ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СОХРАНЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНИЛЬЦОВЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЧЕЛ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть применено в пчеловодстве для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел.

Европейский гнилец - болезнь открытого расплода. Возбудители: Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus (доброкачественный гнилец); Enterococcus faecalis (кислый гнилец) культивируются на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Парагнилец - инфекционное заболевание личинок позднего возраста и куколок. Возбудитель - Bacillus paraalvei, культивируется на мясопептонных средах (МПА, МПБ).

Американский гнилец (злокачественный гнилец) - инфекционное заболевание пчелиных семей, приводящее к ослаблению и гибели печатного расплода (взрослые личинки и предкуколки), вызываемое спорообразующим микроорганизмом Paenibacillus larvae subsp. larvae, для культивирования которого требуются специальные среды, т.к. для его роста и споруляции необходимы дополнительные питательные вещества. Переход вегетативных клеток в спорулирующие необходим для сохранения музейных культур возбудителя американского гнильца.

Для культивирования возбудителя американского гнильца в настоящее время применяют среды: Бейли, Томашеца, молочно-желточную среду Уиллиса-Гоббза.

СРЕДА БЕЙЛИ: имеет в составе: 10% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, 1% крахмала, 0,1360 г КН₂PO₄, 1% агар (рН 6,6) [1].

СРЕДА ТОМАШЕЦА: мясопептонная среда с добавлением 10% нормальной лошадиной сыворотки (рН 6,8-7,0) [2].

СРЕДА УИЛДИСА-ГОББЗА - молочно-желточная эмульсия, 2% мясопептонный агар (рН 7,0-7,2) [3].

Известна также среда, имеющая в составе: казеин 1-3,65%; кукурузный настой 1,0-5%; крахмал 0-9,2%; сахарозу 0,6-3,5%; неочищенную патоку 0-9,2%; дрожжи 0,5-0,8%; Na₂PO₄ 0,42-0,60%; КН₂PO₄ 0,17-0,24%. (рН 6,5-7,5). Ближайший аналог [4].

Недостаток среды - трудоемкий технологический процесс приготовления (рецептура состава: 8 компонентов). Среда не обеспечивает ранний рост, спорообразование и длительную сохранность возбудителя американского гнильца пчел.

В задачу исследований входило создание универсальной питательной среды, которая давала бы быстрый рост, максимальное накопление биомассы, раннее и интенсивное спорообразование, способствовала длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях, в частности для труднокультивируемого возбудителя американского гнильца.

Предложенная нами среда содержит гидролизат казеина, полученный путем разбавления дистиллированной водой до содержания аминного азота 140-150 мг%, кипячения при перемешивании 5 минут; добавления 5% NaOH и доведения рН 7,8-8,0; добавления агара "Дифко" - 15 г/л или агар-агара (одесского) - 20 г/л; смесь кипятят при перемешивании 5 минут; доводят рН 7,2-7,4 20% HCl; среду фильтруют и стерилизуют при 121°С 20 минут. После стерилизации рН 7,0-7,2. Среда применена для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, преимущественно для трудно культивируемого возбудителя американского гнильца Paenibacillus larvae subsp. larvae, показав преимущественные результаты в сравнении с рекомендуемым средами: (Бейли, Томашеца, молочно-желточной средой Уиллиса-Гоббза).

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1Сравнительная оценка биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел Paenibacillus larvae subsp. larvae№ пПоказателиСреда ТомашецаСреда БейлиСреда Уиллиса-ГоббзаПредложенная среда12.3.4561Первичный рост72-96 ч48-72 ч48 ч18-24 ч2Интенсивность роста++++++++++3Накопление биомассы (концентрация смыва)500 млн/см³500 млн/см³1 млрд/см³2 млрд/см³4Спорообразованиеотсутствует96 ч. 200-300 спор/см³72 ч. 500-550 спор/см³72 ч. 800-1000 спор/см³5Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевовИзменение биологических свойствНе изменялисьНе изменялисьНе изменялись6Цикл пересевов2 недели4 недели1,5 мес.3 мес.

Установлено, что предложенная среда в отличие от рекомендованных способствует раннему проявлению первичного роста (18-24 ч); максимальному накоплению биомассы (48 ч - 2 млрд/см³); быстрому спорообразованию (72 ч - 800-1000 спор/см³); многократные пересевы не изменяли биологических свойств возбудителя американского гнильца пчел, а жизнеспособность музейных культур увеличивалась до 3 месяцев.

Установлено, что возбудители европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterospores, Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei) при культивировании на предложенной среде при многократных пересевах (10 пассажей) не изменяли биологических свойств, наблюдалось усиленное накопление биомассы (2-2,2 млрд/см³, быстрое спорообразование (48 ч - 800-1000 спор/см³), ранний первичный рост (18-24 ч), увеличивался цикл пересевов возбудителей (3 мес) при хранении в музейных условиях.

Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2Сравнительная оценка биологических свойств возбудителей европейского гнильца (Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus Enterococcus faecalis) и парагнильца (Bacillus paraalvei)№ПоказателиМясопептонные среды: (мпа,мпб)Предложенная среда1.2.3.4.1.Первичный рост24 ч18-24 ч2.Интенсивность роста++++++3.Накопление биомассы (концентрация смыва)1-1,8 млрд/см³2-2,2 млрд/ см³4.Спорообразование72 ч. 500-700 спор/см³48 ч. 800-1000 спор/см³5.Биологические свойства (культурально-морфологические, гемолитические, биохимические). 10 пересевовНе изменялисьНе изменялись6.Цикл пересевов2 мес3 мес

Апробация предложенной среды проведена на 100 музейных штаммах возбудителей гнильцовых болезней пчел с положительными результатами.

Преимущество среды - универсальность, упрощение и удешевление технологического процесса изготовления (рецептура содержит 2 компонента). Среда дает возможность длительного сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел в музейных условиях.

Предложенная среда найдет применение в бактериологических лабораториях, для культивирования и сохранения возбудителей гнильцовых болезней пчел, в диагностических исследованиях и в производстве биопрепаратов.

Источники информации

1. Книга: «Опасные болезни и вредители пчел.», под редакцией О.Ф.Гробова и других, М.: Нива России, с.5.

2, 3. Там же, с.6.

4. GB №1003977 от 08.09.1965 - ближайший аналог.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования и длительного сохранения в музейных условиях возбудителей гнильцовых болезней пчел. Питательная среда в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% содержит агар-агар или агар Дифко. Изобретение позволяет увеличить выход биомассы, повысить спорообразование питательной среды, способствует длительному сохранению возбудителей гнильцовых болезней пчел. 2 табл.

Питательная среда для культивирования и сохранения возбудителя гнильцовой болезни пчел - американского гнильца - Paenibacillus larvae subsp. larvae, европейского гнильца Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus, Enterococcus faecalis, содержащая в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 140-150 мг% 15-2,0 г агар-агара или агара Дифко, рН среды 7,2±0,2.