatat aatcaaccac 960

tatccggacg tcgcggccag tagagccttt aatacgagta catctcttac taatgatacg 1020

acatgcggag gaggtccgat ggtcatattc aatgacgtgg gtgatgttgt cgagacggta 1080

tcgtaccaga tgcgctttat tgcatcacag gccacgtctc aaacgccaac cattgtggac 1140

tatattaatg ctacatctat gggcttggca tcttttggaa attcgcgtgg agatttcggc 1200

tccggtcaac tcaatgtggg agttgagctc acatatacct gtggtaatac tgctattaat 1260

gaaaaggtaa cgacgttcat ggatagacaa tatacattcg gagcgcaagg accaaacaat 1320

ataatgcttt gggtggaaac ggtgttgggc acacataccg gtaacaatac cgtatattct 1380

tcgcagcctg atacagtgtc tgccgcgctc caaggacaac cgtacaatat cccagatggt 1440

tatatggcgg tgtggaacgt caacgccgat tcagcagact ttcaaattgg actgaggcgt 1500

gacggcttct tcgttacgag tggcgcgatt ggaacacgta tggttatcag cgaagatact 1560

acattcacgt atgcaggtat attcaccttg acgaccccgt tgatcggtcc atctggcatg 1620

actggacgta gtctgcactc aagtcgtaag ggcgaaaact tgtactttca aggccatcac 1680

catcaccatc actaggcggc cgcttaatta at 1712

<210> 21

<211> 559

<212> Белок

<213> САПОВИРУС

<400> 21

Met Glu Ala Pro Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ala Ser Asn Pro Glu Gly

1 5 10 15

Thr Gln Thr Ser Asn Glu Ser Arg Pro Val Gln Pro Ala Gly Pro Met

20 25 30

Pro Val Ala Thr Ala Gln Ala Leu Glu Met Ala Val Ala Thr Gly Gln

35 40 45

Val Asn Asp Thr Ile Pro Ser Val Val Arg Glu Thr Phe Ser Thr Tyr

50 55 60

Thr Asn Val Thr Trp Thr Thr Arg Gln Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ala

65 70 75 80

Arg Met Thr Leu Gly Pro Gly Leu Asn Pro Tyr Thr Leu His Leu Ser

85 90 95

Ala Met Trp Ala Gly Trp Gly Gly Ser Phe Glu Ile Lys Val Val Ile

100 105 110

Ser Gly Ser Gly Leu Tyr Ala Gly Lys Leu Leu Cys Ala Leu Ile Pro

115 120 125

Pro Gly Val Asp Pro Ser Ala Val Asp Gln Pro Gly Ala Phe Pro His

130 135 140

Ala Leu Val Asp Ala Arg Thr Thr Glu Gly Val Thr Phe Thr Leu Gly

145 150 155 160

Asp Val Arg Ala Val Asp Tyr His Glu Thr Gly Ala Gly Gly Thr Ile

165 170 175

Ala Cys Leu Ala Leu Tyr Val Tyr Gln Pro Leu Ile Asn Pro Phe Glu

180 185 190

Thr Thr Leu Ser Ala Ala Met Val Thr Ile Glu Thr Arg Pro Gly Pro

195 200 205

Asp Phe Gly Phe Thr Leu Leu Lys Pro Pro Asn Gln Thr Met Glu Ala

210 215 220

Gly Leu Asp Pro Arg Ser Leu Leu Pro Arg Thr Ala Arg Thr Leu Arg

225 230 235 240

Gly Asn Arg Phe Gly Arg Pro Ile Thr Ala Val Val Ile Val Gly Met

245 250 255

Ala His Gln Ile Asn Arg His Phe Ser Ala Glu Gly Thr Thr Leu Gly

260 265 270

Trp Ser Thr Ala Pro Ile Gly Pro Cys Val Gly Arg Ile Asn Ser Arg

275 280 285

Tyr Thr Asn Asn Gly Gly Leu Ala Val Leu Ser Met Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Asn Gly Pro Leu Tyr Pro Asn Ile Ile Asn His Tyr Pro Asp Val Ala

305 310 315 320

Ala Ser Arg Ala Phe Asn Thr Ser Thr Ser Leu Thr Asn Asp Thr Thr

325 330 335

Cys Gly Gly Gly Pro Met Val Ile Phe Asn Asp Val Gly Asp Val Val

340 345 350

Glu Thr Val Ser Tyr Gln Met Arg Phe Ile Ala Ser Gln Ala Thr Ser

355 360 365

Gln Thr Pro Thr Ile Val Asp Tyr Ile Asn Ala Thr Ser Met Gly Leu

370 375 380

Ala Ser Phe Gly Asn Ser Arg Gly Asp Phe Gly Ser Gly Gln Leu Asn

385 390 395 400

Val Gly Val Glu Leu Thr Tyr Thr Cys Gly Asn Thr Ala Ile Asn Glu

405 410 415

Lys Val Thr Thr Phe Met Asp Arg Gln Tyr Thr Phe Gly Ala Gln Gly

420 425 430

Pro Asn Asn Ile Met Leu Trp Val Glu Thr Val Leu Gly Thr His Thr

435 440 445

Gly Asn Asn Thr Val Tyr Ser Ser Gln Pro Asp Thr Val Ser Ala Ala

450 455 460

Leu Gln Gly Gln Pro Tyr Asn Ile Pro Asp Gly Tyr Met Ala Val Trp

465 470 475 480

Asn Val Asn Ala Asp Ser Ala Asp Phe Gln Ile Gly Leu Arg Arg Asp

485 490 495

Gly Phe Phe Val Thr Ser Gly Ala Ile Gly Thr Arg Met Val Ile Ser

500 505 510

Glu Asp Thr Thr Phe Thr Tyr Ala Gly Ile Phe Thr Leu Thr Thr Pro

515 520 525

Leu Ile Gly Pro Ser Gly Met Thr Gly Arg Ser Leu His Ser Ser Arg

530 535 540

Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His

545 550 555

<210> 22

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 22

ggctccagtc tcatggtaat c 21

<210> 23

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 23

tcattccacc gggagtagat 20

<210> 24

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 24

cacaatggtt ggcgtttgag 20

<210> 25

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 25

ggaggtccga tggtcatatt c 21

<---

Настоящее изобретение относится к медицинской биотехнологии. Предложена иммуногенная композиция, содержащая полипептиды, выбранные из группы, состоящей из аминокислот, представленных в группе SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:21 и их комбинациях. Предложен способ индукции иммунологического ответа у субъекта, включающий введение указанной композиции; и выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая белок VP1 саповируса, где кодирующая нуклеиновая кислота содержит i) последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:20 и их комбинаций. Изобретение позволяет получить иммуногенные композиции, содержащие иммуногенные полипептиды саповируса, включая иммуногенные композиции, содержащие антигены, отличные от антигенов саповируса, включая антигены, которые можно использовать при иммунизации против патогенов, вызывающих диарейные заболевания. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Иммуногенная композиция, содержащая полипептиды, выбранные из группы, состоящей из аминокислот, представленных в группе SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:21 и их комбинациях.

2. Способ индукции иммунологического ответа у субъекта, включающий введение композиции по п. 1.

3. Способ по п. 2, дополнительно включающий введение адъюванта.

4. Способ по п. 3, где введение указанной иммуногенной композиции указанному субъекту осуществляют путем топического, парентерального или мукозального введения.

5. Способ по п. 2, где указанное введение осуществляют путем многократного введения.

6. Способ по п. 5, где первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция являются одинаковыми.

7. Способ по п. 5, где первая иммуногенная композиция и вторая иммуногенная композиция являются разными.

8. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая белок VP1 саповируса, где кодирующая нуклеиновая кислота содержит i) последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:20 и их комбинаций.

9. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 8, где кодирующую нуклеиновую кислоту рекомбинируют с вектором.

10. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 9, где вектор представляет собой бакуловирусный вектор.

11. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 10, где вектор содержится в клетке-хозяине.

12. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота по п. 11, где клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого.