ШТАММ BIFIDOBACTERIUM LACTIS 672, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНЫХ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, ПРОБИОТИКА И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 A23L1/29 A61K8/99 

Область техники.

Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья.

Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактериальных препаратов.

Уровень техники.

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и иногда бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.

Продукты, содержащие бифидобактерии, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных перенесенными кишечными и другими заболеваниями, длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами.

Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья.

Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебно-профилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов: Bifidobacterium bifidum (патент FR 2336886, 29.07.1977, А 23 С 9/12), Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis (патент FR 2411008, 06.07.1979, A 61 K 35/74), Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve (патент CH 637297, 29.07.1983, A 61 K 39/02), Bifidobacterium lactis (патент US 6379663, 14.03.2002, A 01 N 63/00.

В нашей стране для приготовления бактериальных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют штаммы бифидобактерий видов: Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1578 (патент RU 2152993, 20.07.2000, C 12 N 01/20), Bifidobacterium bifidum ВКПМ S-1257 (патент RU 2108383, 10.04.1998, C 12 N 01/20), Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium bifidum 791 (патент RU 2092064 10.10.1997, А 23 С 09/12), Bifidobacterium adolescentis MC-42 (авторское свидетельство SU 863639, 15.09.1981, C 12 N 15/00). В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы, например Bifidobacterium lactis HN-019 (патент RU 2208632. 20.07.2003, С 12 N 01/20), Bifidobacterium lactis 420 (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003).

До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммов Bifidobacterium lactis в вышеуказанных областях.

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Bifidobacterium lactis 420 (прототип) (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003). Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

По ряду проверенных свойств известный штамм Bifidobacterium lactis 420 уступает заявляемому штамму Bifidobacterium lactis 672, в частности он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов (см. табл.1 и табл.2).

Раскрытие изобретения.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium lactis для использования его при изготовлении лечебно-профилактических кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии.

При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм обладает высокой биологической активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных.

Поставленная задача реализуется путем использования штамма Bifidobacterium lactis 672 (Ac-1677 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, бактериальных, косметических средств, пищевых добавок и т.д.

Штамм Bifidobacterium lactis 672 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, пробиотиков, косметических средств.

Штамм Bifidobacterium lactis 672 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) под №Ас-1677.

Заявляемый штамм выживает в условиях in vitro, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности в присутствии 40% желчи, 0,4% фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, таких как: квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соков, напитков и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Также штамм Bifidobacterium lactis 672 может широко использоваться для производства косметических средств, например: кремов, лосьонов, питательных масок, косметического молочка и т.д.

Кроме того, штамм Bifidobacterium lactis 672 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.

Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Bifidobacterium lactis 672.

Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах; в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза; при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) круглые бесцветные колонии.

Оптимальная температура выращивания 37-39°С.

Штамм сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа;

сквашивает молоко к 22 ч с образованием сгустка;

активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно-лактозной среде (ГМК-1) (состав ГМК-1: кукурузно-молочная смесь - 15 г; пептон - 15 г; лактоза - 9 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,6 г; магний сернокислый - 0,12 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 г; агар - 3 г; дистиллированная вода - 1 л), бифидум среде (БФ) (состав бифидум среды: глюкоза - 7,5 г; лактоза - 2,5 г; панкреатический гидролизат казеина - 30 г; натрий хлористый - 2,5 г; магний сернокислый - 0,5 г; L-цистеин - 0,5 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; ацетат натрия - 0,3; агар - 0,75 г; дистиллированная вода - 1 л);

максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл lg КОЕ (колониеобразующие единицы), равного 8-9;

проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблицы 1 и 2 приведены в конце описания), а именно: более чем в 10 раз снижается количество Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, более чем в 100 раз снижается количество Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Candida albicans и более чем в 1000 раз снижается количество Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis при совместном культивировании в условиях in vitro по сравнению с контролем.

Таким образом, предлагаемый штамм Bifidobacterium lactis 672 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие (12-24 ч) сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток (lg КОЕ ˜9), обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,6±0,2 в ед/мг белка).

Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм Bifidobacterium lactis 672 обладает природной устойчивостью к: азтреонаму, канамицину, линкомицину, неомицину, нетилмицину, сульфаниламиду, цефазолину, тобрамицину и чувствителен к: левомицетину, ванкомицину, доксициклину, карбенициллину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, тетрациклину, пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефалотину, цефтазидиму, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму, эритромицину.

Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм Bifidobacterium lactis 672 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами Bifidobacterium lactis.

Штамм Bifidobacterium lactis 672 обладает устойчивостью к фенолу и желчи; устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ; выраженной антагонистической активностью в отношении Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis, природной устойчивостью к: азтреонаму, канамицину, линкомицину, неомицину, нетилмицину, сульфаниламиду, цефазолину, тобрамицину; хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре, равном lg KOE˜9, на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности); выраженной антиоксидантной активностью.

Способность штамма Bifidobacterium lactis 672 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции, способность синтезировать некоторые витамины и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебно-профилактического назначения.

Осуществление изобретения.

Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium lactis 672 в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 672 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведении до 10^-9. Инкубируют при температуре 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых Bifidobacterium lactis 672 не менее 10⁸ КОЕ/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий Bifidobacterium lactis 672 с титром не менее 10⁸ КОЕ/мл, при необходимости (используя концентрирование) можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром.

Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium lactis 672 для приготовления неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 672 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведении до 10^-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую и при необходимости сконцентрированную биомассу Bifidobacterium lactis 672 вносят в пищевой продукт (молоко, соки и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 10⁶ КОЕ/мл.

Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием штамма Bifidobacterium lactis 672 в качестве компонента заквасочных культур.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Bifidobacterium lactis 672 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 10⁸ КОЕ/мл.

Получение кисломолочного продукта: полученную биомассу штамма Bifidobacterium lactis 672 в объеме до 10% вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38°С вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (рН 4,5-4,6). Продукт с концентрацией живых бифидобактерий Bifidobacterium lactis 672 не менее 10⁶ КОЕ/мл охлаждают до 22°С, разливают в тару и доохлаждают до 6°С. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Bifidobacterium lactis 672 для получения бактериальных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (например, сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁸ живых клеток бифидобактерий в 1 г. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки, равные не менее 5×10⁸-5×10¹⁰ КОЕ (для бифидобактерий), можно использовать полученный препарат в качестве препарата пробиотика.

Пример 5. Использование штамма Bifidobacterium lactis 672 для получения косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ KOE/мл.

Получение косметических средств: выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма Bifidobacterium lactis 672 вводят в состав косметического средства.

Пример 6. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 672 для получения ферментированного продукта.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ KOE/мл.

Для получения ферментированного продукта типа кваса выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 672 вносят в подготовленную основу (вода, сахар, мед, сусло, аскорбиновая кислота) совместно с Lactobacillus plantarum и Lactobacillus fermentum, перемешивают и культивируют при 37°С до получения напитка с титруемой кислотностью 65-85°Т. Затем напиток охлаждают и разливают по бутылкам. В результате получают готовый лечебно-профилактический продукт с содержанием в 1 мл не менее 10⁷ живых пробиотических микроорганизмов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья, в частности, при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, косметических средств, биологически активных добавок и пробиотика. Штамм Bifidobacterium lactis 672 ВКПМ Ac-1677 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка. Изобретение обеспечивает повышение биологической активности штамма и его устойчивости к условиям внешней среды, ускорение размножения на искусственных питательных средах, кислотообразующую и антагонистическую активности в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных. 2 табл.

Штамм бифидобактерий Bifidobacterium lactis 672 ВКПМ Ac-1677, используемый для приготовления кисломолочных лечебно-профилактических продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, пробиотика и косметических средств.