ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ СПОР ВОЗБУДИТЕЛЯ АМЕРИКАНСКОГО ГНИЛЬЦА В ИССЛЕДУЕМОМ МАТЕРИАЛЕ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C12N3/00 

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии - созданию питательной среды, и может быть применено в пчеловодстве для выделения спор возбудителя американского гнильца пчел в исследуемом материале, которому для получения спорообразования требуются специальные среды.

Paenibacillus larvae var. larvae - спорообразующий микроорганизм, возбудитель карантинного (список Б, МЭБ) контагиозного заболевания расплода медоносных пчел (Apis melifera), приводящий к ослаблению семей и последующей их гибели.

Взрослые пчелы устойчивы к заболеванию, но они являются носителями спор возбудителя американского гнильца, которые остаются в их пищеварительном тракте свыше 2-х месяцев, проявляя инфекционность для молодых личинок (до 28 ч) при их скармливании инфицированным кормом. Средняя смертельная доза (LD₅₀), необходимая для вспышки инфекции составляет 38 спор (50% личинок погибает из общей группы). Такая система бактеримии ведет к гибели и распаду тела личинок, сопровождающаяся споруляцией бактерий (в одной гниющей личинке образуется до 2,5×10⁹ спор Р.l.larvae).

Соты, содержащие пораженные личинки (корочки), - наиболее частый способ распространения заболевания от семьи к семье. Заболевание также распространяется при кормлении медом, содержащем споры, его воровством, отводками, подсадкой маток из пораженных семей пчел. Для выявления бактерионосительства, прогноза заболевания, учета эффективности мер борьбы (проверка внешне благополучных пасек в карантинной зоне, продаже, экспорте, импорте семей (пчелопакетов), маток, продуктов пчеловодства, оценки результатов дезинфекции оборудования и инвентаря) - предложено исследовать мед, смывы с тела и кишечного содержимого взрослых пчел, смывы с поверхности вощины, крошку со дна ульев семей на наличие возбудителя, т.к. своевременное выявление спор патогена дает возможность выявлять заболевание до вспышки эпизоотии на пасеках.

Трудность выделения спор американского гнильца микробиологическим способом на многих средах (МПА с 10% сывороткой лошади; мясном бульоне с тиамином в 0,002% концентрации активного вещества; МПА и МПБ с желтком) обусловлена длительным ростом возбудителя, отсутствием или медленной споруляцией (требуется высокая посевная доза, только 10% спор могут прорости и продуцировать КОЕ). При низкой плотности инфицирования материала выделить споры возбудителя не удавалось.

Кроме того, часто поверхность культивирования перекрывают микроорганизмы рода Bacillus и Paenibacillus, которые растут быстрее, чем возбудитель американского гнильца.

В настоящее время, для выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале, известна среда:

Также известны:

Среда "J", состоящая из 5 г триптона, 15 г экстракта дрожжей, 20 г агара, 3 г КН₂PO₄, 2 г глюкозы на 1 литр деминерализованной воды.

Среды имеют сложный компонентный состав и технологический процесс изготовления, характеризуются длительным ростом, медленной споруляцией Paenibacillus larvae var. larvae при выделении из материала, для подавления роста сопутствующей микрофлоры, в среды добавляют антибиотики.

Известна также среда, имеющая в составе: казеин 1-3,65%, кукурузный экстракт 1,0-5%, крахмал 0-9,2%, сахароза - 0,6-3,5%, дрожжи - 0,5-0,8%, неочищенная патока 0-9,2%, Na₂PO₂ - 0,42%-0,60%, КН₂PO₄ - 0,17-0,24%. (рН 6,5-7,4).

Среда предназначена для получения энтомопатогенного, водно-растворимого токсина из некоторых энтомопатогенов рода Bacillus (в числе микроорганизмов перечислен и Bacillus larvae), не дает раннего выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале.

Задачей предлагаемого изобретения явилось создание питательной среды, которая давала возможность раннего выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале, даже при низкой плотности его инфицирования, имела простой компонентный состав и упрощенный технологический процесс изготовления.

Предложенная среда содержит гидролизат казеина, полученного разбавлением дистиллированной водой до концентрации аминного азота 170-180 мг %, кипячения, добавления 5% NaOH и доведения рН до 7,8-8,0, добавление 18-20 г/л бактоагара "Дифко", доведение рН 20% HCl до 7,4-7,6. Фильтрация и стерилизация среды (121°С - 30 минут). После стерилизации рН 7,2-7,4.

Среда испытана для выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале (руководствуясь "Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaciimes",0ffice International des Epizooties (O.I.E), 1996, 603-606), показав преимущественные результаты, в сравнении с известными средами (Уиллиса-Гоббза с гидролизатами белков крови, аминный азот 170-180 мг %, рН 7,2-7,4; "J" и "PLA") т.к. дает возможность раннего (24-48 час) проростания даже минимальных концентраций спор (<10 спор/бактерий) Paenibacillus larvae var. larvae до полного зарастания поверхности культивирования.

Пример 1

Посевной материал, полученный из ульевой крошки и воска (руководствуясь требованием " Manual", O.I.E., 1996), высевали на предложенную среду. Среда обеспечивала раннее (24-48 ч) выделение спор Paenibacillus larvae var. larvae (<10 спор/бактерий до полного зарастания поверхности культивирования).

Пример 2

Посевной материал (сот с погибшими личинками), руководствуясь требованием "Manual",O.I.E., 1996", высевали на предложенную среду. Установлена возможность раннего (24-48 ч) выделения в среднем <10 спор/бактерий (КОЕ) Paenibacillus larvae var. larvae - до полного зарастания поверхности культивирования.

Пример 3

Пробы меда, полученные из Джаркурганского района Сурхандарьинской области Узбекистана, исследованы на наличие спор возбудителя американского гнильца, руководствуясь требованием "Manual", O.I.E., 1996" и высева на предложенную среду. Среда позволяла выделять через (24-48 ч) <10 спор/г меда до полного зарастания Paenibacillus larvae var. larvae поверхности культивирования.

Серии опытов по проверке предложенной среды для выделения спор возбудителя американского гнильца, при низкой плотности клеток, (руководствуясь методикой А.М.Смирнова, ж. "Ветеринария", №10, 1972, с.120) проверяли путем высева соответствующих разведении на гидролизат казеина, с содержанием аминного азота 170-180 мг %, рН 7,2-7,4. Чувствительность среды подтверждена присутствием минимальных концентраций спор патогена (<10 спор/г меда) и раннем росте (24-48 часов).

Конкретные примеры приведены в таблице.

ТаблицаОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ СПОР ВОЗБУДИТЕЛЯ АМЕРИКАНСКОГО ГНИЛЬЦА В МЕДЕ№/№ п/пПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДАСКОРОСТЬ ПРОЯВЛЕНИЯ ВИДИМОГО РОСТАКОЛИЧЕСТВО ПРОРОСШИХ СПОР (KOE)1.2.3.4.1.Среда Уиллиса-Гоббза на основе гидролизатов белков крови, аминный азот 150-180 мг %, рН 7,2-7,4.от 3 днейв среднем 400 спор/г меда2.Среда "J"от 6 до 11 днейбольше 2000 спор/г меда3.Среда "PLA"от 2 до 5 днейв среднем 5-6 спор/г меда4.Предложенная среда24-48 чменьше 10 спор/г меда

Преимущество предложенной среды - в упрощении и удешевлении технологического процесса изготовления (рецептура состава содержит 2 компонента), в положительных результатах: раннем (24-48 ч) выделении спор (сопутствующая микрофлора не успевает перекрыть поверхность культивирования), даже при низкой плотности инфицирования исследуемого материала (<10 спор/бактерий до полного зарастания Paenibacillus larvae var. larvae поверхности культивирования).

Гидролизат казеина, с содержанием аминного азота 170-180 мг/%, рН 7,2-7,4 апробирован для выделения спор возбудителя американского гнильца на 100 пробах исследованного материала - с положительными результатами.

Предложенная среда найдет применение в ветеринарных лабораториях для диагностики заболевания пчел американским гнильцом, может быть рекомендована для разработки экспресс-метода выделения спор Paenibacillus larvae var. larvae в меде и пчелопродуктах.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

(1) /Ветеринарка медицина, 82, Мiжвидамчий тематич. науково збiрник/, Харькiв, 2003, 492-497.

(2) Schuch D.M.T., Madden R.H., Sattler A. - "An Improved method for the detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey", /Journal. of Agricultural Research/, 40, (2), 2001, 60-61.

(3) Ближайший аналог - патент GB №1003977, A01n 15/00, 1965.

Питательная среда для выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале содержит в 1 литре гидролизата казеина 18-20 г бактоагара «Дифко», рН 7,2-7,4. Гидролизат казеина содержит аминный азот в количестве 170-180 мг %. Среда дает возможность раннего выделения спор возбудителя американского гнильца даже при низкой плотности инфицирования. Эффективность среды подтверждает присутствие Paenibacillus larvae var. larvae в исследуемом материале - <10 спор/бактерий (КОЕ) до полного зарастания поверхности культивирования. Питательная среда может быть использована в ветеринарных лабораториях для диагностики заболевания пчел американским гнильцом и рекомендована для разработки экспресс-метода выделения спор Paenibacillus larvae var. larvae в меде и пчелопродуктах. 1 табл.

Питательная среда для выделения спор возбудителя американского гнильца в исследуемом материале, характеризующаяся тем, что она содержит в 1 л гидролизата казеина с содержанием аминного азота 170-180 мг %, 18-20 г бактоагара «Дифко», рН 7,2-7,4.