Настоящее изобретение относится к применению сверхразветвленного амилопектина.
В частности, данное изобретение относится к новому применению сверхразветвленного амилопектина, обладающего характерной степенью разветвленности и характерной молекулярной массой (ММ).
В ходе истории разработки объемных плазмозаменителей одной из целей всегда являлось достижение глобулярной структуры природного носителя, обеспечивающего колоидно-осмотическое давление сыворотки, а именно альбумина. Структура гликогена, который также присутствует в организме человека как природный удерживаемый полисахарид, наиболее близка к данной глобулярной структуре. Глобулярная структура гликогена обусловлена очень высокой степенью разветвленности. С точки зрения структуры гликоген представляет собой полисахарид на основе глюкозы, имеющий в линейных участках α-1,4-гликозидные связи, а в точках разветвления α-1,6-гликозидные связи. Так как сам гликоген не доступен в качестве дешевого источника исходного сырья, Wiedersheim в 1957 г. предложил вместо него использовать менее разветвленный амилопектин в качестве исходного вещества для получения плазмозаменителя гидроксиэтилкрахмала (ГЭК). В то время гидроксиэтилкрахмал использовали как плазмозаменитель в виде нескольких разных типов очень широкого диапазона. Данная разработка привела к появлению новых типов гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), которые обладали оптимальным действием при минимальных побочных эффектах, таких как, например, влияние на свертывание крови или промежуточное задерживание в ткани.
Разные типы ГЭК, присутствующие на рынке, различаются по молекулярной массе, средней степени замещения и структуре замещения.
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый с помощью данных разработок, некоторые недостатки имеют место даже в случае типов ГЭК, оптимизированных в течение последних нескольких лет, в особенности неспособность полностью метаболизироваться.
Однако хорошо известно, что, говоря химическим языком, гидроксиэтильная эфирная группа является метаболически крайне стабильной, так что ангидроглюкозные остатки гидроксиэтилкрахмала, несущие гидроксиэтильные эфирные группы, практически не способны участвовать в метаболизме. Более того, известно, что сывороточная α-амилаза может расщеплять в молекуле гидроксиэтилкрахмала только те α-1,4-гилкозидные связи, которые образованы незамещенными глюкозными остатками. Как следствие этого, было обнаружено, что даже в случае оптимизированных типов ГЭК по меньшей мере через некоторое время может быть выявлено минимальное, но все еще заметное удерживание в тканях.
В качестве другого недостатка было обнаружено, что ГЭК не обладает идеальной глобулярной структурой альбумина и, следовательно, его собственная вязкость значительно выше, чем вязкость альбумина. Желательно, чтобы плазмозаменитель обладал относительно низкой вязкостью, так как в этом случае его присутствие в кровотоке уменьшает общую вязкость крови.
Следовательно, существует потребность в разработке новых улучшенных плазмозаменителей на основе амилопектина, не обладающих недостатками, заключающимися в отсутствии способности производного амилопектина гидроксиэтилкрахмала подвергаться полному метаболизму. В то же время новый плазмозаменитель должен иметь более глобулярную структуру и, следовательно, образовывать растворы с относительно низкой вязкостью.
Открытие новых областей применения некоторых амилопектинов также может считаться одной из задач данного изобретения.
Данные задачи, а также другие задачи, не перечисленные в деталях, но которые, однако, можно легко и просто вывести из вводных разъяснений, внесены в содержание пункта 1. Предпочтительные воплощения данного изобретения составляют содержание пунктов, являющихся зависимыми по отношению к пункту 1.
Путем применения сверхразветвленного амилопектина со средней степенью разветвленности, выраженной в мол.% ангидроглюкозы, несущей точки разветвления, составляющей от >10 до 25 мол.%, и средней ММ в интервале от 40000 до 800000 Дальтон, и, при необходимости, его производных, в способах хирургического или терапевтического лечения человека или животного (включая млекопитающих), или в диагностических методах, с одной стороны, можно раскрыть, не прямым очевидным образом, ряд новых и интересных применений сверхразветвленного амилопектина в области медицины. С другой стороны, предоставляется почти идеальный заместитель ГЭК продуктов на основе крахмала, до настоящего времени традиционно используемых в практике, особенно в связи с явлением "увеличения объема плазмы", приводящий к сильному уменьшению опасных побочных эффектов.
В отношении увеличения объема плазмы, авторы данного изобретения в результате экстенсивных исследований обнаружили, что степень разветвленности остаточных фракций гидроксиэтилкрахмала в кровотоке и в моче сильно увеличивается через несколько часов или даже дней после применения плазмозаменителей по сравнению с первоначально введенным гидроксиэтилкрахмалом (ГЭК продуктом). Следовательно, степень разветвленности, выраженная в мол.% ангидроглюкозы, несущей точки разветвления, увеличивается приблизительно от 5 мол.% до более 7 мол.% через 2 часа после применения и до 8 мол.% через 7 часов после применения. В то же время еще более высокая степень разветвленности, составляющая 9 или 10 мол.%, обнаруживается в общей фракции мочи через 48 или 42 часа после инфузии. Данное явление наблюдается независимо от молекулярной массы, степени замещения или структуры замещения применяемого гидроксиэтилкрахмала. Это означает, что при расщеплении данные фракции с повышенной вероятностью приобретают структуру и/или разветвление, как у гликогена, который, как указано в литературе, имеет степень разветвленности, составляющую приблизительно 10 мол.%.
Неожиданно было обнаружено, что относительную стабильность α-(1,6)-ветвления в амилопектине и в его производных можно использовать для уменьшения расщепления амилопектина по сравнению с преобладающим расщеплением под действием α-амилазы до такой степени, что может быть получен полисахарид, способный полностью расщепляться, но который, однако, при этом сохраняет свойства идеального плазмозаменителя, относящиеся к фармакокинетике и/или влиянию на объем.
Следовательно, данное изобретение включает применение сверхразветвленных амилопектинов и производных таких сверхразветвленных амилопектинов в области медицины.
Следует понимать, что термин амилопектин прежде всего относится, в основном, к разветвленным крахмалам или крахмальным продуктам, в которых молекулы глюкозы связаны α-(1,4)- и α-(1,6)-связями. Ветвление цепи происходит через α-(1,6)-связи. В природных амилопектинах ветвление происходит нерегулярно, приблизительно через каждые 15-30 глюкозных фрагментов. Природный амилопектин имеет очень высокую молекулярную массу, т.е., в интервале от 107 до 2×108 Дальтон. Это позволяет предположить, что амилопектин, кроме того, в некоторых участках образует спирали.
Можно определить степень разветвленности амилопектинов. Отношение числа молекул ангидроглюкозы, несущих точки разветвления (α-(1,6)-связи), к общему числу молекул ангидроглюкозы амилопектина является мерой разветвления, причем данное отношение выражается в молях. Природный амилопектин имеет степень разветвленности, составляющую приблизительно 4 мол.%. Однако известно, что при отдельном исследовании кластеров и фрагментов молекул амилопектина их степень разветвленности превышает природную.
Сверхразветвленными амилопектинами в данном изобретении называются амилопектины, имеющие степень разветвленности, значительно превышающую степень разветвленности природного амилопектина. Степень разветвленности в любом случае представляет собой среднее значение (среднюю степень разветвленности), так как амилопектины являются полидисперсными веществами.
Такие сверхразветвленные амилопектины обладают гораздо более высокой степенью разветвленности, выраженной в мол.% ангидроглюкозы, несущей точки разветвления, чем неизмененный амилопектин или гидроксиэтилкрахмал, и, следовательно, их структура более похожа на структуру гликогена.
Средняя степень разветвленности сверхразветвленного амилопектина, необходимая для применения в соответствии с данным изобретением, находится в интервале между >10 и 25 мол.%. Это означает, что амилопектины, которые могут применяться в соответствии с данным изобретением, имеют в среднем одну α-(1,6)-связь и, следовательно, точку разветвления, на каждые 10-14 глюкозных остатков. Если степень разветвленности ниже 10 мол.%, расщепление разветвленного амилопектина является недостаточно замедленным (например, в случае его применения в качестве плазмозаменителя). Если степень разветвленности превышает 25 мол.%, расщепление является чересчур замедленным, что приводит, например, к невозможности применения разветвленного амилопектина в качестве объемного плазмозаменителя.
Тип амилопектина, который можно предпочтительно использовать в области медицины, характеризуется степенью разветвленности от 11 до 16 мол.%.
Другие предпочтительные сверхразветвленные амилопектины имеют степень разветвленности в интервале от 13 до 16 мол.%.
Кроме того, имеет значение ММ сверхразветвленного амилопектина. ММ представляет собой средневзвешенную молекулярную массу, измеренную с помощью соответствующих методов, которые позволяют получить данное среднее значение. Указанные методы включают ГПХ (гель-проникающую хроматографию), ВЭЖХ, светорассеяние и т.п.
Значение средневзвешенной ММ сверхразветвленных амилопектинов, подходящих для применения в соответствии с настоящим изобретением, обычно составляет от 40000 до 800000 Дальтон. Более низкую границу интервала значений ММ получают в случае предпочтительных применений по существу из так называемого "порога выведения", который должен быть установлен приблизительно при 40000 в случае сверхразветвленных соединений. Если ММ меньше 40000 Дальтон, то молекулы будут отфильтровываться через почки слишком быстро. Если ММ превышает 800000 Дальтон, никакой дополнительной заслуживающей внимания пользы не достигается, даже если в случае глобулярной структуры предельная вязкость больше не зависит от ММ.
Для применения в качестве объемных плазмозаменителей предпочтительны средние значения ММ, находящиеся в интервале от 90000 до 300000 Дальтон, причем особенно подходящие значения ММ находятся в интервале от 120000 до 250000 Дальтон.
Отдельное воплощение данного изобретения включает сверхразветвленный амилопектин со средней степенью разветвленности от 11 до 16 мол.% и ММ от 90000 до 300000 Дальтон. Другие соответствующие воплощения данного изобретения включают сверхразветвленный амилопектин со средней степенью разветвленности от 13 до 16 мол.% и ММ от 120000 до 250000 Дальтон.
Вышеуказанные параметры, а именно степень разветвленности и ММ, позволяют достигать целевого эффекта и, следовательно, желательной фармакокинетики, в частности желательного расщепления α-амилазой. В данной связи степень разветвленности играет ключевую роль. Однако молекулярная масса также оказывает влияние на изучаемую кинетику. Кроме того, можно оказывать влияние на кинетику расщепления, задавая его направление путем изменения местоположения точек разветвления.
Однако особое значение для расщепления амилопектина α-амилазой и, следовательно, для функционирования объемного плазмозаменителя, имеет степень разветвленности. При высокой степени разветвленности действие α-амилазы замедляется, а в участках молекулы с высокой плотностью точек разветвления оно полностью прекращается, так как там доступ α-амилазы невозможен. Тем не менее, такие соединения способны расщепляться другими ферментами до олигосахаридов и, в конце концов, до глюкозы.
При необходимости сверхразветвленные амилопектины, предназначенные для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть получены в виде производных. Такие производные включают химические производные амилопектина, такие как, например, получаемые в результате химических или биотехнологических превращений.
Предпочтительными производными сверхразветвленного амилопектина являются гидроксиэтиламилопектин, гидроксипропиламилопектин и ацетиламилопектин. Из них, в свою очередь, гидроксиэтиламилопектин особенно предпочтителен для применения. Образование производных (дериватизация) также оказывает влияние на кинетику расщепления амилопектина. Однако имеет значение степень дериватизации, например, степень гидроксиэтилирования в данных случаях должна быть значительно ниже, чтобы получить объемный эффект или фармакокинетику, подобные имеющим место в случае гидроксиэтилкрахмала (ГЭК), полученного из нормально разветвленного амилопектина.
Подходящим в соответствии с данным изобретением способом получения сверхразветвленного амилопектина, в числе прочих, и предпочтительно для применения в качестве объемного плазмозаменителя, является ферментативное превращение под действием так называемых ветвящих ферментов, которые катализируют гидролиз α-1,4-гликозидных связей и их превращение в α-1,6-гликозидные связи. Такие так называемые ферменты переноса можно экстрагировать известным способом, например, из водорослей, как описано в PCT WO 0018893. Однако в патенте США 4454161 и ЕР 0418945 описаны другие гликогенветвящие ферменты, которые могут быть использованы соответствующим образом. Ферментативное трансгликозилирование осуществляют путем инкубации воскообразного кукурузного крахмала с соответствующими ферментами в мягких условиях, при рН приблизительно 7,5 и температуре приблизительно 30°С, в водном растворе. Затем проводят обработку продуктов реакции, также известным способом, вначале дезактивируя или удаляя ферменты с помощью стадий изменения рН или фильтрации.
На следующей стадии гидролиза, которую предпочтительно проводят в присутствии хлористоводородной кислоты, получают продукт с целевой молекулярной массой. Затем продукт отделяют от низкомолекулярных соединений диафильтрацией через мембраны с пределом отсечения приблизительно 3000 Дальтон, и после нейтрализации продукта кислого гидролиза получают обычную соль. Продукт выделяют, например, путем распылительной сушки.
Помимо применения в качестве объемных плазмозаменителей сверхразветвленные амилопектины также могут успешно применяться в других областях медицины. Сверхразветвленный амилопектин можно таким образом использовать для аналогичных применений в области терапии и хирургии, в которых используются стандартные ГЭК продукты на основе типов крахмала с нормальным разветвлением.
Помимо применения в качестве объемных плазмозаменителей сверхразветвленные амилопектины предпочтительно используют для улучшения микроциркуляции, облегчения седиментации при выделении клеток в связи с лейкаферезом, или для низкотемпературного хранения компонентов крови, например, эритроцитов или гранулоцитов.
Пример моделирования 1
Сравнительные анализы расщепления α-1-4/α-1-6-глюкосахаридов с различной разветвленностью
Гликоген устриц от SIGMA расщепляют термоустойчивой α-амилазой BAN 480 L от NOVOZYMES в смеси ДМСО и воды, содержащей 30% ДМСО, при 70°С и рН 6,0. Течение реакции отслеживают, измеряя изменения молекулярной массы с помощью газовой хроматографии, и реакцию останавливают приблизительно через 2 часа добавлением раствора едкого натра для дезактивации фермента. После нейтрализации продукт фракционируют ультрафильтрацией с использованием ацетатцеллюлозного ультрафильтра с номинальным отсечением 1000 Д и 25000 Д, в результате чего низкомолекулярные фракции удаляются, а высокомолекулярные остаются. Затем продукт обрабатывают ионообменной смолой Amberlite IR 200 C и активированным углем, осаждают этанолом и сушат при 80°С.
Степень разветвленности, определенная с помощью 1Н ЯМР спектроскопии (с интеграцией сигналов от аномерных протонов), составляет 15 мол.%. Средняя ММ составляет 7000 Дальтон.
Жидкий кипящий воскообразный кукурузный крахмал (≥95% амилопектина) (Cerestar) обрабатывают описанным выше способом. Выделенная фракция высоко разветвленного кластера имеет степень разветвленности 11 мол.% и среднюю ММ 8000 Дальтон.
Затем фракции высокоразветвленных кластеров амилопектина и гликогена анализируют на расщепление в 1% растворе при 37°С, используя α-амилазы поджелудочной железы свиньи (Roche) в фосфатном буфере, рН 7,2, с концентрацией фермента 0,5 межд. ед./мл, и кинетику расщепления отслеживают, измеряя изменения ММ с помощью гель-хроматографии. Проводят сравнительный анализ расщепления, используя коммерческий объемный плазмозаменитель гидроксиэтилкрахмал (Voluven, Fresenius Kabi). Кинетики расщепления имеют четкие различия. Период полужизни ММ (уменьшение средней ММ исходного вещества вдвое по сравнению с начальным значением) составляет 60 минут в случае фракции со степенью разветвленности 15% и, следовательно, достигает периода полужизни плазмозаменителя Voluven, определенного в тех же условиях.
С другой стороны, период полужизни фракции со средней степенью разветвленности 11 мол.% составляет только 25 минут и, следовательно, является значительно короче.
Пример моделирования 2
Жидкий кипящий воскообразный кукурузный крахмал от Cerestar со средней степенью разветвленности 4 мол.%, как определено методом ЯМР, анализируют на расщепление, используя α-амилазу поджелудочной железы свиньи в соответствии с данными, приведенными в примере 1. Для данной цели 1% раствор желатинизируют в фосфатном буфере при рН 7,2 путем кратковременного нагревания приблизительно до 90°С и после охлаждения в реакционную смесь добавляют фермент до получения конечной концентрации 0,5 межд. ед./мл.
Температура анализа составляет 37°С.
Кинетику расщепления отслеживают, измеряя изменения ММ с помощью гель-хроматографии. ММ исходного вещества уменьшается вдвое в течение 10 минут в условиях, указанных в примере 1.
По сравнению со сверхразветвленными α-1-4/α1-6 глюкосахаридами примера 1 жидкий кипящий воскообразный кукурузный крахмал с относительно низкой средней степенью разветвленности расщепляется α-амилазой так быстро, что он не может применяться в качестве плазмозаменителя.
Таким образом, два показательных примера 1 и 2 демонстрируют, что даже если ММ является низкой, увеличение уровня разветвленности приводит к замедлению расщепления под действием α-амилазы, и что данный эффект может использоваться для промышленного получения плазмозаменителя.
Данное изобретение относится к медицине и описывает применение сверхразветвленного амилопектина или его производного, представляющего собой гидроксиэтиламилопектин, со средней степенью разветвленности, выраженной в мол.% ангидроглюкозы, несущей точки разветвления, составляющей от более 10 до 25 мол.%, и средневзвешенной мол.м. в интервале от 40000 до 800000 Дальтон, в способах хирургического или терапевтического лечения человека или животного или в диагностических методах. Объемные плазмозаменители на основе гидроксиэтилированного амилопектина имеют, как результат гидроксиэтилирования, обнаруживаемый до настоящего времени недостаток, заключающийся в неполном метаболизме и, следовательно, накоплении в тканях во времени, что связано с побочными эффектами. В соответствии с данным изобретением предоставляются новые плазмозаменители на основе полисахаридов, которые не имеют недостатков применяющихся прежде плазмозаменителей. Улучшенные полностью метаболизирующиеся плазмозаменители на основе сверхразветвленного амилопектина, которые могут быть получены из него таким образом, что нативные растительные амлопектины изменяются в результате трансгликозилирования с получением регулируемой высокой степени разветвленности, которая позволяет контролировать разложение под действием сывороточной α-амилазы, в результате чего гидроксиэтилирование не требуется или требуется только в очень незначительной степени. 6 з.п. ф-лы.
| ЕР 1075839 A1, 14.02.2001 | |||
| WO 00/18893 A1, 06.04.2000 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ГИДРОЛИЗАТА ОКСИЭТИЛИРОВАННОГО КРАХМАЛА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КРОВЕЗАМЕНИТЕЛЯ ПРОТИВОШОКОВОГО ДЕЙСТВИЯ | 1992 |
|
RU2021283C1 |
