СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ АНЕМИИ ПРИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/72 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях.

В настоящее время большое внимание уделяют проблеме развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях (ГВЗ), патогенез которой недостаточно выяснен [Луговская С.А. Патогенез и диагностика анемий при хронических заболеваниях // Клиническая лабораторная диагностика, 1997, №12, с.19-22. Габитова Р.З., Джурабекова Д.Х. Изменение порфиринового обмена у детей при анемии, сопровождающей сепсис // Здравоохранение Таджикистана, 1974, №3, с.28-30]. Взаимодействие возбудителя с эритроцитами осуществляется посредством факторов патогенности. Одним из основных факторов патогенности микроорганизмов является гемолитическая активность [Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. Екатеринбург: УрО РАН, 2000, с.85-90]. В результате ее мембраноповреждающей способности происходит лизис эритроцитов с последующим освобождением гемоглобина [Иванов Н.Р., Брилль Г.Е. Молекулярно-клеточные аспекты гемолитического действия стафилококкового α-токсина // Журн. микробиол., 1984, №9, с.3-9]. При повышенной активности гемолизинов нарушается структура белкового компонента гемоглобина - глобина, что ведет к нарушению транспорта кислорода и развитию циркуляторной гипоксии [Белокуров Ю.Н., Граменицкий А.Б., Молодкин В.М. Сепсис. М.: Медицина, 1983, с.89]. По имеющимся данным литературы, значение гемолитической активности в развитии анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях до конца не выяснено.

Способность усвоения железа является для большинства патогенных микроорганизмов необходимым фактором жизнеобеспечения. В макроорганизме подавляющее количество железа (76%) находится в форме гемсоединений, к которым относится гемоглобин [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002, с.139]. При развитии инфекционного процесса между макроорганизмом и бактериями происходит активная конкурентная борьба за железо [Горлина М.Х. Железо и патогенность бактерий // Журнал микробиол., 1985, №3, с.103-108].

Для дифференциальной диагностики анемий известны специальные биохимические [Козловская Л.В., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования. - М.: Медицина, 1984, с.109-141], иммунологические [Морозова В.Т. Гематологические исследования в диагностике заболеваний // Клиническая лабораторная диагностика, 1996, №6, с.3-7], морфологические [Гусева С.А., Вознюк В.П. Болезни системы крови. М.: МЕДпресс-информ, 2004, с.13-17] методы исследования. Однако неизвестны способы прогнозирования развития анемии у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.

Актуальным является разработка способов прогнозирования развития анемии у больных гнойно-воспалительными заболеваниями, а не только способов ее диагностики.

Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в создании способа прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях.

Для достижения названного технического результата в предлагаемом способе прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях из очага гнойно-воспалительного заболевания выделяют чистые культуры микроорганизмов, определяют их гемолитическую активность (ГА) и антигемоглобиновую активность (АнтиHbA) и при значениях первого показателя (ГА) больше или равной 70% гемолиза, а второго (АнтиHbA) более 3 г/л прогнозируют развитие анемии.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературы не обнаружено.

Известна способность микроорганизмов утилизировать железо из гемоглобина - антигемоглобиновая активность (АнтиHbA) [з. №2004116154/15 (017344) от 27.05.2004, пол. реш. от 28.03.2005 о выдаче патента на изобретение ″Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов″]. В данном патенте на изобретение была показана обратная связь между уровнем АнтиHbA микроорганизмов и концентрацией гемоглобина в крови у больных гнойно-воспалительными заболеваниями.

Известен способ количественного определения гемолитической активности (ГА) микроорганизмов, где штаммы микроорганизмов считались высокоактивными при гемолизе эритроцитов от 70 до 100%, среднеактивными - от 40 до 70%, слабоактивными - от 2 до 40% [Азнабаев Г.К. Некоторые биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях: Автореф. дис....канд. мед. наук. - Оренбург, 2003, с.26.].

Авторами экспериментально установлена зависимость концентрации гемоглобина в крови у людей с гнойно-воспалительными заболеваниями от уровня выраженности гемолитической активности и антигемоглобиновой активности микроорганизмов. Обследовано 95 человек с гнойно-воспалительными заболеваниями (фурункулы, флегмоны, абсцессы, сепсис). У каждого больного был проведен общий анализ крови, при котором уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Одновременно, из очага гнойно-воспалительного заболевания были выделены штаммы микроорганизмов, у которых исследовали уровень выраженности гемолитической активности и антигемоглобиновой активности. Результаты исследований представлены в таблице.

Уровень выраженности гемолитической, антигемоглобиновой активностей микроорганизмов и концентрация гемоглобина в крови у людей с локализованной гнойно-воспалительной инфекцией  Из них % штаммов с уровнем экспрессии:Группы больных с разной концентрацией Hb в крови (г/л)Количество выделенных штаммовГА ≥70% гемолиза АнтиHbA >3 г/лГА <70% гемолиза АнтиHbA ≤3 г/лГА ≥70% гемолиза АнтиHbA ≤3 г/лГА <70% гемолиза АнтиHbA >3 г/л120-140 (норма)6212,9±4,267,8±5,911,2±4,08,1±3,470-90 (анемия)14576,6±3,56,9±2,18,9±2,47,6±2,2Р<0,05<0,05  

Как видно из таблицы, среди больных без анемии (концентрация гемоглобина крови была в норме, 120-140 г/л) преобладали штаммы микроорганизмов со значением гемолитической активности <70% гемолиза и антигемоглобиновой активности ≤3 г/л, тогда как среди больных с анемией (концентрация гемоглобина была ниже нормы, 70-90 г/л) в 5,9 раза чаще выделялись штаммы микроорганизмов с ГА ≥70% гемолиза и АнтиHbA >3 г/л, чем от больных без анемии (76,6±3,5% против 12,9±4,2%).

Штаммы микроорганизмов с уровнем выраженности ГА ≥70% гемолиза и АнтиHbA ≤3 г/л, а также с уровнем выраженности ГА <70% гемолиза и АнтиHbA >3 г/л выделялись в одинаковой степени как от больных, у которых концентрация гемоглобина крови была в норме (120-140 г/л), так и от больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы (70-90 г/л).

Было сделано заключение о том, что если микроорганизмы, выделенные из очага гнойно-воспалительного заболевания, обладают ГА больше или равной 70% гемолиза и АнтиHbA более 3 г/л, можно прогнозировать развитие анемии у больного.

Затем исследовали влияние гемолитической и антигемоглобиновой активностей микроорганизмов на эритроциты крови человека. Для этого были созданы условия in vitro, при которых происходило взаимодействие микроорганизмов с эритроцитами крови человека. Был отобран штамм Staphylococcus epidermidis с уровнем выраженности ГА ≥70% гемолиза и АнтиHbA >3 г/л. Штамм выделили из очага гнойно-воспалительного заболевания. Изучаемый штамм S.epidermidis выращивали на мясо-пептонном агаре при t=37°C в течение 24 ч, готовили его взвесь на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд КОЕ/мл. Затем смешивали отмытые буферным раствором эритроциты в концентрации 10⁶ кл/мл объемом 1 мл с взвесью штамма S.epidermidis объемом 3 мл, после чего добавили 1 мл жидкой питательной среды 199 (НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова, г.Уфа). В качестве контроля (I) брали взвесь эритроцитов объемом 1 мл, которую вносили в 3 мл физиологического раствора и в 1 мл жидкой питательной среды 199; контроль (II) - 3 мл взвеси S.epidermidis вносили в 1 мл физиологического раствора и в 1 мл жидкой питательной среды 199.

Опытную и контрольные пробы инкубировали 6 ч при t=37°C, затем три раза отмывали с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин с применением 0,2 н. фосфатного буфера (рН 7,2). Часть полученных осадков обрабатывали для световой микроскопии по известной методике [Предтеченский В.Е. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Смирновой Л.Г. и Кост Е.А. Изд-во мед. лит-ры МЕДГИЗ, 1960, Москва, с.33-34].

Другую часть полученных осадков обрабатывали методами для электронной микроскопии [Семченко В.В., Барашкова С.А., Артемьев В.Н. Гистологическая техника. - Омск, 2003]. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-3, подвергали двойному контрастированию растворами уранилацетата и цитрата свинца. Исследование ультратонких срезов и их выборочное фотографирование проводили в электронном микроскопе ЭМВ-100 АК.

В результате проведенных опытов при световой микроскопии была обнаружена адгезия S.epidermidis на эритроцитах. На поверхности эритроцитов были видны многочисленные кокки. В некоторых эритроцитах обнаружили вакуоль, внутри которой находились кокки. Предположительно был сделан вывод о внутриклеточном паразитировании стафилококков.

В результате электронной микроскопии наблюдали скопление кокков между эритроцитами, кокки были в стадии деления (размножения) (фиг.1). Сами эритроциты находились в состоянии пойкилоцитоза (разноформенности) и анизоцитоза (разноразмерности), так же наблюдали ″опустошенные″ эритроциты без гемоглобина (″тени″ эритроцитов) (фиг.2). Такое изменение формы и размера эритроцитов свидетельствовало о начале развития анемии [Гусева С.А., Вознюк В.П. Болезни системы крови. М.: МЕДпресс-информ, 2004, с.28-33].

Вопрос о внутриклеточном паразитировании оставался открытым. Для его решения необходимо было воспроизвести экспериментальную инфекцию на животных с использованием штаммов, обладающих гемолитической и антигемоглобиновой активностями.

Объектом для исследования явились белые беспородные мыши. Для экспериментальной модели генерализованной стафилококковой инфекции применяли внутривенный метод заражения животных. Для заражения использовали клоны клинического штамма S.epidermidis, выделенного от больного из очага гнойно-воспалительного заболевания. Данные клоны отличались между собой только по двум признакам:

Клон №5 - ГА - 83,2% гемолиза и АнтиHbA - 10,6 г/л;

Клон №6 - ГА - 45,6% гемолиза и АнтиHbA - 1,8 г/л;

Клон №15 - ГА - 71,5% гемолиза и АнтиHbA - 2,3 г/л;

Клон №9 - ГА - 39,4% гемолиза и АнтиHbA - 1,1 г/л.

Далее клоны с заданными свойствами выращивали на мясо-пептонном агаре при t=37°С в течение 24 часов, готовили их взвеси на физиологическом растворе в концентрации 50-85 млн КОЕ/мл. Внутривенное инфицирование проводили 0,1 мл каждой готовой взвеси разным животным.

После заражения проводили забор крови, затем обрабатывали ее для световой и электронной микроскопии по известным методикам, указанным выше.

В качестве контроля использовалась кровь здоровых мышей.

По результатам световой микроскопии, после 48 часов заражения, наблюдали пойкилоцитоз и анизоцитоз эритроцитов. На поверхности эритроцитов и около них было видно большое количество кокков.

Дополнительные электронно-микроскопические исследования крови мышей после 48 ч заражения показали возможность проникновения клона №5 (ГА ≥70% гемолиза и АнтиHbA >3 г/л) клинического штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов. В основе проникновения штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов лежит механизм эндоцитоза. Это доказывается следующими фактами. После адгезии S.epidermidis к клеточной мембране эритроцитов происходит нарушение целостности плазмолеммы эритроцитов и постепенное погружение штамма S.epidermidis в гиалоплазму (фиг.3, 4). Описан феномен внутриэритроцитарного расположения кокков. При этом у кокков сохранялась клеточная оболочка, но наблюдались реактивно измененные ультраструктуры цитоплазмы и нуклеоида (фиг.5). Участки цитоплазмы эритроцитов, прилежащие к зоне внутриклеточного расположения кокков, претерпевали ультраструктурные изменения. Это проявлялось в снижении электронной плотности цитоплазмы, появлении микровезикул и остаточных телец (фиг.6).

При проникновении клона №9 (ГА <70% гемолиза и АнтиHbA ≤3 г/л) клинического штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов наблюдали внутриэритроцитарное разрушение данного клона. В месте его локализации разрушается цитоплазма эритроцита (фиг.7).

При проникновении клонов №6 и №15 клинического штамма S.epidermidis в цитоплазму эритроцитов наблюдали такое же внутриэритроцитарное разрушение клонов, как и при проникновении клона №9.

На основе проведенных исследований установлено, что клоны штамма стафилококка с гемолитической активностью больше или равной 70% гемолиза и антигемоглобиновой активностью больше 3 г/л (клон №5) способны переживать внутри эритроцитов, разрушая гемоглобин, что сопровождается падением уровня общего гемоглобина крови и развитием анемии. Тогда как штаммы с гемолитической активностью меньше 70% гемолиза и антигемоглобиновой активностью меньше или равной 3 г/л подвергаются деструктивным изменениям и погибают (клоны №9, 6, 15).

Способ осуществляется следующим образом:

1) выделяют культуру микроорганизмов из очага гнойно-воспалительного заболевания;

2) определяют уровень гемолитической и антигемоглобиновой активностей исследуемой культуры микроорганизмов;

3) при значениях гемолитической активности ≥70% гемолиза и антигемоглобиновой активности >3 г/л прогнозируют развитие анемии при гнойно-воспалительном заболевании.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Больная К., 10 лет. Поступила в ОЦДХ с диагнозом: ″Фурункул нижней губы″. Из очага гнойно-воспалительного заболевания выделили штамм S.epidermidis. Было проведено исследование на наличие у выделенного штамма микроорганизма гемолитической и антигемоглобиновой активностей. Для этого исследуемую культуру микроорганизмов выращивали на мясо-пептонном агаре при t=37°C в течение 24 ч, затем определяли уровень выраженности гемолитической и антигемоглобиновой активностей по разработанным методикам [Азнабаев Г.К. Некоторые биологические свойства бактерий рода Citrobacter, выделенных при моно- и ассоциированных бактериальных инфекциях: Автореф. дис....канд. мед. наук. - Оренбург, 2003, с.26. и з. №2004116154/15 (017344) от 27.05.2004, пол. реш. от 28.03.2005 о выдаче патента на изобретение ″Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов″].

В результате исследования у штамма S.epidermidis обнаружили наличие двух факторов с уровнем выраженности: ГА - 88% гемолиза; АнтиHbA - 15,5 г/л. Параллельно, больной был сделан общий анализ крови, который показал: гемоглобин - 89 г/л; эр - 3,15; ц.п. - 0,93.

Было сделано заключение о том, что штамм S.epidermidis со значениями гемолитической активности больше или равной 70% гемолиза и антигемоглобиновой активности более >3 г/л способствовал развитию у больной анемии при гнойно-воспалительном заболевании.

Пример 2. Больной X., 5 лет. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: ″Сепсис. Острый гематогенный остеомиелит правого плеча″. Из крови был выделен штамм S.aureus. У выделенного штамма S.aureus определяли наличие двух исследуемых факторов согласно примеру 1. В результате исследования обнаружили уровень выраженности ГА - 80,4% гемолиза и АнтиHbA - 7,6 г/л, что дает возможность прогнозировать возникновение анемии. Был сделан общий анализ крови: концентрация гемоглобина крови снизилась до 83 г/л, количество эритроцитов до 2,5; ц.п. - 0,99. Прогноз подтвердился. После проведения этиотропной терапии у больного X. концентрация гемоглобина крови повысилась до нормальных значений - 120 г/л; эр - 3,3; ц.п. - 1,0.

Было сделано заключение о том, что уровни выраженности гемолитической и антигемоглобиновой активностей (ГА ≥70% гемолиза и АнтиHbA >3 г/л) способствуют развитию анемии при гнойно-воспалительном заболевании.

Пример 3. Больной Т., 13 лет. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: ″Подбородочная аденофлегмона″. Из очага воспаления был выделен штамм S.epidermidis, у которого исследовали наличие гемолитической и антигемоглобиновой активности согласно примеру 1. Результаты исследования показали, что уровень ГА составил 39,2% гемолиза, АнтиHbA - 0,9 г/л. Выделенный штамм S.epidermidis обладал низким уровнем выраженности данных факторов. Показатели общего анализа крови находились в пределах нормы: Hb - 132 г/л; эр - 3,8; ц.п. - 1,5. При повторном анализе крови концентрация гемоглобина оставалась в пределах нормы: Hb - 128 г/л; эр - 3,6; ц.п. - 1,2. Было сделано заключение о том, что штамм S.epidermidis с уровнем выраженности гемолитической активности <70% гемолиза и антигемоглобиновой активности ≤3 г/л не способствует развитию анемии при гнойно-воспалительном заболевании.

Пример 4. Больной С., 15 лет. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: ″Флегмона правого плеча″. Из очага воспаления был выделен штамм S.aureus, у которого исследовали наличие гемолитической и антигемоглобиновой активности согласно примеру 1. Результаты исследования показали, что уровень ГА составил 70,6% гемолиза, АнтиHbA - 2,1 г/л. Показатели общего анализа крови находились в пределах нормы: Hb - 152 г/л; эр - 4,6; ц.п. - 1,0. При повторном анализе крови концентрация гемоглобина оставалась в пределах нормы: Hb - 138 г/л; эр - 4,1; ц.п. - 1,2. Было сделано заключение о том, что штамм S.aureus с уровнем выраженности гемолитической (≥70% гемолиза) и антигемоглобиновой (≤3 г/л) активностей не способствует развитию анемии при гнойно-воспалительном заболевании.

Таким образом, заявляемый способ позволяет прогнозировать развитие анемии у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии. Способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях осуществляют путем определения гемолитической активности (ГА) и антигемоглобиновой активности (АнтиHbA) микроорганизмов, выделенных из очага гнойно-воспалительного заболевания. При значениях показателя (ГА) больше или равной 70% гемолиза, а показателя (АнтиHbA) более 3 г/л прогнозируют развитие анемии. Использование способа позволяет прогнозировать развитие анемии у больных гнойно-воспалительными заболеваниями. 1 табл., 7 ил.

Способ прогнозирования развития анемии при гнойно-воспалительных заболеваниях, заключающийся в том, что из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции выделяют чистые культуры микроорганизмов, определяют их гемолитическую активность (ГА) и антигемоглобиновую активность (АнтиHbA) и при значениях первого показателя (ГА) больше или равных 70% гемолиза, а второго (АнтиHbA) более 3 г/л прогнозируют развитие анемии.