СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕМОГЛОБИНОВОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/72 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в исследовательской работе НИИ и практической работе бактериологических лабораторий клинических учреждений, определяющих патогенные характеристики микроорганизмов для установления их этиологической значимости при патологических процессах.

В настоящее время большое внимание уделяют проблеме развития анемии при инфекционных заболеваниях [Луговская С.А. Патогенез и диагностика анемий при хронических заболеваниях // Клиническая лабораторная диагностика, 1997, №12, с.19-22]. В генезе анемии значительную роль играют угнетение эритропоэза в результате воздействия микробных токсинов, нарушение метаболизма железа [Белокуров Ю.Н., Граменицкий А.Б., Молодкин В.М. Сепсис. - М.: Медицина, 1983, с.56]. Известно, что для реализации и усиления патогенных свойств микроорганизмов необходимо определенное количество железа, борьба за которое осуществляется при развитии инфекционного процесса [Горлина М.Х. Железо и патогенность бактерий // Журнал микробиол., 1985, №3, с.103-108]. Однако у человека концентрация свободного железа, необходимого для метаболизма патогенных бактерий, ограничена. В макроорганизме подавляющее количество железа (76%) находится в форме гемсоединений, к которым относится гемоглобин [Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л. Биология патогенных кокков. М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН, 2002, с.139].

Актуальность разработки способа определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов определяется возможностью изучения одного из факторов патогенности микроорганизмов, а также повышения точности диагностики и прогнозирования развития у больных анемии при заболеваниях инфекционной этиологии.

Задачей заявляемого технического решения является создание способа определения антигемоглобиновой активности (АнтиHbA) микроорганизмов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре, из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь, добавляют мясопептонный бульон, инкубируют, отделяют супернатант центрифугированием, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу из мясопептонного бульона и раствора гемоглобина, опытную и контрольную пробы инкубируют, далее каждую из проб добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиHbA=С_к-С_о,

где АнтиHbA - антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о - концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Аналогов изобретения в патентной и научно-технической литературе не обнаружено.

Авторами экспериментально установлено, что микроорганизмы, независимо от их таксономического разнообразия, способны инактивировать гемоглобин крови человека. Было изучено 50 клинических штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Изучаемые штаммы S.aureus, S.epidermidis, S.cohnii, S.saprophyticus, B.cereus, E.coli, выделенные у людей из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, выращивали на мясопептонном агаре при t=37°C в течение 24 часов, готовили их взвеси на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд КОЕ/мл. Добавили мясопептонный бульон и инкубировали при t=37°C в течение 24 часов. Затем получали бесклеточный супернатант каждого микроорганизма центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут и смешивали с раствором гемоглобина в концентрации 120 г/л из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00). В качестве контроля брали раствор мясопептонного бульона с раствором гемоглобина вышеуказанной концентрацией. Затем опытную и контрольную пробы инкубировали 3 часа при t=37°C, после этого каждую из проб добавляли в трансформирующий раствор (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина), тщательно перемешивали, инкубировали при t=18-25°C в течение 20 минут и с помощью фотометра ИФА-ОЭП (длина волны 492 нм, синий светофильтр) определяли оптическую плотность. Далее в опыте и контроле определяли остаточную концентрацию гемоглобина по формулам, взятым из инструкции определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00), затем по разнице концентраций гемоглобина в опытной пробе и контрольной определяли антигемоглобиновую активность исследуемого микроорганизма. АнтиHbA выражают в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л). Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Способность микроорганизмов к инактивации гемоглобина крови человека№п/пВид микроорганизмаКоличество изученных штаммовСредние значения АнтиНbА (г/л)1.S.aureus218,9±3,82.S.epidermidis145,9±2,73.S.cohnii55,1±2,54.S.saprophyticus54,8±2,25.B.cereus26,4±2,86.E.coli37,5±3,2

Как видно из таблицы 1, все изученные штаммы способны инактивировать гемоглобин крови человека, но уровень количества инактивируемого гемоглобина у выделенных штаммов различен. Наиболее высоким уровенем АнтиHbA обладали штаммы S.aureus и E.coli, с уровнем выраженности АнтиHbA 8,9±3,8 (г/л) и 7,5±3,2 (г/л) соответственно.

Авторами установлена взаимосвязь между концентрацией гемоглобина в крови у людей с локализованной гнойно-воспалительной инфекцией и уровнем антигемоглобиновой активности микроорганизмов. Исследования показали, что чем выше уровень антигемоглобиновой активности микроорганизмов, выделенных из очага локализованной гнойно-воспалительной инфекции, тем ниже концентрация гемоглобина у больных, что приводит к развитию анемии инфекционной этиологии. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2.
Антигемоглобиновая активность микроорганизмов и концентрация гемоглобина в крови у людей с локализованной гнойно-воспалительной инфекциейГруппы больных с разной концентрацией Hb в крови (г/л)Количество выделенных штаммовИз них % штаммов с уровнем АнтиHbA(г/л):Рнизким (<3)высоким (>3)120-130 (норма)2972,4±8,327,6±8,3<0,0580-90 (анемия)2810,7±5,889,3±5,8<0,05Р<0,05<0,05 

Как видно из таблицы 2, среди больных, у которых концентрация гемоглобина крови была в норме (120-130 г/л), преобладали штаммы микроорганизмов с низким уровнем антигемоглобиновой активности (≤3 г/л), тогда как среди больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы (80-90 г/л), выделялись штаммы микроорганизмов с высоким уровнем АнтиHbA (>3 г/л). Причем среди больных, у которых концентрация гемоглобина была в норме, выделялись штаммы микроорганизмов с низким уровнем АнтиHbA в 6,8 раз чаще, а штаммы микроорганизмов с высоким уровнем АнтиHbA в 3,2 раза реже, чем среди больных, у которых концентрация гемоглобина была ниже нормы.

Для осуществления способа используется набор реактивов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом «Гемоглобин-агат» (ТУ 9398-280-11498242-00), производства фирмы «Агат-мед» (Россия).

Способ осуществляется следующим образом:

1) Исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре при 37°С в течение 24 часов.

2) Из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд КОЕ/мл, отбирают 0,1 мл и добавляют 2,9 мл мясопептонного бульона, инкубируют 24 часа при 37°С.

3) Отделяют супернатант от микробных клеток исследуемой культуры центрифугированием (3000 об/мин в течение 20 минут).

4) Супернатант объемом 0,2 мл смешивают с 0,02 мл раствора гемоглобина. Раствор гемоглобина с концентрацией 120 г/л берется из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом;

5) Параллельно готовят контрольную пробу - к 0,2 мл мясопептонного бульона добавляют 0,02 мл раствора гемоглобина с концентрацией 120 г/л из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом.

6) Инкубируют опытную и контрольную пробы в течение 3 часов при 37°С.

7) После инкубации опытную и контрольную пробы объемом 0,02 мл добавляют к 5 мл трансформирующего раствора (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина), тщательно перемешивают и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре 18-25°С.

8) Проводят измерение оптической плотности в опыте и контроле на фотометре ИФА-ОЭП (длина волны 492 нм, синий светофильтр), затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах по формулам, взятым из инструкции по определению гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00):

С_о=E_о/E_кб·120, С_к=Е_к/Е_кб·120,

где С_о- концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

С_к - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

E_о - оптическая плотность опытной пробы;

E_к - оптическая плотность контрольной пробы;

Е_кб - оптическая плотность калибровочной пробы;

120 - концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

9) Определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиHbA=С_к-С_о,

где АнтиHbA - антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о - концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Антигемоглобиновую активность выражают в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л).

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Больной Т., 4 года. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Гангренозно-перфоративный аппендицит. Периаппендикулярный абсцесс». Из очага инфекции был выделен штамм S.aureus. Была изучена способность выделенного штамма инактивировать гемоглобин. Для этого приготовили взвесь суточной исследуемой культуры микроорганизма на физиологическом растворе в концентрации 1 млрд. КОЕ/мл. 0,1 мл взвеси поместили в 2,9 мл мясопептонного бульона и инкубировали 24 часа при 37°С. Затем 0,2 мл супернатанта исследуемой культуры смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина с концентрацией 120 г/л, который берется из набора реагентов для определения гемоглобина в крови гемиглобинцианидным методом (ТУ 9398-280-11498242-00). За контрольную пробу принимали раствор мясопептонного бульона объемом 0,2 мл с 0,02 мл раствором гемоглобина вышеуказанной концентрацией. Контроль и опыт инкубировали 3 часа при 37°С. Затем каждую пробу объемом 0,02 мл добавляли в трансформирующий раствор (смесь натрия углекислого кислого, калия железосинеродистого и ацетонциангидрина) объемом 5 мл, тщательно перемешивали и инкубировали 20 минут при t=18-25°C. После этого замеряли оптическую плотность обеих проб на фотометре ИФА-ОЭП (длина волны 492 им, синий светофильтр) и определяли остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах по формулам:

С_о=0,049/0,180·120 С_о=32,6 (г/л)

С_к=0,061/0,180·120 С_к=41 (г/л)

где С_о - концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

С_к - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

0,049 - оптическая плотность опытной пробы;

0,061 - оптическая плотность контрольной пробы;

0,180 - оптическая плотность калибровочной пробы;

120 - концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

Антигемоглобиновую активность (АнтиHbA) исследуемого штамма S.aureus определяли по формуле:

АнтиHbA=41-32,6=8,4 г/л,

где 8,4 - антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

41 - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

32,6 - концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.

Так как выделенный из очага гнойно-воспалительной инфекции штамм S.aureus обладал высоким уровнем антигемоглобиновой активности - 8,4 г/л, а при исследовании периферической крови концентрация гемоглобина составила 86 г/л; эр - 3,1; ц.п. - 1,05, было сделано заключение о том, что штамм S.aureus способствовал развитию у ребенка анемии инфекционной этиологии, что позволило назначить этиотропную терапию.

Пример 2. Ребенок С., 3 года. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Фурункул лица». Из очага воспаления был выделен штамм S.epidermidis. Общий анализ крови показал развитие гипохромной анемии средней степени: Hb - 90 г/л; эр - 3,73; ц.п. - 0,85. Для выяснения роли микроорганизма в развитии анемии было проведено исследование на наличие у выделенного штамма микроорганизма антигемоглобиновой активности. Определение данного свойства у штамма S.epidermidis осуществлялось согласно примеру 1. Выявлено, что у штамма S.epidermidis уровень антигемоглобиновой активности составил 6 г/л. Было сделано заключение о том, что высокий уровень антигемоглобиновой активности штамма S.epidermidis способствовал развитию анемии инфекционной этиологии.

Пример 3. Ребенок Г. 7 лет. Поступил в ОЦДХ с диагнозом: «Гангренозно-перфоративный аппендицит. Разлитой гнойный перитонит». При поступлении больному сделали общий анализ крови, который показал концентрацию гемоглобина в крови в пределах нормы - 124 г/л (норма 120-130 г/л); эр - 3,66; ц.п. - 1,01. Из очага воспаления был выделен штамм E.coli. Была изучена способность выделенного штамма микроорганизма инактивировать гемоглобин согласно примеру 1. Уровень антигемоглобиновой активности у штамма E.coli составил 6,5 г/л. Сделано предположение о возможном развитии у больного анемии инфекционной этиологии. Для контроля через 7 дней провели повторный общий анализ крови, при котором концентрация гемоглобина крови снизилась до 102 г/л, что привело к развитию анемии средней степени. После проведения этиотропной терапии у больного Г. концентрация гемоглобина крови повысилась до нормальных значений - 126 г/л.

Таким образом, заявляемый способ позволяет выявить и изучить новое свойство микроорганизмов - антигемоглобиновую активность как один из возможных факторов патогенности микроорганизмов. Использование предлагаемого способа позволит повысить точность диагностики и прогнозирования развития анемии инфекционной этиологии у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями и назначить этиотропную терапию.

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в практической работе бактериологических лабораторий. Сущность изобретения состоит в том, что выращивают исследуемую культуру микроорганизмов, из выросшей культуры готовят взвесь, инкубируют, отделяют супернатант, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу, опытную и контрольную пробы инкубируют, пробы добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов. Техническим результатом является определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов, установление их патогенных характеристик и этиологической значимости при патологических процессах. 2 табл.

Способ определения антигемоглобиновой активности микроорганизмов, заключающийся в том, что исследуемую культуру микроорганизмов выращивают на мясопептонном агаре, из выросшей культуры готовят одномиллиардную взвесь, добавляют мясопептонный бульон, инкубируют, отделяют супернатант центрифугированием, смешивают его с раствором гемоглобина, параллельно готовят контрольную пробу из мясопептонного бульона и раствора гемоглобина, опытную и контрольную пробы инкубируют, далее каждую из проб добавляют в трансформирующий раствор и инкубируют, затем определяют остаточную концентрацию гемоглобина в опытной и контрольной пробах и определяют антигемоглобиновую активность исследуемой культуры микроорганизмов по формуле:

АнтиНЬА=С_к-С_о,

где АнтиНЬА - антигемоглобиновая активность в граммах инактивированного гемоглобина на литр супернатанта (г/л);

С_к - концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

С_о - концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л.