ОЛИГОНУКЛЕОТИДПЕПТИДНЫЙ КОНЪЮГАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ РАСЩЕПЛЯТЬ ФОСФОДИЭФИРНЫЕ СВЯЗИ РНК В ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯХ GpN Российский патент 2007 года по МПК C07K7/06 C07H21/04 C12Q1/68 C12N9/22 C12N15/11 C12N15/55 

Изобретение относится к области биоорганической химии и касается получения олигонуклеотидпептидного конъюгата, обладающего способностью расщеплять фосфодиэфирные связи в одноцепочечных участках РНК в последовательностях ^5'GpN^3', который может найти применение при исследовании структуры РНК, а также комплексов РНК-белок, РНК-ДНК.

Направленное расщепление рибонуклеиновой кислоты (РНК) по заданным последовательностям является актуальной проблемой в связи с необходимостью манипулирования с молекулами РНК в молекулярно-биологических исследованиях и с целью создания терапевтических препаратов, действующих на РНК инфекционных агентов и мРНК, кодирующих белки, ответственные за развитие патологических состояний.

Известно использование фермента РНКазы Т1 из Aspergillus oryzae для специфичного расщепления фосфодиэфирных связей в одноцепочечных участках РНК в последовательностях ^5'GpN^3' [1]. Недостатком данного фермента является его низкая стабильность при комнатной температуре и способность разворачивать молекулу РНК, что неизбежно искажает результаты экспериментов. Кроме того, РНКаза Т1 работает в узком диапазоне условий.

Одним из подходов к созданию синтетических соединений, расщепляющих определенные РНК, является создание конъюгатов олигонуклеотидов с каталитически активными группами, способными вызывать расщепление фосфодиэфирных связей РНК. Известно несколько типов конъюгатов на основе олигодезоксирибонуклеотидов, несущих группы, способные катализировать расщепление РНК: остатки имидазола [2, 3], имидазол с присоединенной аминогруппой [4], бис-имидазольные конструкции [5], этилендиамин или пропилендиамин [6], а также производные терпиридина, хелатирующего ионы меди [7], и различные комплексы лантанидов [8]. Олигонуклеотиды при этом выполняют задачу доставки каталитически активных групп к выбранному участку молекулы-мишени.

Общим недостатком известных конъюгатов является низкая эффективность расщепления РНК, кроме того, эти конъюгаты расщепляют РНК по наиболее лабильным связям - СрА и UpA. Другой специфичности расщепления конъюгатами РНК не было продемонстрировано.

Наиболее близким к заявляемому - прототипом является олигонуклеотидпептидный конъюгат, представляющий собой олигонуклеотид, ковалентно присоединенный к пептиду, общей формулы: ACAAACC-p-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Gly-NH₂, где С - остаток цитозина, А - остаток аденозина, Leu - остаток лейцина, Arg - остаток аргинина, Gly - остаток глицина [9]. Данный олигонуклеотидпептидный конъюгат расщепляет фосфодиэфирные связи РНК в последовательностях СрА, UpA и GpN. Олигонуклеотид в составе конъюгатов такого типа не комплементарен РНК-мишени, он выполняет роль адаптера каталитически активной конформации пептида и модулирует специфичность расщепления [9].

Недостатком данного конъюгата является смешанная специфичность расщепления РНК - по последовательностям двух типов Pyr-рА (где Pyr - пиримидиновый нуклеотид, А - аденозин) и GpN (G - гуанозин, N - любой нуклеотид).

Целью настоящего изобретения является получение олигонуклеотидпептидного конъюгата, расщепляющего фосфодиэфирные связи РНК с высокой эффективностью исключительно в последовательностях ^5'GpN^3'.

Поставленная цель достигается предлагаемым олигонуклеотидпептидным конъюгатом, обладающим способностью расщеплять фосфодиэфирные связи РНК в последовательностях ^5'GpN^3'.

Заявляемый олигонуклеотидпептидный конъюгат состоит из олигонуклеотидной части (^5'GGATCTCTT^3'), пептидной части (Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Gly-NH₂) и соединяющих их дезоксирибозофосфатного линкера (dRib-dRib-dRib) и имеет следующую общую формулу:

^3'TTCTCTAGG^5'-dRib-dRib-dRib-^N-конецLeu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Gly-NH₂ ^{С-конец}, где: Т - остаток тимина, С - остаток цитозина, А - остаток аденозина, G - остаток гуанозина, dRib - остаток дезоксирибозы, Leu - остаток лейцина, Arg - остаток аргинина, Gly - остаток глицина.

Олигонуклеотидпептидный конъюгат (условное наименование рер-9) имеет молекулярную массу 4.4 кДа.

Реакцию расщепления РНК проводят в следующих условиях: буфер - 50 мМ Трис-HCl, рН 3.8-9.0, 2.5·10^-4 М РНК-носителя, 0.1-1 мМ ЭДТА, 0-200 мМ KCl, 0-5 мМ MgCl₂. Меченную ³²Р по 5'-концу РНК, концентрация которой не превышала 5·10^-7 М, инкубировали при 30-40°С в течение 3-24 ч в присутствии 1-100 мкМ олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9. Продукты расщепления анализируют с помощью электрофореза в 12-18%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. Для идентификации расщепляемых фосфодиэфирных связей параллельно на том же геле разделяют препараты соответствующих РНК, гидролизованных 2 М имидазолом, рН 7.0, и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Синтез олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9

Конъюгат получали по методу, описанному ранее [10]. Олигодезоксирибонуклеотид ^5'GGATCTCTT^3' синтезировали твердофазным автоматическим фосфитамидным методом на автоматическом синтезаторе. Пептид (LR)₄G-NH₂ присоединяли к олигодезоксирибонуклеотиду путем образования фосфамидной связи между 5'-концевой фосфатной группой линкера, состоящего из остатков дезоксирибозы, и α-аминогруппой N-концевого остатка лейцина. Выделение олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 после синтеза проводили с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке с сорбентом LiChrosorb RP-18. Гомогенность олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 тестировали с помощью электрофореза в 20%-ном денатурирующем ПААГ с последующей окраской нуклеотидного материала красителем Stains-all.

Пример 2

Олигонуклеотидпептидный конъюгат рер-9 использовали для исследования структуры РНК 21 и рибодуплекса на ее основе.

Расщепление РНК 21 и рибодуплекса на ее основе олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 проводили в буфере 50 мМ Трис-HCl, рН 7,0, содержащем 200 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА. Меченную ³²Р по 5'-концу РНК 21 и рибодуплекс на ее основе в концентрации 10^-7 М инкубировали в присутствии 10 мкМ олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 при 37°С в течение 5-24 ч.

На Фиг.1 представлена структура РНК 21 и рибодуплекса на ее основе (А) и приведен анализ расщепления РНК 21 и рибодуплекса на ее основе олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 (Б) в 12%-ном денатурирующем ПААГ. Дорожка L - расщепление РНК 2 М имидазолом, рН 7,0, в денатурирующих условиях; дорожка Т1 - расщепление РНКазой Т1 в концентрации 10 ед. акт. в денатурирующих условиях; дорожки С - инкубация РНК 21 и рибодуплекса на ее основе в отсутствие конъюгата в течение 8 ч. РНК 21 и рибодуплекс на ее основе инкубировали в стандартных условиях в присутствии 10 мкМ конъюгата при 37°С в течение 1-24 ч. Время инкубации указано сверху.

В РНК 21 под действием олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 расщепляется 5 связей: G₁₀, G₁₁, G₁₅, G₁₆ и G₁₉. С увеличением времени инкубации паттерн расщепления остается постоянным и не происходит появления других сайтов расщепления. Олигонуклеотидпептидный конъюгат рер-9 даже при длительной инкубации с рибодуплексом не вызывает его расщепления. Полученные данные позволяют заключить, что олигонуклеотидпептидный конъюгат рер-9 является искусственной рибонуклеазой, способной расщеплять фосфодиэфирные связи в одноцепочечных участках РНК в последовательностях ^5'GpN^3'.

Пример 3

Олигонуклеотидпептидный конъюгат рер-9 использовали для исследования структуры РНК 96 в растворе.

На Фиг.2 представлена структура РНК 96 (А) и приведен анализ расщепления РНК 96 олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 (Б) в 12%-ном денатурирующем ПААГ.

Дорожки L и Т1 - расщепление РНК 2 М имидазолом, рН 7,0, и РНКазой Т1 в денатурирующих условиях соответственно; дорожка С - инкубация РНК в отсутствие олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 в стандартных условиях в течение 8 ч. Меченную ³²P по 5'-концу РНК 96 инкубировали в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,0, содержащем 1 мМ ЭДТА, в присутствии 10 мкМ конъюгата при 37°С в течение 3-8 ч. Время инкубации указано сверху. Сайты расщепления РНКазой Т1 и олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 указаны слева, сайты самопроизвольного гидролиза указаны справа соответственно. Из Фиг.2 видно, что сайты расщепления РНК олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 и РНКазы Т1 совпадают.

Пример 4

Проводили сравнение свойств олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 и РНКазы Т1.

На Фиг.3 представлен анализ продуктов расщепления меченной ³²P по 5'-концу РНК 96 олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 и РНКазой Т1 в 12%-ном полиакриламидном денатурирующем геле. Дорожка L - расщепление РНК 2 М имидазолом, рН 7,0, в денатурирующих условиях; дорожки С - инкубация РНК в отсутствие олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 и РНКазы Т1 в соответствующих условиях в течение 8 ч.

Дорожки d: РНК инкубировали в буфере d в присутствии РНКазы Т1 в концентрации 3 и 5 ед. акт. при 50°С в течение 15 минут;

дорожки d1: РНК инкубировали в буфере d1 в присутствии 10 мкМ олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 при 37°С в течение 5 и 8 ч; дорожки d2, s/d, n: РНК инкубировали в буферах d2, s/d и n при 37°С в присутствии олигонуклеотидпептидного конъюгата рер-9 (10 мкМ) в течение 5 и 8 ч и РНКазы Т1 (3, 5 ед. акт.). Время инкубации с олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 указано сверху. Сайты гидролиза РНКазой Т1 и олигонуклеотидпептидным конъюгатом рер-9 указаны слева, сайты расщепления РНК в контролях указаны справа. Из Фиг.3 видно, что заявляемый олигонуклеотидпептидный конъюгат рер-9 является функциональным аналогом рибонуклеазы Т1 и может быть использован как реагент для определения расположения последовательностей фосфодиэфирных связей ^5'GpN^3' в одноцепочечных участках РНК.

Источники информации

1. Takahashi, К. and Moore, S. Part B, Ed. Boyer, P.D., Academic Press, New York, 435 (1982) In: The Enzymes: XV.

2. J.Hovinen, A.Guzaev, A.Azhayev and H.Lönneberg, J. Org. Chem., 1995, 60, 2005.

3. M.A.Reynolds, Т.A.Beck and L.J.Arnold, Nucleic Acids Res., 1996, 24, 760.

4. К.Ushijima and H.Takaku, Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1379, 217.

5. V.Silnikov, G.Zuber, J.-P.Behr, R.Gige. and V.Vlassov. Phosphorus, Sulfur, Silicon Relat. Elem., 1996, 109-110, 277.

6. M.Komiyama and T.Inokawa, J.Biochemistry, 1994, 116, 719.

7. J.K.Bashkin, E.I.Frolova and U.S.Sampath. J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 5981.

8. В.M.Белков, H.Ф.Крынецкая, E.M.Волков, З.А.Шабарова, H.Ю.Крайнова, Г.H.Новодарова, M.E.Вольпин. Биоорганическая химия, 1995, 21, 446 [Russ. J. Bioorg. Chem., 1995, 21 (Engl. Transl)].

9. Mironova N.L, Pyshnyi D.V, Ivanova E.M, Zenkova M.A, Gross H.J, Vlassov V.V. Covalently attached oligodeoxyribonucleotides induce RNase activity of a short peptide and modulate its base specificity. Nucleic Acids Res. 2004 Mar 26; 32(6):1928-36.

10. Зарытова В.Ф., Иванова E.M., Ярмолюк С.Н., Алексеева И.В. Синтез олигонуклеотидил-(5'-N), содержащих аргинин. Биополимеры и клетка. 1988. Т.1. С.220-222.

Изобретение относится к биоорганической химии. Предложен олигонуклеотид-пептидный конъюгат, имеющий общую формулу: ^3'TTCTCTAGG^5'-dRib-dRib-dRib-^N-конецLeu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Gly-NH₂ ^C-конец (где Т - остаток тимина, С - остаток цитозина, А - остаток аденозина, G - остаток гуанозина, dRib - остаток дезоксирибозы, Leu - остаток лейцина, Arg - остаток аргинина, Gly - остаток глицина). Технический результат - олигонуклеотид-пептидный конъюгат, расщепляющий фосфодиэфирные связи в одноцепочечных участках РНК исключительно в последовательностях ^5'GpN^3' (где G - гуанозин, N - любой рибонуклеотид) и являющийся функциональным аналогом рибонуклеазы Т1. 3 ил.

Олигонуклеотидпептидный конъюгат, обладающий способностью расщеплять фосфодиэфирные связи РНК в последовательностях ^5'GpN^3', имеющий следующую общую формулу:

^3'TTCTCTAGG9-dRib-dRib-dRib-^N-конецLeu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Leu-Arg-Gly-NH₂ ^{С-конец},

где Т - остаток тимина, С - остаток цитозина, А - остаток аденозина, G - остаток гуанозина, dRib - остаток дезоксирибозы, Leu - остаток лейцина, Arg - остаток аргинина, Gly - остаток глицина.