Область техники
Изобретение относится к новым штаммам бифидобактерий и их использованию в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья. Заявляемый штамм, в частности, может использоваться при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.
Уровень техники
В связи с неблагоприятными экологическими условиями, длительной и иногда бессистемной антибиотикотерапией увеличивается количество людей и животных, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, обладающим пробиотическим действием, так и пищевым продуктам, содержащим бифидобактерии.
Продукты, содержащие бифидобактерии, являются эффективным средством профилактики, а также лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, а также кишечных дисбактериозов, обусловленных перенесенными кишечными и другими заболеваниями, длительной антибиотикотерапией, лучевой и химиотерапией, стрессовыми воздействиями, неблагоприятными условиями окружающей среды и другими факторами.
Устойчивость бактерий к условиям желудочно-кишечного тракта является важным критерием для отбора штаммов, способствующих укреплению здоровья.
Качество лечебно-профилактических продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов бифидобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебно-профилактического питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека и животных, восстановить их нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.
Известны зарубежные моно- и комплексные препараты - эубиотики и кисломолочные продукты, включающие в свой состав бифидобактерии видов Bifidobacterium bifidum (патент FR 2336886, 29.07.1977, А 23 С 9/12), Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis (патент FR 2411008, 06.07.1979, A 61 K 35/74), Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve (патент CH 637297, 29.07.1983, A 61 K 39/02), Bifidobacterium lactis (патент US 6379663, 14.03.2002, A 01 N 63/00.
В нашей стране для приготовления бактерийных препаратов и продуктов лечебно-диетического питания применяют штаммы бифидобактерий видов Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1578 (патент RU 2152993, 20.07.2000, C 12 N 01/20), Bifidobacterium bifidum ВКПМ S-1257 (патент RU 2108383, 10.04.1998, C 12 N 01/20), Bifidobacterium longum B379M, Bifidobacterium bifidum 791 (патент RU 2092064, 10.10.1997, А 23 С 09/12), Bifidobacterium adolescentis MC-42 (авторское свидетельство SU 863639, 15.09.1981, C 12 N 15/00). В кисломолочных продуктах, обогащенных бифидобактериями, используют и зарубежные штаммы, например Bifidobacterium lactis HN-019 (патент RU 2208632, 20.07.2003, С 12 N 01/20), Bifidobacterium lactis 420 (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003).
До настоящего времени ничего не известно об использовании отечественных штаммов Bifidobacterium lactis в вышеуказанных областях.
Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм Bifidobacterium lactis 420 (прототип) (спецификация на штамм, Bifidobacterium lactis 420 компании «DANISCO», от 02.05.2003). Штамм обладает антагонистической активностью в отношении некоторых патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
По ряду проверенных свойств известный штамм Bifidobacterium lactis 420 уступает заявляемому штамму Bifidobacterium lactis 668, в частности, он более чувствителен к фенолу, желчи и менее активен в отношении некоторых патогенных микроорганизмов (см. табл.1 и табл.2).
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Bifidobacterium lactis для использования его при изготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, биологически активных добавок, бактерийных препаратов, косметических средств и т.п. средств, содержащих бифидобактерии.
При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм обладает высокой биологической активностью, в частности высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью) в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках, устойчивостью к условиям внешней среды, быстро размножается на искусственных питательных средах, обладает кислотообразующей и антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных.
Поставленная задача реализуется путем использования штамма Bifidobacterium lactis 668 (Ac-1673 ВКПМ) в составе заквасок, продуктов питания, лекарственных, бактериальных, косметических средств и т.д.
Штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован в моно- или композиционной пробиотической концепции при получении или изготовлении различных заквасок, кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов, косметических средств.
Штамм Bifidobacterium lactis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ (Россия, Москва, 113545, 1-й Дорожный проезд, 1, ГНИИГ-ВКПМ) под №Ас-1673.
Заявляемый штамм выживает в условиях in vitro, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в частности, в присутствии 40% желчи, 0,4% фенола, ферментов ЖКТ и при низких значениях рН.
Заявляемый штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, таких как квас и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок и биологически активных добавок к пище. Также штамм Bifidobacterium lactis 668 может широко использоваться для производства косметических средств, например кремов, лосьонов, питательных масок, гелей, косметического молочка и т.д.
Кроме того, штамм Bifidobacterium lactis 668 может быть использован и при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других средств.
Культуральные, морфологические и физиолого-биохимические свойства штамма Bifidobacterium lactis 668.
Клетки представляют собой грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, каталазоотрицательные, анаэробные, полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах; в жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза; при росте на агаризованной среде ГМК в анаэробных условиях образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) круглые бесцветные колонии.
Оптимальная температура выращивания 37-39°С.
Штамм Bifidobacterium lactis 668 сбраживает глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, ксилозу, арабинозу, раффинозу с образованием уксусной и молочной кислот, без образования газа;
сквашивает молоко к 32 ч с образованием сгустка;
активно наращивает микробную массу при росте на кукурузно-лактозной среде (ГМК-1) (состав ГМК-1: кукурузно-молочная смесь - 15 г; пептон - 15 г; лактоза - 9 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; натрий лимоннокислый трехзамещенный - 0,6 г; магний сернокислый - 0,12 г; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 1 г; агар - 3 г; дистиллированная вода - 1 л), бифидум среде (БФ) (состав бифидум среды: глюкоза - 7,5 г; лактоза - 2,5 г; панкреатический гидролизат казеина - 30 г; натрий хлористый - 2,5 г; магний сернокислый - 0,5 г; L-цистеин - 0,5 г; аскорбиновая кислота - 0,5 г; дрожжевой экстракт - 5 г; ацетат натрия - 0,3; агар - 0,75 г; дистиллированная вода - 1 л);
максимально накапливает микробную массу к 12-24 ч, достигая в 1 мл Ig КОЕ (колониеобразующие единицы) равного 8-9;
проявляет антагонистические свойства в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры (таблицы 1 и 2 приведены в конце описания), а именно более чем в 100 раз угнетают рост Candida albicans и Proteus vulgaris, более чем в 10000 раз угнетают рост Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, более чем в 100000 раз угнетают рост Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis при совместном культивировании в условиях in vitro.
Таким образом, предлагаемый штамм Bifidobacterium lactis 668 технологичен, поскольку активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-24 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией микробных клеток (Ig КОЕ˜9); обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой антиоксидантной активностью (супероксиддисмутазной активностью, СОД-активность равна 95,0±0,1 в ед/мг белка).
Кроме того, изучение спектра чувствительности к антибиотикам и антибактериальным препаратам выявило, что штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; чувствителен к левомицетину, ампициллину, бензилпенициллину, ванкомицину, доксициклину, карбенициллину, линкомицину, меропенему, оксациллину, олеандомицину, офлоксацину, пиперациллину, рифампицину, фурагину, фурадонину, фуразолидону, цефепиму, цефотаксиму, цефтриаксону, цефуроксиму.
Таким образом, по ряду свойств и их совокупности штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает большей биологической активностью по сравнению с известными штаммами Bifidobacterium lactis.
Штамм Bifidobacterium lactis 668 обладает устойчивостью к фенолу и желчи; устойчивостью к низким значениям рН и ферментам ЖКТ; выраженной антагонистической активностью в отношении Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Shigella sonnei, Citrobacter freundii, Bacillus subtilis; природной устойчивостью к азтреонаму, амикацину, гентамицину, канамицину, неомицину, нетилмицину, полимиксину, сизомицину, стрептомицину, сульфаниламиду, тобрамицину, цефтазидиму; хорошей технологичностью (способностью штамма вырастать в большом титре равном Ig КОЕ˜9 на подобранных средах и хорошо сохраняться в кисломолочных продуктах в течение необходимого продолжительного срока годности); выраженной антиоксидантной активностью.
Способность штамма Bifidobacterium lactis 668 вырастать в большом титре в питательной среде в короткие сроки культивирования, его антагонистическая, кислотообразующая, антиоксидантная активности, способность сохраняться в течение длительного времени в кисломолочной продукции и другие полезные свойства делают возможным использование штамма в составе различных продуктов питания и средств лечебно-профилактического назначения.
Осуществление изобретения
Пример 1. Использование штамма Bifidobacterium lactis 668 в составе биологических веществ, в частности в составе биологически активных добавок.
1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 668 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при температуре 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл.
В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой суспензию клеток бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 с титром не менее 108 КОЕ/мл, при необходимости можно получить концентрат клеток бифидобактерий с более высоким титром.
Пример 2. Использование штамма Bifidobacterium lactis 668 для приготовления неферментированных пищевых продуктов.
1 пассаж: лиофилизированный штамм Bifidobacterium lactis 668 в количестве ˜0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной бифидум средой и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру из 10-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную бифидум среду и культивируют при температуре 37-38°С в течение 12-24 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл.
Получение неферментированного пищевого продукта: выросшую и, при необходимости, сконцентрированную биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки и пр.), перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых бифидобактерий не менее 106 КОЕ/мл.
Пример 3. Приготовление кисломолочного продукта лечебно-профилактического назначения с использованием штамма Bifidobacterium lactis 668 в качестве компонента заквасочных культур для приготовления ферментированных кисломолочных продуктов.
1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в бифидум среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10-9. Инкубируют при 37-38°С до образования видимого роста в последних разведениях.
2 пассаж: выросшую культуру штамма Bifidobacterium lactis 668 из последних разведений вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы с содержанием бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл.
3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-24 ч при 37-38°С до получения биомассы с содержанием живых бифидобактерий не менее 108 КОЕ/мл.
Получение кисломолочного продукта: полученную биомассу штамма Bifidobacterium lactis 668 в объеме до 10% вносят в пастеризованную молочную смесь при температуре 37-38°С вместе с другими заквасочными культурами, используемыми по норме, культивируют до образования сгустка (рН 4,5-4,6). Продукт с концентрацией живых бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 не менее 106 КОЕ/мл охлаждают до 22°С, разливают в тару и доохлаждают до 6°С. Количество пассажей может быть увеличено в зависимости от объема производства.
Пример 4. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения бактериальных препаратов.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий с содержанием живых клеток не менее 108 КОЕ/мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, или флаконы, или другие емкости, замораживают при температуре минус 40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 108 живых клеток бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 в 1 г. Формируя дозы адекватного уровня потребления пробиотических микроорганизмов в сутки, равные не менее 5×108-5×1010 КОЕ (для бифидобактерий), можно использовать полученный препарат в качестве бактериального препарата пробиотика.
Пример 5. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения косметических средств.
Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную бифидум среду, культивируют при температуре 37-38°С до получения биомассы бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 с содержанием живых клеток не менее 108 КОЕ/мл. Получение косметических средств: выросшую биомассу (при необходимости концентрат) штамма 668 бифидобактерий вводят в состав косметического средства.
Пример 6. Использование штамма бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 для получения ферментированной пищевой добавки.
Морковь, капусту и предварительно замоченные в воде пшеничные отруби в соотношении 2:1:1 измельчают в гомогенизаторе и полученный растительный субстрат пастеризуют при 80°С в течение 10 минут, вносят в него смесь Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium lactis 668 в соотношении 1:1 и концентрацией 109 КОЕ/см3 и осуществляют ферментацию субстрата при 37°С в течение 24 ч. Полученная добавка обеспечивает становление экосистемы пищеварительного тракта человека.
Антагонистическая активность штаммов 668 (заявляемый) и 420 (прототип) в отношении патогенных микроорганизмов
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой, косметической, биотехнологической, медицинской промышленности и ветеринарии с целью укрепления здоровья, в частности при приготовлении кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Штамм Bifidobacterium lactis 668 выделен из содержимого кишечника здорового ребенка и депонирован в ВКПМ под №Ас-1673. Изобретение обеспечивает повышение биологической активности штамма и его устойчивости к условиям внешней среды, ускорение размножения на искусственных питательных средах, кислотообразующую и антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Получение штаммов, обладающих подобными свойствами, способствует расширению ассортимента пробиотиков, используемых для поддержания здоровья, в частности для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного и мочеполового трактов, кожных и слизистых покровов человека и животных. 2 табл.
Штамм бифидобактерий Bifidobacterium lactis 668 ВКПМ Ac-1673, используемый для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов и косметических средств.
