СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ И АПОПТОЗИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2007 года по МПК A61K36/28 A61K125/00 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного средства из растительного сырья, обладающего цитостатической и апоптозиндуцирующей (противоопухолевой) активностью.

Известно, что основным недостатком используемых в онкологической клинике цитостатических препаратов как растительного происхождения, так и синтетических является их высокое токсическое влияние на организм и на нормальные клетки [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Пособие для врачей, том 2, стр.405. Москва: ООО «Новая волна». Издатель С.Б.Дивов, 2002].

Наиболее близким к предлагаемому является винбластин (розевин) - препарат, который используется в комплексной химиотерапии опухолей в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами. Он содержится в растении барвинок розовый (Vinca rosea L.), а также в растении катарантус розовый (Catharanthus roseus L). [М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Пособие для врачей, том 2, стр.431. Москва: ООО «Новая волна». Издатель С.Б.Дивов, 2002]. Однако его токсичность достаточно велика.

Задача изобретения - создание средства из растительного сырья, обладающего цитостатической и апоптозиндуцирующей (противоопухолевой) активностью и не обладающего токсическим воздействием на организм.

Технический результат заключается в проявлении апоптозиндуцирующей и цитостатической активности вещества, выделенного из концентрированного экстракта корня лопуха.

Корни лопуха собирают весной в экологически чистых районах, тщательно моют и стерилизуют кратковременным погружением в кипящую воду. Затем чистый корень лопуха измельчают до размеров частиц менее 1 мм, в полученную массу добавляют подогретую до 60-70°С воду в соотношении масс 1:3 и настаивают в течение 25-30 мин. Полученный экстракт отделяют от шрота фильтрацией и центрифугированием. Затем экстракт концентрируют до содержания сухого остатка в концентрате 75-80%. В течение 10-20 суток в концентрированном экстракте происходит выпадение твердого вещества, которое отфильтровывают от экстракта через сетку из нержавеющей проволоки с размером ячейки менее 200 мкм.

После фильтрации и двукратной перекристаллизации из воды вещество представляет собой бесцветный осадок (выход до 10% в пересчете на концентрированный экстракт), состоящий из крупных ромбических кристаллов, плавящихся при температуре выше 200°С с разложением. Выделенное соединение не растворимо в органических растворителях (углеводороды, спирты, ацетон, диметилсульфоксид), растворимо в воде, в растворах кислот и щелочей. Выявленные физические свойства характерны для аминокислот и их производных. Нингидриновая реакция на аминокислоту дала положительный результат. При нагревании водного раствора выделенных кристаллов со щелочью выделяется аммиак, что характерно для амидов.

По данным элементного анализа вещество содержит %: С 35,20, N 22,60, Н 6,48. C₄H₈N₂O₃ (элементный CHN-анализатор HP-185). Вычислено, %: С 36,36; Н 6,06; N 21,21.

Молекулярная формула, рассчитанная по данным элементного анализа, соответствует формуле аспарагина - моноамида аспарагиновой кислоты. В зависимости от положения аминогрупп по отношению к амидной различают α- и β-аспарагин

1 - аспарагиновая кислота; 2 - α-аспарагин; 3 - β-аспарагин.

Поскольку α-аспарагин получают синтетическим путем, а в животных и растительных тканях содержится β-аспарагин преимущественно в L-форме, можно предположить, что из сока корней лопуха выделен β-аспарагин. Доказательство его структуры проведено спектральными методами.

В ИК-спектре (фиг.1) имеются полосы поглощения, подтверждающие наличие в структуре исследуемого соединения функциональных групп:

В области валентных колебаний N-H в первичных аминах наблюдаются полосы 3455 и 3382 см^-1. Амидная группа проявляется в спектре полосой валентных колебаний NH при 3111 см^-1 и деформационных колебаний NH при 1644 см^-1 (полоса Амид II), характерных для первичных амидов, вторая область проявления этих колебаний находится в области меньших частот, при 1429 см^-1 полоса Амид III). Валентные колебания карбонильной группы (С=O) амидов обнаружены при 1682 см^-1 (полоса Амид I). Область 1500-1700 см^-1 содержит ряд интенсивных полос, отнесенных, как указано выше, к полосам Амид I, II, III, полоса 1578 см^-1 соответствует валентным колебаниям С=O в ионизированном карбоксиле аминокислоты, что указывает на цвиттер-ионную структуру аспарагина. Полоса деформационных колебаний NH в ⁺NH₃ - группе при 1528 см^-1 также подтверждает цвитер-ионную структуру. Уширенная полоса поглощения при 669 см^-1 соответствует деформационным колебаниям N-H в аминах.

В ПМР-спектре соединения (фиг.2) проявляются резонансные сигналы протонов аминогруппы при 7,85 м.д., протонов амидной группы при 7,60 м.д. и 6,86 м.д. Дублет дублетов с химсдвигом 4,0 м.д. (J₁=4 Гц, J₂=8 Гц) относится к метиновому протону. Его мультиплетность свидетельствует о неэквивалентности соседних метиленовых протонов. Расчет части спектра, относящейся к метиленовым протонам, дал следующие параметры: сигнал одного из метиленовых протонов имеет химсдвиг 2,94 м.д. (J₁=4 Гц), второго - 2,84 м.д. (J₂=8 Гц), абсолютное значение константы спин-спинового взаимодействия между метиленовыми протонами составляет 17 Гц.

Таким образом, впервые осуществлено выделение аспарагина из корней лопуха. Химический состав корня лопуха изучен достаточно полно, включая аминокислотный состав, однако до наших исследований аспарагин обнаружен не был.

Тестирование цитостатического действия аспарагина выделенного из концентрата корня лопуха в сравнении с винбластином проведено на суспензионных культурах опухолевых клетках карциномы Эрлиха (2,5·10⁵ клеток/мл) по включению ³H - тимидина с последующим анализом на бета счетчике Mark-III, а также в реакции бластной трансформации лимфоцитов человека, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) после воздействия препарата в диапазоне концентраций от 0,4·10^-3 до 75·10^-3 М. Оценка влияния препаратов на пролиферативную активность лимфоцитов в спонтанном и индуцированном ФГА тесте проведена в соответствии с методическими рекомендациями фармкомитета Минздрава РФ (протокол № 10 от 10.12.1998)

Результаты исследований представлены в табл.1.

Полученные данные показывают, что заявляемое средство обладает дозозависимым влиянием на опухолевые клетки, при этом концентрации препарата порядка 37,8·10^-3 М, 3,78·10^-3 М и 0,378·10^-3 М подавляли пролиферацию злокачественных клеток до 56,2%-71,8% от контроля (опухолевые клетки без препаратов), а более низкие дозы не оказывали ингибирующий эффект на пролиферацию опухолевых клеток. Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемое средство обладает антибластическими свойствами.

Результаты тестирования препаратов в реакции бластной трансформации лимфоцитов представлены на фиг.3. В качестве аналога использован коммерческий препарат растительного происхождения - винбластин.

В результате исследований установлено, что заявляемое средство оказывает угнетающее влияние на индуцированную ФГА пролиферативную активность лимфоцитов. Обращает на себя внимание также появление клеток с явлениями некробиоза, что в совокупности может служить подтверждением его антибластического действия на клетки. В отличие от заявляемого средства использование винбластина сопровождалось более глубоким подавлением пролиферации лимфобластных клеток и их разрушением, что связано с наличием иммунодепрессивных свойств винбластина.

Тестирование апоптозиндуцирующего действия заявляемого средства проведено на опухолевых клетках карциномы Эрлиха по методу Orlov S. N., Dam Т.V., Trembly J. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol.221. P.708-715.

Результаты исследований представлены на фиг.4.

Полученные данные показывают, что предлагаемое средство обладает дозозависимым апоптозиндуцирующим влиянием на опухолевые клетки, наиболее выраженным при концентрации порядка 4·10^-3 М (индукция апоптоза до 87%) от контроля (опухолевые клетки без препаратов), что доказывает его апоптозиндуцирующую активность.

Результаты исследования токсичности заявляемого средства по сравнению с винбластином и другими средствами, используемыми в лечении представлены в табл.2.

Из материалов табл.2 видно, что заявляемое средство (аспарагин) в отличие от известных противоопухолевых препаратов не оказывает токсического действия и не вызывает гибели подопытных животных. Таким образом, заявляемое средство (аспарагин) проявляет цитостатическую и апоптозиндуцирующую (противоопухолевую) активность но не оказывает побочного токсического действия на организм.

Табл.1Цитостатическое влияние препарата на опухолевые клетки карциномы Эрлиха.Концентрация препаратаКонтроль (клетки без воздействия препарата)37,8·10^-3 M3,78·10^-3 М0,378·10^-3 МКоличество жизнеспособных клеток (%)8656,27071,8

Табл.2.Наименование препаратаДоза мг/кгКоличество животных (беспородные белые мыши)Количество погибших животных (беспородные белые мыши)Заявляемое средство (аспарагин)20005010005050050Винбластин20005510005550055Циклофосфан200055100055500556-меркаптопурин20005510005550055

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется в качестве лекарственного средства, обладающего цитостатической и апоптозиндуцирующей (противоопухолевой) активностью. Средство, обладающее цитостатической и апоптозиндуцирующей активностью, характеризующееся тем, что оно представляет собой β-аспарагин, полученный путем экстракции измельченных до определенных размеров частиц корней лопуха подогретой водой при определенном соотношении сырье : экстрагент, настаивания, отделения экстракта, концентрирования до сухого остатка в концентрате, фильтрования, двукратной перекристаллизации. Вышеописанное средство обладает эффективной цитостатической и апоптозиндуцирующей (противоопухолевой) активностью. 4 ил.

Средство, обладающее цитостатической и апоптозиндуцирующей активностью, характеризующееся тем, что оно представляет собой β-аспарагин, полученный путем экстракции измельченных до размеров частиц менее 1 мм корней лопуха подогретой до 60-70°С водой при соотношении сырье : экстрагент 1 : 3, настаивания, отделения экстракта, концентрирования до сухого остатка в концентрате 75-80%, фильтрования, двукратной перекристаллизации.