СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pER-Gl, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, СПОСОБНЫЙ К АВТОКАТАЛИТИЧЕСКОМУ РАСЩЕПЛЕНИЮ С ОБРАЗОВАНИЕМ ГЛЮКАГОНА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ Escherichia coli ER-2566/pER-Gl - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА Российский патент 2007 года по МПК C12P21/02 C07K1/14 C07K14/605 C12N15/70 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии. Оно может быть использовано для получения рекомбинантного человеческого глюкагона.

Глюкагон - это пептидный гормон, вырабатываемый альфа-клетками островков Лангерганса, участвующий в углеводном и липидном обмене. Он является физиологическим антагонистом инсулина, а также стимулятором его секреции. Эти свойства глюкагона определяют его ценность в качестве медицинского препарата, особенно при лечении гипогликемии.

Глюкагон человека представляет собой 29-членный полипептид (I).

Природный глюкагон получают экстрагированием из поджелудочных желез свиней и крупного рогатого скота, при этом он трудно отделяется от примесей при дальнейшей очистке. В связи с этим были предложены способы как химического, так и микробиологического синтеза полипептида. В мировой практике глюкагон обычно получают микробиологическим способом, в составе гибридного белка, лидерная часть которого обеспечивает транспорт полипептида в периплазму клетки Escherichia coli (Wen, С., Gan, R., Zhu, S. (2003) Curr. Microbiol., 47, 180-185), или с использованим дрожжей Sacharomyces cerevisia (Oh, G.H., Hahm, M.S., Chung, B.H. (1999) Protein Expr. Purif., 17, 428-434) c последующим выделением гормона из культуральной среды. Биосинтез глюкагона в цитоплазме мало используется, потому что глюкагон легко расщепляется протеолитическими ферментами, в результате чего выход целевого полипептида невелик, а при его биосинтезе в составе гибридного белка необходимо применение дорогостоящих сайтспецифических протеаз (Okamoto H, Iwamoto И, Tsuzuki H, Teraoka H, Yoshida N. (1995) J Protein Chem., 14, 521-6; Egel-Mitani M, Andersen AS, Diers , Hach M, Thim L, Hastrup S, Vad K. (2000) Enzyme Microb Technol., 26, 671-677).

Наиболее близким способом к заявленному является получение рекомбинантного глюкагона человека в составе гибридного белка с последующим ферментативным расщеплением (Shin, C.S., Hong, M.S., Kim, D.Y., Shin, H.C., Lee, J. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol., 49, 364-370), при котором, однако, не достигается достаточно высокий выход целевого продукта.

Изобретение решает задачу получения высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный человеческий глюкагон с высоким выходом и по упрощенной технологии.

Поставленная задача решается за счет того, что:

1. Конструируют экспрессионную плазмидную ДНК pER-Gl путем клонирования синтезированного искусственного гена глюкагона в векторной плазмиде pTWIN1.

2. Путем трансформации плазмидной ДНК pER-Gl клеток Escherichia coli ER2566 получают штамм-продуцент, культивируют его до накопления гибридного белка IntGl, включающего наряду со структурой рекомбинантного человеческого глюкагона структуру интеина, позволяющую проводить направленное автокаталитическое расщепление, разрушают клетки в буферном растворе и выделяют тельца включения.

3. Гибридный белок IntGl отделяют в виде телец включения. Осадок телец включения растворяют в буфере, содержащем 2М мочевину, разбавляют и доводят рН до 5,5-6, тем самым индуцируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют 24 ч при 25°С. Дальнейшую очистку и анализ рекомбинантного глюкагона человека проводят посредством обращенно-фазовой хроматографии. Идентификация образующегося рекомбинантного человеческого глюкагона проведена с помощью масс-спектрометрии.

Техническим результатом автокаталитического расщепления гибридного белка является образование глюкагона, выход которого достигает 10% (относительно суммарного белка клетки) при чистоте препарата до 95%.

Чтобы избежать трудностей, связанных с расщеплением рекомбинантного гибридного белка с помощью различных протеаз, таких как энтерокиназа, фактор Х и др., а также с целью удешевления этой стадии мы использовали в составе гибридного белка мини-интеин dnaB из Synechocystis sp. (Wu, Н., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-4327) для направленного автокаталитического расщеления гибрида на целевой полипептид и интеин. Для этой цели мы синтезировали искусственный ген глюкагона, структура которого приведена на фиг.1, и клонировали его в векторной плазмиде pTWIN1, содержащей ген интеина из Synechocystis sp. dnaB (Wu, H., Xu, M.-Q., Liu, X.-Q. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1387, 422-432.; Evans, J, T.C., Bermer, J., Xu, M.-Q., (1999) J. Biol. Chem., 274, 18359-18363), по сайтам рестриктаз NruI и BamHI. Полученной экспрессионной плазмидой pER-Gl, строение которой приведено на фиг.3, трансформировали клетки Е.coli ER2566. Образующийся при экспрессии рекомбинантного гена гибридный белок IntGl способен к автокаталитическому расщеплению на глюкагон человека и интеин. Выход глюкагона высокой степени чистоты (98%) после обращенно-фазовой хроматографии достигает 10% относительно суммарного белка клетки.

В предлагаемом техническом решении используют штамм-продуцент Escherichia coli ER2566, содержащий плазмидную ДНК pER-Gl - суперпродуцент гибридного белка IntGl, включающего наряду со структурой рекомбинантного человеческого глюкагона структуру интеина.

Используют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-Gl

- кодирующую аминокислотную последовательность рекомбинантного

человеческого глюкагона;

- имеющую молекулярную массу 4.38 МДа;

- состоящую из:

NruI/BamHI - фрагмента ДНК коммерческой плазмиды pTWIN1 (фирма New England Biolabs), содержащего промотор и терминатор транскрипции Т7-РНК-полимеразы, усилитель трансляции гена 10 фага Т7, ген β-лактамазы, ген мини-интеина dnaB и NruI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого глюкагона

- содержащую:

в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующей устойчивость трансформированных плазмидой pER-Gl клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;

уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI - Nrul - 118 п.о., NdeI -: 773 п.о., XbaI - 812 п.о., EcoRV - 2847 п.о., HpaI - 2903 п.о.

Конструкция рекомбинантной плазмидной ДНК pER-Gl обеспечивает высокий уровень экспрессии клонированного в ней гена гибридного белка IntGl, содержащего на 5'-конце ген модифицированного интеина dnaB, соединенного с геном глюкагона человека (фиг.1). Для конструирования плазмиды использован химический подход, позволяющий использовать для экспрессии клонированного структурного гена оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию.

Ген человеческого глюкагона получают химико-ферментативным синтезом.

Концевые его участки, содержащие соответствующие вектору сайты рестриктаз, введены с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами PrGlu-int и PrGlu-ter (фиг.1) и затем ген клонируют в векторную плазмиду pTWIN1.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli ER2566/pER-Gl характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или YT-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-Gl отличается от штамма-реципиента Е.coli ER2566 только наличием рекомбинантной плазмидной ДНК pER-Gl, которая и придает ему устойчивость к пенициллиновым антибиотикам.

Штаммы-продуценты получают путем трансформации компетентных клеток Е.coli ER2566 соответствующей рекомбинантной плазмидной ДНК.

Клетки Е.coli ER2566/pER-Gl являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-β-D-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка IntGl, который накапливается в клетках в количестве более 40% суммарного белка клетки в виде тел включения.

Изобретение осуществляют следующим образом. Конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pER-Gl, для чего полученный химико-ферментативным синтезом ген рекомбинантного человеческого глюкагона амплифицируют с помощью ПЦР с синтетическими олигонуклеотидными праймерами (фиг.2), содержащими сайты рестриктаз NruI (N-конец гена, праймер PrGlu-int) и BamHi (С - конец гена, праймер PrGlu-ter), полученную ДНК расщепляют соответствующими рестриктазами и затем лигируют с расщепленной по тем же сайтам векторной плазмидой pTWIN1.

Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.coli ER2566 и высевают на YT-агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина или другого пенициллинового антибиотика. Полученные клоны анализируют гибридизацией ³²Р-мечеными олигонуклеотидами А1 и В1 (фиг.2), и из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК, которую подвергают рестриктному анализу с помощью рестриктаз Nrul и BamHl.

Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-Gl выращивают в богатой среде (YT-, LB-бульон и др.) (или индуцируют изопропилтио-β-D-галактозидом и снова выращивают) до достижения максимальной плотности культуры.

На фиг.1 изображена структура гена рекомбинантного человеческого глюкагона.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК.

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTWTN1 (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера Y (33 мМ трис-ацетат, рН 7,9, 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат 1, 0,5 мМ DTT, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой NruI (10 ед. акт.),а затем - в 40 мкл буфура R (10 мМ трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ KCl, 0,1 мг/мл BSA) рестриктазой BamHI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент величиной 3,6 т.п.о. после электрофореза в 1% агарозном геле электрофоретически перемещают в слой DEAE-бумаги, затем элюируют 1М NaCl и осаждают ДНК из раствора этанолом.

Для приготовления фрагмента гена проводят амплификацию с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду с искусственным геном глюкагона (0,01 мкг в образце), а в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды А1 и В1 (по 60 пмоль каждого). ПЦР проводят в ДНК-амплификаторе, в буферном растворе, состоящем каждый из четырех dNTP в концентрации 0,5 мМ и 5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг - 30 сек при 60°С, элонгация - 40 сек при 72°С, 30 циклов ПЦР. После этого реакционную смесь депротеинизируют хлороформом, упаривают досуха, остаток растворяют в 20 мкл воды, затем расщепляют теми же рестриктазами, которые использовались при приготовлении вектора, и выделяют целевой фрагмент из агарозного геля. На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность глюкагона человека.

Полученный синтетический фрагмент с геном рекомбинантного человеческого глюкагона в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреит) и лигируют с помощью 10 ед.акт.Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.coli ER2566. Трансформанты высевают на чашки с YT-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью гибридизации колоний in situ с ³²Р-меченым олигонуклеотидом А1 (фиг.2). Из гибридизующихся клонов выделяют ДНК плазмиды pER-Gl и анализируют с помощью эндонуклеаз NruI и BamHI. Физическая карта плазмиды pER-Gl представлена на фиг.3.

Пример 2.

Получение штамма-продуцента Е.coli ER2566/pER-Gl и определение его продуктивности.

Штамм-продуцент Е.coli ER2566/pER-Gl получают трансформацией компетентных клеток Е.coli ER2566 плазмидой pER-Gl, как описано в примере 1. Клетки Е.coli ER2566, несущие плазмиду, структура которой подтверждена данными анализа (см. пример 1), являются суперпродуцентом.

Штамм продуцента Е.coli ER2566/pER-Gl выращивают при 37°С в 100 мл YT-бульона (рН 7,0) с 50 мкг/мл ампициллина в течение 2 ч на качалке со скоростью вращения 190 об/мин до мутности А₅₅₀ 0,7-0,8, прибавляют изопропилтио-β-D-галактозид до концентрации 0,2 мМ и продолжают процесс еще 6 ч, или продолжают выращивание в отсутствие индуктора в течение 6 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, определяют А₅₅₀ и количество культуры, соответствующее 1 мл с А₅₅₀ 1,0, центрифугируют 5 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим обрабатывают 20 сек ультразвуком, нагревают 3 мин при 100°С и пробы по 1 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930.

Пример 3.

Получение гибридного белка IntGl, его автокаталитическое расщепление и выделение рекомбинантного глюкагона человека.

После окончания ферментации клетки продуцента гибридного белка IntGl (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе и выделяют центрифугированием (15000 g, 45 мин) тельца включения. Осадок телец включения растворяют в буфере, содержащем 2М мочевину, разбавляют и доводят рН до 5,5-6, тем самым индуцируя автокаталитическое расщепление гибридного белка, и инкубируют 24 ч при 25°С. Дальнейшую очистку рекомбинантного глюкагона человека проводят посредством обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. Анализ полученного продукта проводят при помощи ОФ ВЭЖХ. Фракции с содержанием белка IntGl не менее 95% объединяют и лиофилизуют.Выход рекомбинантного глюкагона составляет 10 мг из 100 г клеток или 10% суммарного белка клеток.

Идентификация образующегося рекомбинантного человеческого глюкагона проведена с помощью MALDI-масс-спектрометрии на масс-спектрометре Vision 2000. Полученный сигнал рекомбинантного глюкагона соответствует расчетному значению массы 3485 Да.

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pER-Gl, обеспечивающая синтез гибридного полипептида, содержащего глюкагон человека и интеин, в клетках Escherichia coli. Путем трансформации штамма E.coli ER2566 плазмидой pER-Gl получен продуцент указанного гибридного полипептида. Разработан способ получения рекомбинантного глюкагона человека, предусматривающий получение и культивирование продуцента гибридного полипептида, содержащего глюкагон человека и интеин, с последующим выделением и расщеплением указанного гибридного белка. Применение изобретения позволяет получить рекомбинантный человеческий глюкагон с высоким выходом и по упрощенной технологии. 3 н.п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-Gl, обеспечивающая синтез гибридного полипептида, содержащего глюкагон человека и интеин, в клетках Escherichia coli, имеющая молекулярную массу 4.38 МДа, состоящая из

NruI/BamHI-фрагмента ДНК плазмиды pTWIN-1;

NruI/BamHI-фрагмента ДНК, содержащего адаптированную к этим сайтам последовательность гена рекомбинантного человеческого глюкагона, приведенную на фиг.1; и

содержащая в качестве генетического маркера ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pER-Gl клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам; уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI - NruI - 118 п.о., NdeI - 773 п.о., XbaI - 812 п.о., EcoRV - 2847 п.о., HpaI - 2903 п.о.