Способ определения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах Советский патент 1986 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и может быть использовано клинико-диаг ностическими и научно-исследовательскими лабораториями для диагностики ; гемолитических с анемий и оценки метаболизма эритроцитов. Цель изобретения - повьтение точности способа за счет исключения ин гибирования фермента фиксацией и до бавленип в инкубационную среду дополнительно хлористого магния, гепа рина и метиленовой сини, проведения инкубации непосредственно с пробой крови, приготовления мазков и подсчета в них .среднего числа гранул формазана в одном эритроците. Способ осуществляют следующим .образом. Из пальца пациента берут 0,05 мкл .крови и смешивают с 0,1 мкл инкубаци онной среды в центрифужной пробирке, которая предварительно нагрета до Состав инкубационной среды приведен, в таблице. Кровь инкубируют в термостате при в течение 30 мин, предварительно тщательно и осторожно перешав с инкубационной средой.-По истечении срока инкубации делают мазок, высушивают и микроскопируют (Окуляр X 10 объектив X 90). При микроскопии мазков подсчитывают общее количество гранул формазана в 200 эритроцитах и определяют среднее содержание гранул в одном эритроците, что и является показателем активности фермента. Разработаны критерии для оценки активности Г-6-ФДГ при использовании предлагаемого способа: при средней концентрации гранул от 3 до 5 констатируют сниженную, от 7 до 9 нормальную, от 10 до 14 - повышенную активность фермента. II р и м е р 1 . Больной М., 32 го .да, поступил с диагнозом: острая лекарственная гемолитическая анемия. С 15-летного возраста страдает приступами острого гемолиза, связанными с приемами анальгина. Антибиотики гемолитических кризов не дают. Анализ крови: гемоглобилин 73,0 г эритроцнтЕ 2250000, ц.п. 0,95; ретикулоциты (45 тыс./мкл). Содержапие непря;.юго билирубина в сыво 142 ротке крови 45 мкмоль/л. Реакция Кумбса отрицательная. Для выяснения причины гемолиза эритроцитов проведено определение активности Г-6-ФДГ по предлагаемому способу. У обследуемого больного общее количество гранул в 200 эритроцитах составило 631. Следовательно, активность Г-6-ФДГ составляет 3,15, что свидетельствует о низком уровне активности фермента, обусловившем острый гемолиз эритроцитов после приема анальгетиков. П р и м е р 2. Больная Р. 40 лет, поступила с диагнозом: гемолитическая анемия. Анализ крови: гемоглобин 50 г/л; эритроциты 1600000; ц.п. 0,9; ретикулоциты 1,2% (19,2 тыс/мкл). В миелограмме содержание эритроидных клеток 45%. Содержание непрямого билирубина в сыворотке крови составляет 14 мкмоль/л, прямого нет. С целью исключения гемолитической анемии, обусловленной недостаточной активностью глюкозо-б-фосфатде гидрогеназы эритроцитов, проведено определение активности данного фермента по предлагаемому способу. У обследуемой больной общее количество гранул в 200 эритроцитах составило 1566. Таким образом, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы составляет 7,83, что соответствует нормальному уровню и позволяет иск.гаочить дефицит фермента как причину гемолиза эритроцитов. П р И М е р 3. Больной Б. 35 лет, поступил с диагнозом: гемолитическая анемия. Анализ крови: гемоглобин 87 г/л; эритроциты 2900000; ц.п. 0,9; ретикулоциты 20% (580 тыс/мкл). Содержание непрямого билирубина в сыворотке крови 37 мкмоль/л, реакция Кумбса отрицательная. В мазке крови выражен микроцитоз. Осмотическая резистентность эритроцитов снижена. При объективном исследовании больного обнаружено увеличение селезенки. При .определении активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по предлагаемому способу обнаружены высокие показатели: 12,8, что позволяет исключить энзимопенический вариант гемолитической анемии и подтверждает диагноз:

наследственная микрофероцитарная гемолитическая анемия,

Формула изобретения

Способ определения активности гл1окозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах путем исследования ее цитохимическим методом с использованием инкубационной среда, содержащей пнитротетразолий фиолетовый, трис-буфер рН 8,0, глюкозо-6-фосфатдинатриевую соль и НАДФ при физиологичесКоличество вещества, растворенного в 10 мл физиологического раствора, мг

Глюкозо-6-фосфатдинатриевая соль

НАДФ MgCl п-Нитротетразолий фиоких условиях, отличающи йс я тем, что, с целью повьппения точности за счет исключения ингибирования фермента фиксацией, инкубационная среда дополнительно содержит хлористый магний, гепарин и метиленовую синь, а инкубацию проводят непосредственно с пробой крови, далее готовят мазки и определяют число гранул образовавшегося форма- зана в одном эритроците и по средней величине этого показателя определяют активность фермента.

Количество раствора, используемого на одно исследование,

мкл

0,01 0,01 0,01

НзоВретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть применено для диагностики гемолитических анемий и оценки метаболизма эритроцитов. Цель изобретения повышение точности способа. У пациента берут кровь, смешивают с инкубационной средой, содержащей дополнительно хлористый магнш, гепарин, метиленовую синь. Инкубир пот смесь при 37°С. 30 мин. Затем делают мазок, высушивают и микроскопируют (окуляр х10; объектив х90). При этом подсчитывают общее количество гранул формазана в 200 эритроцитах. Определяют среднее содержание гранул в одном эритроците, что и является показатеi лями активности фермента. При сред(Л ней концентрации гранул 3-5 констатируют сниженную, 7-9 - нормальную, 10-14 - повышенную активность фермента. 1 табл.