Данное изобретение относится к способам получения композиций, содержащих (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу. Данное изобретение также относится к способам получения композиций нуклеотидов, содержащих агрегированные олигонуклеотиды, подходящие для использования в вышеупомянутых способах. Более того, в данном изобретении также предложены композиции нуклеотидов, содержащие агрегированные олигонуклеотиды. Кроме того, в данном изобретении дополнительно предложены композиции, содержащие (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу.
Уровень техники
Вирусоподобные частицы РНК-бактериофагов, в которые упакованы олигонуклеотиды, в частности, богатые гуанином (G) олигонуклеотиды, считаются мощными стимуляторами иммунной системы. Такие вирусоподобные частицы и упакованные в них олигонуклеотиды, а также способы их получения описаны, например, в WO2003/024481, WO2004/000351, WO2004/084940, WO2004/007538, WO2007/068747 и WO2007/144150, полные описания которых включены в данный документ посредством ссылки. Обычно в основе этих способов лежит разборка рекомбинантной вирусоподобной частицы РНК-бактериофага, очистка белка оболочки указанной вирусоподобной частицы и повторная сборка указанного белка оболочки в присутствии олигонуклеотидов, что приводит к получению вирусоподобных частиц, в которые упакованы олигонуклеотиды. Эффективные и масштабируемые способы получения рекомбинантных вирусоподобных частиц РНК-бактериофагов дополнительно описаны, например, в WO2005/117963, WO2006/125821 и WO2007/039552, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
Способы синтеза олигонуклеотидов доступны уже более тридцати лет, причем наиболее часто используемым способом является синтез на основе фосфорамидитной химии (Beaucage et al., Curr Protoc Nucleic Acid Chem 3.3.1-3.3.20 (2000), полное описание которой включено в данный документ посредством ссылки). В фосфорамидитный синтез было внесено много значительных улучшений, чтобы сократить время синтеза и повысить выход продуктов. Синтез богатых гуанином (G) олигонуклеотидов, в частности олигонуклеотидов с последовательными остатками гуанина, всегда было сложнее осуществлять в большом производственном масштабе, в частности с высокой чистотой и высоким выходом, вероятно, из-за плохой доступности 5’-гидроксильной группы для активированного фосфорамидита на этапе сопряжения. В частности, связанный с носителем защищенный G-богатый олигомер может образовывать вторичные структуры и иметь проблемы с растворимостью после достижения определенной длины, что приводит к появлению примесей и неудачному синтезу, что в большинстве случаев приводит к получению олигонуклеотидных последовательностей с меньшим числом остатков G или даже с большим числом остатков G, чем необходимо. Как следствие, чистота коммерчески доступных богатых гуанином (G) олигонуклеотидов значительно повысилась благодаря указанным улучшениям, внесенным в фосфорамидитный синтез. Таким образом, тогда как 10-20 лет назад чистота 60-80% для указанного богатого гуанином (G) олигонуклеотида в отдельных случаях считалась приемлемой, в настоящее время в целом возможна чистота, составляющая 93%, 95% или даже 97 или 99%, аналогично не содержащим гуанин (G) олигонуклеотидам. Более того, если указанные (G)-богатые олигонуклеотиды являются частью фармацевтических препаратов, для получения разрешения регуляторных органов требуется использование таких (G)-богатых олигонуклеотидов с более высокой чистотой.
G-богатые олигонуклеотиды, в частности олигонуклеотиды с поли(G) в 5’- и 3’-конце, дополнительно содержащие неметилированные динуклеотидные мотивы CG и центральный палиндром, имеют тенденцию к самосборке во вторичные и третичные структуры высшего порядка посредством образования G-тетрад из поли(G)-мотивов (Kerkmann, M. et al., J. Biol. Chem., (2005) 280(9), 8086-93, Bochman, ML et al. Nat Rev Genet., (2012) 13(11): 770-780; полные описания которых включены в данный документ посредством ссылки). Эти G-квадруплексы могут образовываться меж- или внутримолекулярным путем и являются очень стабильными вторичными структурами. В результате размер, форма и конформация этих квадруплексов могут быть достаточно вариабельными в зависимости от пути реакции.
В WO2007/144150 описан способ получения композиций, содержащих богатые гуанином (G) олигонуклеотиды, упакованные в вирусоподобные частицы РНК-бактериофага, при этом самосборка белка оболочки РНК-бактериофага осуществляется в присутствии агрегатов олигонуклеотидов, которые были получены в процессе дезагрегации/агрегации. Состояние агрегации олигонуклеотида характеризуется относительным временем начала пика (ВНП) при проведении эксклюзионной ВЭЖХ с использованием капсида указанного РНК-бактериофага в качестве стандарта, и было обнаружено, что ВНП от 50 до 110%, предпочтительно от 80 до 95%, является оптимальным. Показано, что такие ВПН соответствуют олигонуклеотидным агрегатам, имеющим кажущуюся молекулярную массу в диапазоне кажущейся молекулярной массы капсида указанного РНК-бактериофага или немного меньше. Несмотря на улучшения по сравнению с известными способами получения композиций, содержащих богатые гуанином (G) олигонуклеотиды, упакованные в вирусоподобные частицы РНК-бактериофагов, авторы данного изобретения обнаружили существенные недостатки этого способа предшествующего уровня техники, описанного в WO2007/144150.
Краткое описание сущности изобретения
В частности, авторами данного изобретения было обнаружено, что агрегированные олигонуклеотиды, полученные в соответствии со способом предшествующего уровня техники, описанным в WO2007/144150, и имеющие распределение по размерам, определенное в WO2007/144150, демонстрировали существенные несоответствия и большую вариабельность в отношении удельного размера и конформации образованных агрегированных олигонуклеотидов по определению методом динамического рассеяния света (ДРС). Кроме того, указанные несоответствия в отношении удельного размера и конформации образованных агрегированных олигонуклеотидов дополнительно привели к существенным несоответствиям в вирусоподобных частицах, в которые были упакованы указанные агрегированные олигонуклеотиды, что повлекло за собой не только образование необходимых сферических упакованных ВПЧ, но, кроме того, образование деформированных стержнеподобных агрегатов или агрегатов высшего порядка. Более того, указанные полученные в результате ВПЧ, в которые были упакованы указанные высокополидисперсные агрегированные олигонуклеотиды, имели не только меньшую чистоту, но также и повышенную нестабильность.
Важно отметить, что дополнительно было обнаружено, что способ дезагрегации/агрегации предшествующего уровня техники, описанный в WO2007/144150, сильно зависит от исходной чистоты олигонуклеотидов, используемых для указанных этапов дезагрегации/агрегации. В частности, было обнаружено, что исходная чистота олигонуклеотидов, используемых в способе дезагрегации/агрегации по WO2007/144150, влияет на агрегацию олигонуклеотидов, т. е. на скорость агрегации и, таким образом, на образование G-квадруплексов, для образования агрегированных олигонуклеотидов с определенными необходимыми размером и конформацией. Как правило, чем выше чистота олигонуклеотидов, используемых в способе дезагрегации/агрегации по WO2007/144150, тем быстрее, более неконтролируемо и хаотично происходит агрегация, что приводит к увеличению количества обычно очень крупных агрегированных олигонуклеотидов за пределами необходимого диапазона размеров. Как следствие, и поскольку полученные агрегированные олигонуклеотиды не могут быть должным образом упакованы, конечные ВПЧ, в которые были упакованы олигонуклеотиды, имели сниженную чистоту, что требовало интенсивной и дорогостоящей очистки, и сниженную стабильность, о чем свидетельствует изменение ЭХ-хроматограммы со временем. В частности, со временем наблюдалось увеличение количества низкомолекулярных пиков, что позволяет предположить, что некоторые ВПЧ не были стабильными и высвобождали изначально упакованные ДНК и олигонуклеотиды, соответственно.
На основании этих открытий авторов изобретения и, в частности, на основании сильной зависимости от чистоты исходных используемых олигонуклеотидов способа дезагрегации/агрегации по WO2007/144150, оказалось, что способы по WO2007/144150, в частности способы дезагрегации/агрегации по WO2007/144150, были разработаны и оптимизированы для G-богатых олигонуклеотидов с более низкой чистотой. Как указано, в настоящее время G-богатые олигонуклеотиды высокой чистоты не только широко доступны, но, более того, их использование в фармацевтических препаратах является предварительным условием для получения разрешения регуляторных органов. Более того, дополнительным существенным недостатком способов предшествующего уровня техники по WO2007/144150, помимо несоответствий и большой вариабельности в отношении удельного размера и конформации образуемых агрегированных олигонуклеотидов в зависимости от чистоты исходных используемых олигонуклеотидов, является то, что для них характерно очень узкое временное окно, доступное для получения агрегированных олигонуклеотидов в определенном диапазоне размеров, из-за неконтролируемой и хаотической агрегации.
Как следствие, и из-за этих возникающих несоответствий и вариаций, а также сильной зависимости от чистоты исходных используемых олигонуклеотидов, способы по WO2007/144150 не подходят для производства в больших масштабах и, в частности, не подходят для НПП-производства, в особенности для материалов для клинических испытаний, когда важно соответствие между партиями.
Таким образом, в данном изобретении предложены способы получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, и получения композиции, содержащей вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и агрегированные олигонуклеотиды, упакованные в указанную вирусоподобную частицу, с устранением или уменьшением, таким образом, недостатков способов предыдущего уровня техники.
Таким образом, в первом аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, причем указанный способ включает такие этапы:
(a) получение олигонуклеотидов, причем указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один участок поли-G;
(b) денатурация указанных олигонуклеотидов, причем указанная денатурация включает этап
(i) инкубации водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды и хаотропный агент, при температуре I до тех пор, пока средний диаметр указанных олигонуклеотидов не составит 1 нм или менее, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура I составляет от 75°C до 99°C, а указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину;
(c) агрегация указанных олигонуклеотидов, причем указанная агрегация включает этапы
(i) инкубации водного раствора II, содержащего указанные олигонуклеотиды с указанным средним диаметром 1 нм или менее, полученные на этапе (b), хаотропный агент и катион, при температуре II с образованием указанных агрегированных олигонуклеотидов, при этом указанную инкубацию проводят до получения среднего диаметра указанных образованных агрегированных олигонуклеотидов 6-16 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура II составляет от 75°C до 99°C, а указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину;
(ii) доведение температуры указанного раствора II до температуры III, причем указанная температура III ниже 40°C, предпочтительно ниже 30°C;
при этом указанные этапы предпочтительно проводят в заданном порядке.
Преимущественно способы по изобретению позволяют контролировать размер образуемых агрегированных олигонуклеотидов и, таким образом, конформацию агрегированных олигонуклеотидов, и, как следствие этого, соответствующее образование имеющих высокую степень чистоты, стабильность и хорошую форму, то есть, как правило, исключительно сферических ВПЧ, в которые упакованы олигонуклеотиды.
Таким образом, способы по изобретению позволяют контролировать размер агрегированных олигонуклеотидов по их диаметру в диапазоне 6-16 нм, предпочтительно 7-14 нм, более предпочтительно 8-14 нм, еще более предпочтительно 9-14 нм, еще более предпочтительно 10-14 нм, еще более предпочтительно 11-13 нм, то есть 11, 12 или 13 нм, и наиболее предпочтительно 12 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
Важно отметить, что способы по изобретению позволяют не только контролировать размер и, следовательно, конформацию образуемых агрегированных олигонуклеотидов, но также делать это вне зависимости от чистоты олигонуклеотидов, используемых на этапе денатурации. Кроме того, способы по изобретению дополнительно позволяют применять и обеспечивают более широкое рабочее окно, в котором можно выполнять этап агрегации, поскольку это позволяет контролировать агрегацию. Такой контроль, дополнительное время и более широкое рабочее окно, соответственно, а также более высокая точность технологического контроля делают способы по изобретению очень выгодными для дорогостоящего производства с качеством НПП, в частности с качеством НПП в больших масштабах. Более того, выход конечных получаемых упакованных олигонуклеотидами ВПЧ намного выше и они имеют большую степень чистоты, в частности, отсутствует необходимость проведения дополнительных дорогостоящих этапов очистки.
Как указано, способы предшествующего уровня техники по WO2007/144150 приводили к образованию агрегированных олигонуклеотидов, которые демонстрировали существенные несоответствия и большую вариабельность в отношении удельного размера и конформации образуемых агрегированных олигонуклеотидов по определению методом динамического рассеяния света (ДРС), в отличие от агрегированных олигонуклеотидов, образованных согласно способам данного изобретения. При этом следует отметить, что все агрегированные олигонуклеотиды, образованные согласно способам данного изобретения, соответствовали критериям спецификации относительного времени начала пика (ВНП) при проведении эксклюзионной ВЭЖХ с использованием капсида указанного РНК-бактериофага в качестве стандарта по определению WO2007/144150, даже если соответствующий оптимальный диапазон был немного смещен. Таким образом, предпочтительные агрегированные олигонуклеотиды, образованные согласно способам данного изобретения, действительно обладают ВНП, составляющим по определению, соответственно, 90-105%, предпочтительно 92-102%.
Дополнительным преимуществом способов по изобретению является отсутствие солей и, в частности, использование хаотропного агента, предпочтительно мочевины, на этапе денатурации по сравнению со способом предшествующего уровня техники по WO2007/144150. Как следствие, растворы, получаемые в результате применения способов по изобретению, содержащие денатурированные, как правило, мономерные олигонуклеотиды, являются стабильными без угрозы повторной агрегации и, таким образом, их можно хранить для дальнейшего использования. Следовательно, эти растворы можно нагревать или охлаждать некоторое количество раз без образования агрегатов, и, предпочтительно, их можно замораживать для использования в будущем. Последнее было невозможно для способов предшествующего уровня техники, наиболее вероятно из-за присутствия соли, образуемой на этапе нейтрализации, необходимом для прекращения этапа денатурации перед деградацией олигонуклеотидов. Таким образом, указанные получаемые растворы предшествующего уровня техники приходилось использовать сразу без возможности хранения.
В целях данного изобретения характеристики состояния агрегации олигонуклеотидов получают методом динамического рассеяния света (ДРС), в котором измеряют флуктуации рассеянного света в зависимости от времени. Затем рассчитывают гидродинамические радиусы и диаметры агрегированных олигонуклеотидов, устанавливая соотношение скорости диффузии агрегатов через растворитель. Было обнаружено, что оптимальными являются агрегированные олигонуклеотиды, имеющие средний гидродинамический диаметр 6-16 нм, предпочтительно 7-14 нм, более предпочтительно 8-14 нм, еще более предпочтительно 9-14 нм, еще более предпочтительно 10-14 нм, еще более предпочтительно 11-13 нм, то есть 11, 12 или 13 нм, и наиболее предпочтительно 12 нм.
Таким образом, в дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, а указанный способ включает такие этапы:
(а) создание смеси, причем указанная смесь содержит:
(i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, а указанный способ включает такие этапы:
(а) создание смеси, причем указанная смесь содержит:
(i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды могут быть получены способом в соответствии с первым аспектом данного изобретения, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, а указанный способ включает такие этапы:
(а) создание смеси, причем указанная смесь содержит:
(i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) композицию нуклеотидов, содержащую указанные агрегированные олигонуклеотиды, при этом указанная композиция нуклеотидов может быть получена способом получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, в соответствии с данным изобретением, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
Во время осуществления указанных способов указанная вирусоподобная частица образуется путем самосборки белка оболочки указанного РНК-бактериофага в присутствии указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанная композиция нуклеотидов может быть получена способом получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, в соответствии с данным изобретением, при этом предпочтительно указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанная композиция может быть получена способом получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
Дополнительные аспекты и варианты осуществления данного изобретения станут очевидными по мере продолжения этого описания.
Описание ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1A: Динамическое рассеяние света (ДРС) денатурированного олигонуклеотида G10 и агрегированных олигонуклеотидов G10, полученных способом по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3. На Фиг. 1A проиллюстрирован денатурированный олигонуклеотид G10 с высокой степенью чистоты со средним диаметром частиц 0,90 нм, что указывает на разрушение вторичных структур олигонуклеотида G10, завершение денатурации и получение мономеров. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 1B: Динамическое рассеяние света (ДРС) денатурированного олигонуклеотида G10 и агрегированных олигонуклеотидов G10, полученных способом по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3. На Фиг. 1B проиллюстрированы последовательно агрегированные олигонуклеотиды G10, имеющие надлежащую агрегацию и диаметр 12 нм. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 2A: ДРС денатурированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Олигонуклеотид G10 с низкой степенью чистоты с SEQ ID NO:1 (около 79% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ) использовали для дезагрегации (денатурации), как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150). ДРС показывает наличие частиц со средним диаметром 2,2 нм, что указывает на то, что не вся вторичная структура олигонуклеотида G10 была разрушена и денатурирована до мономера. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 2B: ДРС денатурированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Олигонуклеотид G10 с высокой степенью чистоты с SEQ ID NO:1 (около 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ) использовали для дезагрегации (денатурации), как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150). ДРС показывает наличие частиц со средним диаметром 2,8 нм, что указывает на то, что не вся вторичная структура олигонуклеотида G10 была разрушена и денатурирована до мономера. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 2C: ДРС денатурированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Олигонуклеотид G10 с высокой степенью чистоты с SEQ ID NO:1 (около 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ) использовали для денатурации способом по изобретению. ДРС показывает наличие частиц со средним диаметром 0,9 нм, что указывает на то, что олигонуклеотид G10 был полностью или практически полностью денатурирован до мономера. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 3A: ДРС агрегированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Использовали денатурированные олигонуклеотиды, полученные в примере 5 (Фиг. 2A-2C). Проводили агрегацию, как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150), G10 низкой чистоты, денатурированного способом предшествующего уровня техники. Олигонуклеотид G10 низкой чистоты с SEQ ID NO:1 соответствует чистоте около 79% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ. ДРС показывает наличие агрегированных олигонуклеотидов, которые не только находятся в верхней части необходимого диапазона частиц (15 нм), но, кроме того, 10% материала имеет значительно больший размер (30-50 нм). Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 3B: ДРС агрегированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Использовали денатурированные олигонуклеотиды, полученные в примере 5 (Фиг. 2A-2C). Проводили агрегацию, как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150), G10 высокой чистоты, денатурированного способом предшествующего уровня техники. Олигонуклеотид G10 высокой чистоты с SEQ ID NO:XX соответствует чистоте около 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ. ДРС показывает наличие агрегированных олигонуклеотидов со средним диаметром, полностью (100%) находящимся за пределами диапазона диаметров 6-16 нм (необходимый диапазон), как проиллюстрировано заштрихованным прямоугольником. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 3C: ДРС агрегированных олигонуклеотидов G10. ДРС проводили, как описано в примере 3. Использовали денатурированные олигонуклеотиды, полученные в примере 5 (Фиг. 2A-2C). Агрегацию G10 высокой чистоты проводили в соответствии с представленным способом по изобретению. Олигонуклеотид G10 высокой чистоты с SEQ ID NO:1 соответствует чистоте около 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ. ДРС показывает наличие агрегированных олигонуклеотидов, при этом средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов полностью (100%) находится в диапазоне диаметров 6-16 нм (необходимый диапазон), как проиллюстрировано заштрихованным прямоугольником. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 4A: Характеристика очищенного белка оболочки Qβ методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Образец очищенной ВПЧ Qβ. В наблюдаемом пике (соотношение A260/A280 = 2) преобладает РНК-ядро ВПЧ, поскольку коэффициент поглощения РНК на 260 нм приблизительно в 100 раз выше, чем коэффициент поглощения белка оболочки.
Фиг. 4B: Определение характеристик очищенного белка оболочки Qβ методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Образец супернатанта реакции разборки. На высвобождение белка оболочки указывает присутствие белкового пика приблизительно на 12 мин. Кроме того, несколько видов неосажденных молекул РНК присутствуют в диапазоне от 6,8 до 11 мин.
Фиг. 4C: Определение характеристик очищенного белка оболочки Qβ методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Образец очищенного белка оболочки Qβ. Анализ выполняли в ФСБ на колонке TSK G5000PWxl (Tosoh Bioscience).
Фиг. 5A: ДРС и электронные микрофотографии (ЭМ) вирусоподобных частиц (ВПЧ) РНК-бактериофага Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученными способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники и денатурации и агрегации по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3, а ЭМ получали, как описано в примере 8. ДРС ВПЧ Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 5B: ДРС и электронные микрофотографии (ЭМ) вирусоподобных частиц (ВПЧ) РНК-бактериофага Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученными способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники и денатурации и агрегации по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3, и ЭМ получали, как описано в примере 8. ЭМ ВПЧ Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники. Стрелки включены для обозначения стержнеподобных структур.
Фиг. 5C: ДРС и электронные микрофотографии (ЭМ) вирусоподобных частиц (ВПЧ) РНК-бактериофага Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученными способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники и денатурации и агрегации по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3, а ЭМ получали, как описано в примере 8. ДРС ВПЧ Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные способом по изобретению. Сканирование проводили несколько раз, что проиллюстрировано перекрывающимися кривыми. Средний диаметр (Dгид) и процентное значение первичного пика (среднее значение) этих сканирований указаны во вставленном блоке данных на графике.
Фиг. 5D: ДРС и электронные микрофотографии (ЭМ) вирусоподобных частиц (ВПЧ) РНК-бактериофага Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученными способом дезагрегации-агрегации предшествующего уровня техники и денатурации и агрегации по данному изобретению. ДРС проводили, как описано в примере 3, а ЭМ получали, как описано в примере 8. ЭМ ВПЧ Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные способом по изобретению.
Подробное описание изобретения
Если отсутствуют иные определения, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значения, общеизвестные специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение.
Средний диаметр: в контексте данного документа термин «средний диаметр» по определению методом динамического рассеяния света (ДРС) относится к диаметру, который обычно и предпочтительно измеряют методом ДРС, как описано в примере 3, и который, при заданном среднем значении диаметра измеряемых частиц, относится к частицам, имеющим указанный диаметр, соответствующий среднему значению в нормальном распределении (распределении Гаусса). Таким образом, термин «средний диаметр» по определению методом динамического рассеяния света (ДРС) в контексте данного документа и обычно и предпочтительно применяемый к олигонуклеотидам, агрегированным олигонуклеотидам и ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением, обычно и предпочтительно относится к диаметру, измеренному методом ДРС, обычно и предпочтительно способом, описанным в примере 3, и который, при заданном среднем значении диаметра измеряемых частиц, относится к частицам, в которых по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных частиц имеют диаметр указанного заданного значения или диаметр на ± 10% отличающийся от указанного заданного значения. В целях внесения ясности, например, среднее значение диаметра 12 нм агрегированных олигонуклеотидов по изобретению относится к указанным агрегированным олигонуклеотидам по изобретению, причем по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов по изобретению имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм. Кроме того, в контексте данного документа термин «средний диаметр», определяемый методом динамического рассеяния света (ДРС), обычно и предпочтительно применяемый к олигонуклеотидам, агрегированным олигонуклеотидам и ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды по данному изобретению, обычно и предпочтительно относится к диаметру, измеренному методом ДРС, обычно и предпочтительно способом, описанным в примере 3, который при заданном среднем значении диаметра измеренных частиц относится к частицам, из которых по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных частиц имеют диаметр указанного заданного значения или диаметр в пределах ± 5% от указанного заданного значения. В целях внесения ясности, например, среднее значение диаметра 12 нм агрегированных олигонуклеотидов по изобретению относится к указанным агрегированным олигонуклеотидам по изобретению, причем по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов по изобретению имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм.
Все диапазоны значений, в частности все диапазоны средних диаметров или диаметров, раскрытые в данном документе, должны относиться ко всем значениям, попадающим в указанный диапазон, включая значения, определяющие диапазон. В целях внесения ясности, например, значение диаметра от 12 нм до 13 нм должно относиться к диаметру от 12 нм или 13 нм или ко всем значениям диаметра, находящимся в пределах от 12 нм до 13 нм.
Хаотропный агент: В контексте данного документа термин «хаотропный агент» относится к молекуле или веществу, которые нарушают упорядоченную структуру белка, олигонуклеотида или другой макромолекулы. Это снижение стабильности обычно вызвано нарушением сети водородных связей. Примеры включают, помимо прочего, мочевину, фенол, изопропиловый спирт (ИПС), этанол и хлорид гуанидиния.
Олигонуклеотид: В контексте данного документа термин «олигонуклеотид» относится к одноцепочечному дезоксирибонуклеотиду. Предпочтительный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок поли-G по определению ниже. Более предпочтительные олигонуклеотиды содержат 2, 3, 4, 5 или 6 указанных участков поли-G. В особенности предпочтительные олигонуклеотиды содержат ровно два участка поли-G, причем предпочтительно один из указанных двух участков поли-G расположен в 5’-конце или в 3’-конце указанного олигонуклеотида. Даже более предпочтительные олигонуклеотиды содержат ровно два участка поли-G, причем один из указанных двух участков поли-G расположен в 5’ конце указанного олигонуклеотида, а один из двух указанных участков поли-G расположен в 3’ конце указанного олигонуклеотида. Обычно и предпочтительно олигонуклеотид в контексте данного документа состоит из 6-1000, предпочтительно 10-1000, более предпочтительно 10-200, еще более предпочтительно 10-100, еще более предпочтительно 20-40 и наиболее предпочтительно из 30 нуклеотидов. Дополнительные предпочтительные олигонуклеотиды состоят из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов. Еще более предпочтительные олигонуклеотиды состоят из 24-32 нуклеотидов, более предпочтительно из около 30 нуклеотидов.
Термин «олигонуклеотид» также относится к молекулам, содержащим по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, причем указанный модифицированный нуклеотид предпочтительно выбран из (а) нуклеотидного аналога или (b) нуклеотида, содержащего модификацию остова. В одном варианте осуществления олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из (а) пептидной нуклеиновой кислоты, (b) инозина, (c) тритилированных оснований, (d) тиофосфатов, (e) алкилтиофосфатов, (f) 5-нитроиндол дезоксирибофуранозила, (g) 5-метилдезоксицитозина и (h) 5,6-дигидро-5,6-дигидроксидезокситимидина. В дополнительном варианте осуществления олигонуклеотид содержит тиофосфатные нуклеотиды или, в альтернативном варианте, состоит из них. Тиофосфатные нуклеотиды защищены от деградации в клетке или организме и, следовательно, являются предпочтительными модификациями нуклеотидов. Кроме того, предпочтительными являются химически, ферментативно или метаболически модифицированные формы полинуклеотидов, которые обычно встречаются в природе. Однако предпочтительные олигонуклеотиды состоят исключительно из немодифицированных нуклеотидов, т. е. из аденозина, тимидина, гуанозина и/или цитидина. Еще более предпочтительные олигонуклеотиды состоят исключительно из нуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В особенности предпочтительными олигонуклеотидами являются неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один, предпочтительно один, два, три или четыре мотива CpG. Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, при этом предпочтительно указанная палиндромная последовательность содержит по меньшей мере один, предпочтительно один, два, три или четыре мотива CpG. Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, при этом предпочтительно указанная палиндромная последовательность включает или предпочтительно состоит из последовательности GACGATCGTC (SEQ ID NO:2). Еще более предпочтительные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, причем указанная палиндромная последовательность фланкируется в 5’-конце участком поли-G и причем указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце участком поли-G, при этом предпочтительно указанная палиндромная последовательность представляет собой GACGATCGTC (SEQ ID NO:2). В особенности предпочтительные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, причем указанная палиндромная последовательность фланкируется в 5’-конце по меньшей мере 3-15, предпочтительно 6-10 молекулами гуанозина, и причем указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 3-15, предпочтительно 6-10 молекулами гуанозина, при этом предпочтительно указанная палиндромная последовательность представляет собой GACGATCGTC (SEQ ID NO:2).
Участок поли-G: Термин участок поли-G относится к сегменту олигонуклеотида, при этом указанный сегмент состоит по меньшей мере из 3 последовательных остатков гуанозина. Предпочтительные участки поли-G состоят из 3-25, предпочтительно 4-20, более предпочтительно 4-15 и наиболее предпочтительно из 4-10 последовательных молекул гуанозина. Дополнительные предпочтительные участки поли-G состоят из 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 последовательных молекул гуанозина.
Мотив CpG: В контексте данного документа термин «мотив CpG» относится к короткой последовательности ДНК, предпочтительно одноцепочечной последовательности ДНК, содержащей динуклеотид цитозин (C) - гуанозин (G), причем C является неметилированным, а указанный динуклеотид CG предпочтительно связан фосфодиэфирной связью. Мотив CpG предпочтительно содержит по меньшей мере один, предпочтительно один, два или три дополнительных нуклеотида, расположенных 5’ и/или 3’ относительно указанного динуклеотида CG, при этом дополнительно предпочтительно указанные дополнительные нуклеотиды не содержат динуклеотид CG.
Относительное время начала пика: Термин «относительное время начала пика» представляет собой параметр, который указывает на состояние агрегации олигонуклеотида и который был получен аналитически, в целом, как описано в WO 2007/144150, методом аналитической эксклюзионной ВЭЖХ с использованием условий, описанных в примере. 4.
Упакованный: В контексте данного документа термин «упакованный» относится к состоянию олигонуклеотида, обычно и предпочтительно агрегированных олигонуклеотидов, относительно вирусоподобной частицы. Использование терминов «агрегированные олигонуклеотиды, упакованные в ВПЧ» или «ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды» является эквивалентным. В контексте данного документа термин «упакованный» обычно и предпочтительно относится к нековалентному связыванию, предпочтительно к ионным взаимодействиям, гидрофобным взаимодействиям или водородным связям. Обычно и в особенности предпочтительно термин «упакованный» в контексте данного документа относится к инкапсуляции указанных агрегированных олигонуклеотидов в ВПЧ. Обычно и предпочтительно ВПЧ, в которую упакованы агрегированные олигонуклеотиды, защищает указанные агрегированные олигонуклеотиды от деградации, предпочтительно от гидролиза ДНКазой. Следовательно, в предпочтительном значении термин «упакованный» означает, что агрегированные олигонуклеотиды в упакованном состоянии недоступны для гидролиза ДНКазой. Более предпочтительно, термин «упакованный» указывает на то, что агрегированные олигонуклеотиды недоступны для гидролиза ДНКазой, при этом дополнительно предпочтительно ДНКаза представляет собой ДНКазу I или бензоназу. Еще более предпочтительно термин «упакованный» указывает на то, что агрегированные олигонуклеотиды недоступны для гидролиза бензоназой.
Доступность олигонуклеотида для ДНКазы (например, ДНКазы I или бензоназы) предпочтительно оценивают, как описано в примерах 11-17 WO2003/024481A2 (смотрите стр. 111). В предпочтительном значении считают, что ВПЧ упакована олигонуклеотидами, когда после обработки бензоназой (190 Е бензоназы/мг белка оболочки в буфере, содержащем 2 мМ MgCl2, pH 7,2, 20-25 °C, 18 ч) по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% указанного олигонуклеотида можно восстановить из указанной ВПЧ (например, в геле, окрашенном бромистым этидием). Для специалиста в данной области техники очевидно, что для такого анализа необходимы соответствующие контроли, и может понадобиться его адаптация к конкретной комбинации ВПЧ и олигонуклеотида. В особенно предпочтительном значении олигонуклеотид G10 (SEQ ID NO:1) считают упакованным в ВПЧ РНК-бактериофага Qβ, когда после обработки бензоназой (190 Е бензоназы/мг белка оболочки в буфере, содержащем 2 мМ MgCl2, pH 7,2, 20-25 °C, 18 ч) по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98% указанного G10 можно восстановить из указанной ВПЧ РНК-бактериофага Qβ.
Белок оболочки: В контексте данного документа термин «белок оболочки» относится к белку (белкам) РНК-бактериофага, которые могут быть включены в структуру капсида бактериофага или РНК-бактериофага. Таким образом, термин «белок оболочки» относится к белку, образующему капсид РНК-бактериофага или ВПЧ РНК-бактериофага. Обычно и предпочтительно белок оболочки РНК-бактериофагов имеет димерную структуру.
Фрагмент рекомбинантного белка оболочки: В контексте данного документа фрагмент рекомбинантного белка оболочки определен как полипептид, который составляет по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95% длины белка оболочки дикого типа или рекомбинантного белка дикого типа, соответственно, и который предпочтительно сохраняет способность образовывать ВПЧ. Предпочтительно, чтобы этот фрагмент был получен посредством по меньшей мере одной внутренней делеции, по меньшей мере одного усечения или по меньшей мере одной их комбинации. Термин «фрагмент рекомбинантного белка оболочки» или «фрагмент белка оболочки» должен дополнительно включать полипептид, который имеет по меньшей мере 80%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности аминокислотной последовательности с белком оболочки дикого типа, соответственно, и который предпочтительно способен к сборке в вирусоподобную частицу. Термин «мутантный белок оболочки» относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, полученную из рекомбинантного белка или белка оболочки дикого типа, соответственно, причем аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, предпочтительно не менее чем на 85%, 90%, 95%, 97% или 99% идентична последовательности дикого типа и предпочтительно сохраняет способность к сборке в ВПЧ.
Вирусоподобная частица (ВПЧ): В контексте данного документа ВПЧ относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной вирусной частице, или относится к нерепликативной или неинфекционной, предпочтительно нерепликативной и неинфекционной структуре, напоминающей вирусную частицу, предпочтительно капсид вируса. В контексте данного документа термин «нерепликативный» относится к неспособности реплицировать геном, содержащийся в ВПЧ. В контексте данного документа термин «неинфекционный» относится к неспособности проникать в клетку-хозяина. Предпочтительно вирусоподобная частица в соответствии с изобретением является нерепликативной и/или неинфекционной, поскольку у нее полностью или частично отсутствует вирусный геном или функция вирусного генома. В одном варианте осуществления вирусоподобная частица представляет собой вирусную частицу, в которой вирусный геном был физически или химически инактивирован, удален путем разборки и повторной сборки или путем сборки очищенных белков в ВПЧ. Обычно и более предпочтительно в вирусоподобной частице отсутствуют все или часть репликативных и инфекционных компонентов вирусного генома. Вирусоподобная частица в соответствии с изобретением может содержать нуклеиновую кислоту, отличную от ее генома. Типичным и предпочтительным вариантом осуществления вирусоподобной частицы в соответствии с данным изобретением является вирусный капсид, такой как вирусный капсид соответствующего вируса, бактериофага, предпочтительно РНК-бактериофага. Термин «капсид» относится к макромолекулярной структуре, состоящей из субъединиц вирусного белка. Обычно присутствует 60, 120, 180, 240, 300, 360 и более 360 субъединиц вирусного белка. Обычно и предпочтительно взаимодействия этих субъединиц приводят к образованию вирусного капсида с характерным повторяющимся упорядочением, причем указанная структура обычно и предпочтительно является сферической. Например, капсиды РНК-бактериофагов имеют сферическую форму икосаэдрической симметрии.
Вирусоподобная частица РНК-бактериофага: В контексте данного документа термин «вирусоподобная частица РНК-бактериофага» относится к вирусоподобной частице, содержащей или предпочтительно состоящей преимущественно из или состоящей из белков оболочки, их мутантных форм или фрагментов РНК-бактериофага. Кроме того, вирусоподобная частица РНК-бактериофага, напоминающая структуру РНК-бактериофага, является нерепликативной и/или неинфекционной, и в ней отсутствуют по меньшей мере ген или гены, кодирующие аппарат репликации РНК-бактериофага, и обычно также отсутствуют ген или гены, кодирующие белок или белки, ответственные за прикрепление вируса к хозяину или проникновение в него. Предпочтительные ВПЧ, полученные из РНК-бактериофагов, обладают икосаэдрической симметрией и состоят из 180 субъединиц. В контексте изобретения термин вирусоподобная частица РНК-бактериофага предпочтительно относится к макромолекулярной структуре, полученной путем самосборки рекомбинантного белка оболочки РНК-бактериофага или его фрагментов или мутантных форм, при этом предпочтительно указанная самосборка происходит в присутствии олигонуклеотидов и агрегированных олигонуклеотидов, соответственно.
Агент, способный предотвращать самосборку белка оболочки: Агент, способный предотвращать самосборку белка оболочки, представляет собой агент, который предотвращает спонтанное образование вирусоподобных частиц в указанной смеси. Специалист в данной области техники может определить химическую природу и подходящую концентрацию указанного агента экспериментально, например, путем анализа указанной смеси с помощью эксклюзионной хроматографии, как, например, описано в примере 9 WO2007/144150. Агент способен предотвращать самосборку белка оболочки, если после инкубации указанной смеси в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре, предпочтительно при 22°C, эксклюзионная хроматография не обнаруживает никаких вирусоподобных частиц, как, например, описано в примере 9 WO2007/144150. При этом агент, который способен предотвращать самосборку белка оболочки, не вызывает необратимого изменения указанного белка оболочки, а удаление указанного агента из указанной смеси приведет к спонтанному образованию вирусоподобных частиц. Предпочтительные агенты, способные предотвращать самосборку белка оболочки, включают детергенты, гидрохлорид гуанидиния и мочевину, наиболее предпочтительно мочевину. Предпочтительными детергентами являются додецилсульфат натрия, Твин 20, ТритонX 100 и т. п. Обычно и предпочтительно агенты, способные предотвращать самосборку белка оболочки, дополнительно содержат восстанавливающий агент, например обычно и предпочтительно ДДТ, который поддерживает межмолекулярные дисульфидные связи, образованные остатками цистеина указанного белка оболочки, в восстановленном состоянии.
Чистота: Чистоту композиции по данному изобретению, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, определяют методом аналитической эксклюзионной ВЭЖХ, при этом указанную ВЭЖХ проводят в условиях преимущественно, предпочтительно точно таких же, как описаны в примере 4. Чистоту указанной композиции определяют как процент площади пика указанной вирусоподобной частицы, содержащейся в указанной композиции, по отношению к общей площади всех пиков на этой же хроматограмме.
Один: При употреблении в данном описании термина «один» или формы единственного числа подразумевается «по меньшей мере один» или «один или более», если не указано иное.
Около: В контексте данной заявки выражение «около» подразумевает значение +/- 4%, обычно и предпочтительно +/- 2%. Например, около 100 должно означать 96-104, обычно и предпочтительно 98-102.
В данном изобретении предложен способ получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, включающий такие этапы: (а) получение олигонуклеотидов, причем указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один участок поли-G; (b) денатурация указанных олигонуклеотидов, причем указанная денатурация включает этап (i) инкубации водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды и хаотропный агент, при температуре I до тех пор, пока средний диаметр указанных олигонуклеотидов не будет составлять 1 нм или менее, при этом предпочтительно указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура I составляет от 75°C до 99°C, и при этом указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину; (c) агрегация указанных олигонуклеотидов, при этом указанная агрегация включает этапы (i) инкубации водного раствора II, содержащего указанные олигонуклеотиды, имеющие указанный средний диаметр 1 нм или меньше, полученные на этапе (b), хаотропный агент и катион, при температуре II до образования указанных агрегированных олигонуклеотидов, при этом указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных образуемых агрегированных олигонуклеотидов не составит 6-16 нм, при этом указанный средний диаметр предпочтительно определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура II составляет от 75°C до 99°C, и при этом указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину; (ii) доведение температуры указанного раствора II до температуры III, причем указанная температура III ниже 40°C, предпочтительно ниже 30°C; при этом указанные этапы предпочтительно проводят в заданном порядке.
В данном изобретении дополнительно предложен способ получения агрегированных олигонуклеотидов, включающий такие этапы: (а) получение олигонуклеотидов, причем указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один участок поли-G; (b) денатурация указанных олигонуклеотидов, причем указанная денатурация включает этап (i) инкубации водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды и хаотропный агент, при температуре I до тех пор, пока средний диаметр указанных олигонуклеотидов не будет составлять 1 нм или менее, при этом предпочтительно указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура I составляет от 75°C до 99°C, и при этом указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину; (c) агрегация указанных олигонуклеотидов, причем указанная агрегация включает этапы (i) инкубации водного раствора II, содержащего указанные олигонуклеотиды, имеющие указанный средний диаметр 1 нм или меньше, полученные на этапе (b), хаотропный агент и катион, при температуре II до образования указанных агрегированных олигонуклеотидов, при этом указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных образуемых агрегированных олигонуклеотидов не составит 6-16 нм, при этом указанный средний диаметр предпочтительно определяют методом динамического рассеяния света (ДРС), и при этом указанная температура II составляет от 75 °С до 99°C, и при этом указанный хаотропный агент предпочтительно представляет собой мочевину; (ii) доведения температуры указанного раствора II до температуры III, причем указанная температура III ниже 40°C, предпочтительно ниже 30°C; при этом указанные этапы предпочтительно проводят в заданном порядке.
В предпочтительном варианте осуществления указанная денатурация указанных олигонуклеотидов включает этап солюбилизации указанных олигонуклеотидов в водном растворе, содержащем указанный хаотропный агент, с образованием указанного водного раствора I, причем указанный водный раствор не содержит одно- или двухвалентных ионов в концентрации более 1 мМ, и при этом предпочтительно указанный водный раствор не содержит одно- или двухвалентных ионов в концентрации более 500 мкМ, предпочтительно не более 250 мкМ, предпочтительно не более 100 мкМ, предпочтительно не более 50 мкМ, предпочтительно не более 10 мкМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная денатурация указанных олигонуклеотидов включает этап солюбилизации указанных олигонуклеотидов в водном растворе, содержащем указанный хаотропный агент, с образованием указанного водного раствора I, причем указанный водный раствор не содержит одно- или двухвалентных ионов в концентрации, которая после добавления олигонуклеотида может вызвать самоагрегацию указанных олигонуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный водный раствор I не содержит одно- или двухвалентных ионов в такой концентрации, при которой происходит самоагрегация указанных олигонуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная денатурация указанных олигонуклеотидов включает этап солюбилизации указанных олигонуклеотидов в водном растворе, содержащем указанный хаотропный агент, с образованием указанного водного раствора I, причем указанный водный раствор не содержит одно- или двухвалентных ионов в концентрации, которая после добавления олигонуклеотида может вызвать спонтанную самоагрегацию указанных олигонуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный водный раствор I не содержит одно- или двухвалентных ионов в такой концентрации, при которой происходит самоагрегация указанных олигонуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная денатурация указанных олигонуклеотидов включает этап солюбилизации указанных олигонуклеотидов и указанного хаотропного агента с образованием указанного водного раствора I и доведения температуры указанного раствора I до температуры I.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, представляет собой мочевину.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная температура I составляет от 75°C до 90°C, предпочтительно от 80°C до 90°C, еще более предпочтительно от 83°C до 87°C, еще более предпочтительно около 85°C и наиболее предпочтительно 85°C.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию указанного олигонуклеотида в указанном растворе I при указанной температуре I проводят в течение 10-120 мин, предпочтительно в течение 20-60 мин, более предпочтительно в течение 20-30 мин и еще более предпочтительно в течение 15-18 мин.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная концентрация указанного хаотропного агента, предпочтительно указанной мочевины, в указанном растворе I составляет от 200 нМ до 5 М, предпочтительно от 500 мМ до 2 М, более предпочтительно от 500 мМ до 1,5 М и еще более предпочтительно 1 М.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная концентрация указанных олигонуклеотидов, предпочтительно указанных олигонуклеотидов с SEQ ID NO:1, в указанном растворе I составляет от 100 мкМ до 1 мМ, предпочтительно от 100 мкМ до 750 мкМ, более предпочтительно от 200 мкМ до 600 мкМ и еще более предпочтительно от 350 мкМ до 500 мкМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию указанных олигонуклеотидов в указанном растворе I при указанной температуре I проводят от 15 до 120 минут, предпочтительно от 15 мин до 60 мин, еще более предпочтительно от 15 мин до 30 мин, еще более предпочтительно от 15 мин до 25 мин.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды содержат в 5’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 3 и максимум 15 молекул гуанозина, предпочтительно по меньшей мере 6 и максимум 13 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 6 и максимум 13 молекул гуанозина, более предпочтительно по меньшей мере 8 и максимум 11 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 8 и максимум 11 молекул гуанозина.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, причем указанная палиндромная последовательность предпочтительно представляет собой GACGATCGTC (SEQ ID NO:2), и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекулами гуанозина, и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5'-конце по меньшей мере 6 и максимум 13 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 6 и максимум 13 молекулами гуанозина, и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5’-конце по меньшей мере 8 и максимум 11 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 8 и максимум 11 молекулами гуанозина.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды содержат от 10 до 1000 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 200 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 20 до 40 нуклеотидов и еще более предпочтительно 30 нуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды содержат последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
(a) G10: GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1);
(b) G10-11: GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:3);
(c) G12-11: GGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:4)
(d) G6: GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO:5);
(e) G7: GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (SEQ ID NO:6);
(f) G8: GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO:7);
(g) G9: GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8);
(h) G11: GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:9)
(i) G6-10: GGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:24);
(j) G7-10: GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:25);
(k) G8-10: GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:26); и
(l) G9-10: GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:27).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления чистота указанных олигонуклеотидов, предпочтительно чистота указанных олигонуклеотидов с SEQ ID NO:1, составляет 90% или более по определению методом ВЭЖХ, предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ или анионообменной ВЭЖХ, более предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления чистота указанных олигонуклеотидов, предпочтительно чистота указанных олигонуклеотидов с SEQ ID NO:1, составляет 92% или более, предпочтительно 94 % или более, более предпочтительно 95 % или более, еще более предпочтительно 97 % или более, еще более предпочтительно 98 % или более, еще более предпочтительно 99 % или более по определению методом ВЭЖХ, предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ или анионообменной ВЭЖХ, более предпочтительно обращенно-фазовой ВЭЖХ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды содержат последовательность SEQ ID NO:1, причем указанные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды состоят из последовательности SEQ ID NO:1.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные олигонуклеотиды состоят из последовательности SEQ ID NO:1, причем указанные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, представляет собой мочевину.
Таким образом, в дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, т. е. в указанном растворе для агрегации, представляет собой мочевину.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная температура II составляет от 75°C до 90°C, предпочтительно от 80°C до 90°C, более предпочтительно от 83°C до 87°C, еще более предпочтительно около 85°C и наиболее предпочтительно 85°C.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная концентрация указанного хаотропного агента, предпочтительно указанной мочевины, в указанном растворе II составляет от 200 нМ до 5 М, предпочтительно от 500 мМ до 2 М, более предпочтительно от 500 мМ до 1,5 М и еще более предпочтительно 1 М.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный катион выбран из Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, Mg2+ и Zn2+.
Указанный катион обычно и предпочтительно получают в виде неорганической соли, и при этом дополнительно указанная неорганическая соль предпочтительно выбрана из хлоридов и сульфатов. Предпочтительно указанные Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ в качестве указанного катиона представлены его хлоридной солью. В альтернативном варианте указанные Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, Mg2+, Zn2+ в качестве указанного катиона представлены его сульфатной солью. дополнительно предпочтительно указанные Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, Mg2+ в качестве указанного катиона представлены его хлоридной солью, при этом указанный Zn2+ в качестве указанного катиона предпочтительно представлен его сульфатной солью.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная концентрация указанного катиона в указанном растворе II составляет от 20 мМ до 2 М, предпочтительно от 50 мМ до 1 М, более предпочтительно от 100 мМ до 500 мМ и еще более предпочтительно 250 мМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, являются одинаковыми.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления концентрация указанного хаотропного агента, содержащегося в указанном растворе I, и указанного хаотропного агента, содержащегося в указанном растворе II, является одинаковой.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, представляют собой мочевину.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная агрегация указанных олигонуклеотидов включает этап (i) солюбилизации указанного хаотропного агента и указанного катиона с образованием водного раствора IIa, (ii) смешивания указанного водного раствора IIa и указанного водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды, имеющие указанный средний диаметр 1 нм или менее, полученные на этапе, (b) с образованием указанного водного раствора II, и (iii) доведения температуры указанного раствора II до температуры II.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления разница температур указанной температуры I и указанной температуры II составляет 5°C или менее, предпочтительно 4°C или менее, еще более предпочтительно 3°C или менее, еще более предпочтительно 2°C или менее, еще более предпочтительно 1°C или менее, и наиболее предпочтительно указанная температура I и указанная температура II равны.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 7-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 8-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 9-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 10-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 11-13 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 11, 12 или 13 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока средний диаметр указанных агрегированных олигонуклеотидов не составит 12 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
Определение среднего диаметра методом динамического рассеяния света (ДРС) в соответствии с данным изобретением, как в случае диаметра указанных олигонуклеотидов в ходе денатурации, так и в случае диаметра указанных агрегированных олигонуклеотидов в ходе агрегации, имеет большое преимущество, поскольку указанное определение можно легко выполнять во время осуществления процесса. Это дополнительно обеспечивает очень высокую точность и очень высокий контроль необходимого размера олигонуклеотидов и агрегированных олигонуклеотидов, соответственно.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную инкубацию проводят до тех пор, пока указанные агрегированные олигонуклеотиды не будут характеризоваться относительным временем начала пика от 80 до 110%, при этом указанное относительное время начала пика определяют методом эксклюзионной ВЭЖХ с капсидом РНК-бактериофага в качестве стандарта.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает этап очистки указанных агрегированных олигонуклеотидов, и при этом предпочтительно указанная очистка включает фильтрацию указанных агрегированных олигонуклеотидов, предпочтительно указанного раствора II, содержащего указанные агрегированные олигонуклеотиды, через 50 нм фильтр.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный 50 нм фильтр представляет собой 50 нм фильтр из ПТФЭ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную фильтрацию указанных агрегированных олигонуклеотидов, предпочтительно указанного раствора II, содержащего указанные агрегированные олигонуклеотиды, через указанный 50 нм фильтр, предпочтительно указанный 50 нм фильтр из ПТФЭ, проводят при 0-20°C.
Указанный дополнительный предпочтительный этап очистки, предпочтительно фильтрации, позволяет удалять любые крупные агрегаты до этапа упаковки в ВПЧ и, таким образом,обычно дополнительно приводит к еще большему повышению чистоты конечного продукта, т. е. ВПЧ по изобретению, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды, обычно примерно на 5%. Таким образом, повышение чистоты обычно связано с уменьшением количества высокомолекулярного материала в конечном продукте, что подтверждается ЭХ ВЭЖХ или ДРС.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный способ не включает этап очистки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды содержат в 5’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 3 и максимум 15 молекул гуанозина, предпочтительно по меньшей мере 6 и максимум 13 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 6 и максимум 13 молекул гуанозина, более предпочтительно по меньшей мере 8 и максимум 11 молекул гуанозина и в 3’-конце - по меньшей мере 8 и максимум 11 молекул гуанозина.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды содержат палиндромную последовательность, причем предпочтительно указанная палиндромная последовательность представляет собой GACGATCGTC (SEQ ID NO:2), и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 3 и максимум 15 молекулами гуанозина, и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5'-конце по меньшей мере 6 и максимум 13 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 6 и максимум 13 молекулами гуанозина, и при этом дополнительно указанная палиндромная последовательность предпочтительно фланкируется в 5’-конце по меньшей мере 8 и максимум 11 молекулами гуанозина, и при этом указанная палиндромная последовательность фланкируется в 3’-конце по меньшей мере 8 и максимум 11 молекулами гуанозина.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды содержат от 10 до 1000 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 200 нуклеотидов, более предпочтительно от 10 до 100 нуклеотидов, еще более предпочтительно от 20 до 40 нуклеотидов и еще более предпочтительно 30 нуклеотидов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды содержат последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:
(a) G10: GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1);
(b) G10-11: GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:3);
(c) G12-11: GGGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:4)
(d) G6: GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO:5);
(e) G7: GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (SEQ ID NO:6);
(f) G8: GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO:7);
(g) G9: GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8);
(h) G11: GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:9)
(i) G6-10: GGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:24);
(j) G7-10: GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:25);
(k) G8-10: GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:26); и
(l) G9-10: GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:27).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1) (G10).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанная композиция нуклеотидов может быть получена способом получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением, при этом предпочтительно указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 8-14 нм, предпочтительно 9-14 нм, более предпочтительно 10-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 11-13 нм, предпочтительно 11, 12 или 13 нм, более предпочтительно 12 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции нуклеотидов по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 10%, т. е. имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции нуклеотидов по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 5%, т. е. имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1) и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция нуклеотидов, содержащая агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 8-14 нм, предпочтительно 9-14 нм, еще более предпочтительно 10-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 11-13 нм, предпочтительно 11, 12 или 13 нм, еще более предпочтительно 12 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции нуклеотидов по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 10%, т. е. имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции нуклеотидов по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 5%, т. е. имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1) и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанный способ включает этапы: (а) получения смеси, причем указанная смесь содержит: (i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага; (ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и (iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем предпочтительно указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС); (b) удаления указанного агента из указанной смеси; и (c) обеспечения возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанный способ включает этапы: (а) получения смеси, причем указанная смесь содержит: (i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага; (ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и (iii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды могут быть получены способом в соответствии с первым аспектом данного изобретения, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем предпочтительно указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС); (b) удаления указанного агента из указанной смеси; и (c) обеспечения возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложен способ получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанный способ включает этапы: (а) получения смеси, причем указанная смесь содержит: (i) белок оболочки указанного РНК-бактериофага; (ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и (iii) композицию нуклеотидов, причем указанная композиция нуклеотидов может быть получена способом получения композиции нуклеотидов, содержащей агрегированные олигонуклеотиды, в соответствии с данным изобретением, и при этом указанная композиция нуклеотидов содержит указанные агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды включают олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере, один участок поли-G, и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16 нм, причем предпочтительно указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС); (b) удаления указанного агента из указанной смеси; и (c) обеспечения возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов.
Во время осуществления указанных способов указанная вирусоподобная частица образуется путем самосборки белка оболочки указанного РНК-бактериофага в присутствии указанных агрегированных олигонуклеотидов.
В предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 8-14 нм, предпочтительно 9-14 нм, более предпочтительно 10-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 11-13 нм, предпочтительно 11, 12 или 13 нм, более предпочтительно 12 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки содержит способные к самосборке рекомбинантные белки РНК-бактериофага или их фрагменты.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки состоит из способных к самосборке рекомбинантных белков РНК-бактериофага или их фрагментов.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный РНК-бактериофаг выбран из группы, состоящей из:
(a) бактериофага Qβ;
(b) бактериофага R17;
(c) бактериофага fr;
(d) бактериофага GA;
(d) бактериофага SP;
(e) бактериофага MS2;
(f) бактериофага M11;
(g) бактериофага MX1;
(h) бактериофага NL95;
(i) бактериофага f2;
(j) бактериофага PP7; и
(k) бактериофага AP205.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный РНК-бактериофаг представляет собой Qβ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
(a) SEQ ID NO:10 (БО Qβ);
(b) смеси SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 (белок A1 Qβ);
(c) SEQ ID NO: 12 (белок оболочки R17);
(d) SEQ ID NO: 13 (белок оболочки fr);
(e) SEQ ID NO:14 (белок оболочки GA);
(f) SEQ ID NO: 15 (белок оболочки SP);
(g) смеси SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16;
(h) SEQ ID NO:17 (белок оболочки MS2);
(i) SEQ ID NO:18 (белок оболочки M11);
(j) SEQ ID NO:19 (белок оболочки MXI);
(k) SEQ ID NO:20 (белок оболочки NL95);
(l) SEQ ID NO:21 (белок оболочки f2);
(m) SEQ ID NO:22 (белок оболочки PP7); и
(n) SEQ ID NO:23 (белок оболочки AP205).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки содержит последовательность SEQ ID NO:10 (БО Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки содержит смесь SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 (белок A1 Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки состоит из последовательности SEQ ID NO:10 (БО Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный белок оболочки состоит из смеси SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 (белок A1 Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления концентрация указанного белка оболочки в указанной смеси составляет от 1 до 4 мг/мл, предпочтительно 2,5 мг/мл.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления концентрация указанных агрегированных олигонуклеотидов в указанной смеси составляет от 25 до 100 мкМ, предпочтительно 62,5 мкМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанное молярное соотношение указанных агрегированных олигонуклеотидов и указанного белка оболочки в указанной смеси составляет от 0,5 до 1,2, предпочтительно 0,7.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный агент содержит денатурирующее соединение, выбранное из мочевины и гидрохлорида гуанидиния.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный агент содержит денатурирующее соединение, причем указанное денатурирующее соединение представляет собой мочевину, и при этом предпочтительно концентрация указанной мочевины в указанной смеси составляет от 0,25 до 7,2 М, предпочтительно 1 М.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный агент дополнительно содержит восстанавливающий агент.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный восстанавливающий агент представляет собой ДТТ, при этом предпочтительно концентрация указанного ДТТ в указанной смеси составляет от 1 до 25 мМ, предпочтительно 2,5 мМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанное удаление указанного агента из указанной смеси проводят путем первой замены буфера первым буфером, причем указанный первый буфер содержит хлорид натрия, и при этом предпочтительно концентрация указанного хлорида натрия в указанном первом буфере составляет от 50 до 350 мМ, предпочтительно 250 мМ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную первую замену буфера осуществляют через мембрану, причем указанная мембрана имеет отсечение по молекулярной массе от 1 до 50 кДа, предпочтительно от 5 до 30 кДа, наиболее предпочтительно 30 кДа.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает этап приведения указанной вирусоподобной частицы в контакт с окислителем, причем указанный окислитель предпочтительно выбран из группы, состоящей из
(а) пероксида водорода, причем концентрация указанного пероксида водорода предпочтительно составляет 0,25-50 мМ, предпочтительно 2 мМ;
(b) кислорода;
(c) глутатиона;
(d) Cu2+; и
(e) Fe3+.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный кислород в качестве окислителя может представлять собой стерильный отфильтрованный воздух, обычно и предпочтительно стерильный отфильтрованный воздух из окружающей среды.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает стадию очистки указанной вирусоподобной частицы, и при этом указанная очистка включает вторую замену буфера вторым буфером, причем указанный второй буфер представляет собой фармацевтически приемлемый буфер.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную вторую замену буфера осуществляют, используя мембрану, причем указанная мембрана имеет отсечение по молекулярной массе от 50 до 1000 кДа.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанную вторую замену буфера осуществляют, используя мембрану, причем указанная мембрана имеет отсечение по молекулярной массе от 100 до 300 кДа.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная чистота указанной композиции составляет по меньшей мере 99,5%, предпочтительно по меньшей мере 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере 99,7%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99,8% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,9% по определению методом эксклюзионной хроматографии.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанная композиция может быть получена способом получения композиции, содержащей (i) вирусоподобную частицу, причем указанная вирусоподобная частица представляет собой вирусоподобную частицу РНК-бактериофага, и (ii) агрегированные олигонуклеотиды в соответствии с данным изобретением.
В другом дополнительном аспекте в данном изобретении предложена композиция, содержащая (i) вирусоподобную частицу РНК-бактериофага и (ii) агрегированные олигонуклеотиды, причем указанные агрегированные олигонуклеотиды упакованы в указанную вирусоподобную частицу, при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанный РНК-бактериофаг представляет собой бактериофаг Qβ.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная вирусоподобная частица РНК-бактериофага Qβ состоит из белков оболочки, содержащих последовательность SEQ ID NO:10 (БО Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная вирусоподобная частица РНК-бактериофага Qβ состоит из белков оболочки, содержащих смесь SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 (белок A1 Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная вирусоподобная частица РНК-бактериофага Qβ состоит из белков оболочки, состоящих из последовательности SEQ ID NO:10 (БО Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанная вирусоподобная частица РНК-бактериофага Qβ состоит из белков оболочки, состоящих из смеси SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11 (белок A1 Qβ).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты G10 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:1) и при этом указанные агрегированные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления чистота указанной композиции составляет по меньшей мере 99,5%, предпочтительно по меньшей мере 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере 99,7%, еще более предпочтительно по меньшей мере 99,8% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,9% по определению методом эксклюзионной хроматографии.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 6-16, предпочтительно 7-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 8-14 нм, предпочтительно 9-14 нм, более предпочтительно 10-14 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанные агрегированные олигонуклеотиды имеют средний диаметр 11-13 нм, предпочтительно 11, 12 или 13 нм, более предпочтительно 12 нм, причем указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 10%, т. е. имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления указанной композиции по меньшей мере 65%, предпочтительно по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов имеют диаметр 12 нм ± 5%, т. е. имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
ПРИМЕРЫ
Примеры предназначены для иллюстрации данного изобретения, но не его ограничения. В примерах, описанных ниже, если не указано иное, все значения температуры приведены в градусах Цельсия (°C). Реагенты были приобретены у коммерческих поставщиков, таких как Sigma Aldrich, Boston Bioproducts, Invitrogen, Alfa Aesar и т. п., и использовались без дополнительной очистки, если не указано иное. Воду, используемую в описанных реакциях, очищали или обрабатывали, чтобы удалить все примеси и соли.Удаление неорганических ионных примесей подтверждают измерением проводимости воды. Вода, используемая в контексте данной заявки, имеет удельное сопротивление, обычно и предпочтительно составляющее по меньшей мере 18 МОм⋅см при 25°C. Это гарантирует, что остаточные неорганические примеси, такие как соли, составляют менее 1 части на миллиард.
Чистоту олигонуклеотидов, в частности олигонуклеотида G10 с SEQ ID NO:1, определяли с помощью ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ИП-ОФ-ВЭЖХ) или с помощью анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. (АО-ВЭЖХ).
ИП-ОФ-ВЭЖХ проводили, используя колонку Waters Xbridge BEH C18 4,6 x 75 мм, 2,5 мкм, при температуре колонки 70 ± 2°C, скорости потока 0,4 мл/мин, длине волны 260 нм, объеме ввода 5 мкл и времени прогона 40 минут.
АО-ВЭЖХ проводили, используя колонку Dionex DNAPac PA200 4,0 x 250 мм, изделие № 063000, при температуре колонки 30 ± 2°C, скорости потока 1,0 мл/мин, длине волны 260 нм, объеме ввода 20 мкл и времени прогона 45 минут.
ИП-ОФ-ВЭЖХ // G10: образцы вводят в ион-парную колонку с олигонуклеотидами, а элюирование проводят, используя комбинированный градиент воды и ацетонитрила, модифицированного ТЭА и ГФИП, в качестве ион-парного буфера с обнаружением на 260 нм. Полученный в результате пик олигонуклеотида G10 интегрируется отдельно от остальных пиков, состоящих из субпопуляций олигонуклеотида G10, таких как G10+1n, G10-1n, G10-2n, G10-3n, >G10+1n и <G10-3n (где n = дезоксинуклеотид).
АО-ВЭЖХ // G10: образцы вводят в сильную анионообменную колонку и анализируют в денатурирующих условиях (pH ≥10). Элюирование проводят, используя комбинированный градиент соли и метанола с обнаружением на 260 нм. Полученный пик олигонуклеотида G10 интегрируется отдельно от остальных пиков, состоящих из субпопуляций олигонуклеотида G10, таких как G10+1n, G10-1n, G10-2n, G10-3n, >G10+1n и <G10-3n (где n = дезоксинуклеотид).
ПРИМЕР 1
Денатурация и агрегация олигонуклеотида G10 (SEQ ID NO:1)
Количественное определение G10: Количественное определение олигонуклеотида G10 (SEQ ID NO:1) проводили по УФ-поглощению на 260 нм с поправкой на поглощение на 340 нм, где 1 A260-340 соответствует концентрации 27,8 мкг/мл на длине пути 1 см.
Денатурация: (шкала 10,0 мл, 500 мкМ G10 с чистотой около 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ (в данном разделе примеров он называется олигонуклеотидом G10 высокой чистоты), 1 М мочевина, 85°C, 20 мин): 70,6 мг G10 отвешивали в 15 мл пробирку. Порошок растворяли в 10,0 мл очищенной воды (с удельным сопротивлением при 25°C 18,2 МОм⋅см), содержащей 1 М мочевину (c = 500 мкм; объемное содержание порошка было определено до разведения для проведения спектрометрических исследований). Смесь дезагрегировали в течение 20 минут при 85°C на водяной бане. Отбирали аликвоты, немедленно охлаждали на бане лед/вода до 0°C, вынимали из ледяной бани и оставляли естественным образом нагреться до комнатной температуры, а измерения методом ДРС и, необязательно, эксклюзионной ВЭЖХ (ЭХ) проводили, как описано в примере 3 и примере 4. Оставшуюся часть образца держали при 85°C и проводили этап агрегации.
На Фиг.1А проиллюстрировано ДРС денатурированного олигонуклеотида G10 высокой чистоты, полученного способом по изобретению, в виде одного пика. Измеренный средний диаметр олигонуклеотида G10, составляющий 0,90 нм, показывает, что денатурация завершена и получены мономеры. Этот полностью денатурированный олигонуклеотид G10 гарантирует и обеспечивает образование хорошо контролируемых и определенных по размеру агрегированных олигонуклеотидов G10 в необходимом диапазоне в соответствии с данным изобретением, как описано ниже.
Агрегация (шкала 20,0 мл, 250 мкМ G10, денатурированный, как описано выше, 250 мМ Na+Cl-, 20 мМ фосфат натрия (pH = 7,2), 1 М мочевина, 85°C, 8-30 мин): 10 мл денатурированного 500 мкМ раствора G10 при 85°C, указанного выше, смешивали с 10 мл раствором 500 мМ NaCl, 40 мМ фосфата натрия и 1 М мочевины при 85°C в 25 мл пробирке. Смесь инкубировали 15 минут при 85°C на водяной бане. Раствор охлаждали на бане лед/вода до 0°C. Из него отбирали аликвоты, оставляли нагреться до комнатной температуры и проводили измерения методом ДРС и, необязательно, эксклюзионной ВЭЖХ (ЭХ). Растворы агрегированных олигонуклеотидов обычно и предпочтительно используются в течение 3 часов при хранении при <20°C.
Последний этап фильтрации можно использовать для удаления возможных следовых (<1%) крупных частиц. Его проводят путем пропускания предварительно охлажденного раствора агрегированных олигонуклеотидов при комнатной температуре через 50 нм фильтр.
На Фиг. 1B проиллюстрировано ДРС агрегированных впоследствии олигонуклеотидов G10, полученных способом по изобретению. Особенно предпочтительные полученные агрегированные олигонуклеотиды G10 демонстрируют надлежащую агрегацию и средний диаметр 12 нм. Эти хорошо контролируемые и определенные по размеру в необходимом предпочтительном диапазоне агрегированные олигонуклеотиды G10 в соответствии с данным изобретением позволят получить упакованные и хорошо сформированные ВПЧ очень высокой чистоты, как описано ниже.
Денатурацию и агрегацию особенно предпочтительного олигонуклеотида G10 (SEQ ID NO:1) дополнительно проводили при различных концентрациях олигонуклеотидов, при этом получали практически такое же ДРС, как проиллюстрировано на Фиг. 1А и Фиг. 1B. Таким образом, денатурацию осуществляли, используя различные концентрации олигонуклеотида G10 от 100 мкМ до 1 мМ. В целях удобства последующий этап агрегации проводили при концентрации, составляющей ровно половину той концентрации, которую использовали при денатурации, после смешивания 1:1 двух растворов, описанных в данном документе.
ПРИМЕР 2
Денатурация и агрегация олигонуклеотидов G10-11, G12-11, G6, G7, G8, G9, G11, G6-10, G7-10, G8-10 и G9-10 (SEQ ID NO: 3-9, 24-27)
Денатурация: 500 мкМ раствор олигонуклеотида G10-11 (SEQ ID NO:3), G12-11 (SEQ ID NO:4), G6 (SEQ ID NO:5), G7 (SEQ ID NO:6), G8 (SEQ ID NO:7), G9 (SEQ ID NO:8), G11 (SEQ ID NO:9), G6-10 (SEQ ID NO:24), G7-10 (SEQ ID NO:25), G8-10 (SEQ ID NO:26) или G9-10 (SEQ ID NO:27) в 1 М мочевине дезагрегировали в течение 20 минут при 85 °C на водяной бане.
Агрегация: (шкала 10,0 мл, 250 мкМ G10, 250 мМ Na+, 20 мМ фосфат натрия, 1 М мочевина, 85°C, 8-30 мин): 5 мл денатурированного раствора олигонуклеотидов G10-11 (SEQ ID NO:3), G12-11 (SEQ ID NO:4), G6 (SEQ ID NO:5), G7 (SEQ ID NO:6), G8 (SEQ ID NO:7), G9 (SEQ ID NO:8), G11 (SEQ ID NO:9), G6-10 (SEQ ID NO:24), G7-10 (SEQ ID NO:25), G8-10 (SEQ ID NO:26) или G9-10 (SEQ ID NO:27) при 85°C, 5 мл 500 мМ Na+, 40 мМ фосфата натрия и 1M мочевины при 85 °C смешивали в 15 мл пробирке (250 мкМ олигонуклеотид, 1 М мочевина, 20 мМ фосфат натрия, 250 мМ Na+). Смесь инкубировали 15 минут при 85°C на водяной бане. Раствор охлаждали на бане лед/вода до 0°C. Из него отбирали аликвоты, оставляли нагреться до комнатной температуры и проводили измерения методом ДРС и, необязательно, эксклюзионной ВЭЖХ (ЭХ). Растворы агрегированных олигонуклеотидов обычно и предпочтительно используются в течение 3 часов при хранении при <20°C.
Продукты процессов агрегации анализировали методом динамического рассеяния света (ДРС), описанным в примере 3, и методом эксклюзионной ВЭЖХ, описанным в примере 4. ДРС агрегированных олигонуклеотидов выявило, что средний диаметр всех агрегированных олигонуклеотидов находился в пределах 11-13 нм по определению методом динамического рассеяния света (ДРС), и в пределах 80% - 110% ВНП по определению методом эксклюзионной ВЭЖХ.
ПРИМЕР 3
Анализ агрегации олигонуклеотида G10 методом динамического рассеяния света
Размер частиц олигонуклеотидов, агрегированных олигонуклеотидов и ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды, в соответствии с данным изобретением, определяли, используя метод динамического рассеяния света (ДРС). Настройки прибора, используемые в представленных примерах и являющиеся предпочтительными для определения размера частиц олигонуклеотидов, агрегированных олигонуклеотидов и ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды, в соответствии с данным изобретением, представлены ниже.
Прибор: Malvern Zetasizer Nano ZS
Источник света: He-Ne лазер (633 нм при 4 мВт (максимум))
В среднем столбце Таблицы 1 представлены настройки, применяемые для референсного стандарта (полистироловые микросферы) и для калибровки, которые подтвердили, что прибор работает надлежащим образом. В правом столбце представлены настройки, применяемые в способе, используемом для наших анализа и измерений олигонуклеотидов, агрегированных олигонуклеотидов и ВПЧ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды.
Таблица 1: Настройки прибора для стандартных композиций и композиций по изобретению
полистироловые микросферы
Программное обеспечение ДРС позволяет рассчитывать средние значения гидродинамического радиуса, а средний диаметр частиц определяют путем простого умножения. 2 x средний радиус частицы = диаметр частицы. Для единообразия далее в тексте данного изобретения размер частиц указан и используется в виде среднего диаметра, измеренного в нанометрах (Dгид).
ПРИМЕР 4
Анализ агрегации олигонуклеотида G10 методом эксклюзионной ВЭЖХ
Агрегированное состояние агрегированных олигонуклеотидов G10 анализировали в целом, как описано в WO 2007/144150, методом аналитической эксклюзионной ВЭЖХ, используя следующие условия:
Колонка: TSKgel 5000 PWXL 7,8 мм * 30,0 см (партия: 5PWX06GNMH3304, изделие: 08023, Tosoh Bioscience)
Элюент: ФСБ (150 мМ NaCl в 20 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,2)
Объем вводы: 40,0 мкл (предпочтительно с концентрацией от около 20 мкМ до около 500 мкМ)
Скорость потока: 0,8 мл/мин
Градиент: Изократический
Время работы: 20 мин
Длина волны: 215, 260 и 280 нм, оценка данных на 260 нм
Температура термостата колонки: 25°С
Температура автосэмплера: 8°C
Капсид бактериофага Qβ использовали в качестве стандарта.
Пиковое время начала X% G10 относительно капсида Qβ (относительное время начала пика Qβ) рассчитывали следующим образом: X% = время начала пика [мин] олигонуклеотида, деленное на время удержания стандарта капсида Qβ [мин] x 100%, где время начала пика олигонуклеотида определяли как время, когда элюирование олигонуклеотида становилось возможно обнаружить, а время удержания стандарта капсида Qβ определяли как время появления максимального пика стандарта. Пример профиля элюирования олигонуклеотида G10 и капсида бактериофага Qβ в качестве стандарта приведен на Фиг. 1 в WO2007/144150. На основании хроматограмм, приведенных на Фиг. 1 в WO2007/144150, рассчитанное относительное время начала пика для агрегированного олигонуклеотида составило 88%.
ПРИМЕР 5
Сравнение денатурированных олигонуклеотидов G10, полученных способом по изобретению и способами предшествующего уровня техники
Олигонуклеотиды G10 с SEQ ID NO:1 с двумя различными значениями частоты (79% и 94% по определению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ; называемые в этом разделе примеров олигонуклеотидами G10 низкой и высокой чистоты) подвергали дезагрегации (денатурации), как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150). Тот же олигонуклеотид G10 высокой чистоты (94%) подвергали денатурации, как описано в примере 1 в данном документе. Примеси в используемом олигонуклеотиде G10 в основном представляют собой «неудачные последовательности», т. е. олигонуклеотидные последовательности с меньшим числом остатков G, например, 26-меры, 27-меры, 28-меры и 29-меры.
Полученные продукты анализировали методом ДРС, как описано в примере 3, и они проиллюстрированы на Фиг. 2A (G10 низкой чистоты, способ предшествующего уровня техники), Фиг. 2B (G10 высокой чистоты, способ предшествующего уровня техники) и Фиг. 2C (G10 высокой чистоты, способ по изобретению). Мономер полностью денатурированного олигонуклеотида G10 имеет средний гидродинамический диаметр приблизительно 1 нм.
G10 низкой чистоты, подвергнутый процессу денатурации предшествующего уровня техники, дал частицы со средним диаметром 2,2 нм, что указывает на наличие вторичных структур и на то, что не весь олигонуклеотид G10 был полностью денатурирован до мономера (Фиг. 2A). G10 высокой чистоты, подвергнутый процессу денатурации предшествующего уровня техники, дал частицы со средним диаметром 2,8 нм, что указывает на наличие вторичных структур и на то, что не весь олигонуклеотид G10 был полностью денатурирован до мономера (Фиг. 2B). Как будет обсуждаться в примере 6, эта неполная денатурация приведет к получению более вариабельных и, помимо этого, более крупных агрегированных олигонуклеотидов.
G10 высокой чистоты, подвергнутый денатурации способом по изобретению, привел к получению частиц со средним диаметром 0,9 нм, что указывает на то, что олигонуклеотид G10 был полностью или практически полностью денатурирован до мономера (Фиг. 2C). Как указано, этот полностью денатурированный олигонуклеотид G10 гарантирует и обеспечивает образование хорошо контролируемых и определенных по размеру агрегированных олигонуклеотидов G10 в необходимом диапазоне в соответствии с данным изобретением.
Правильная денатурация олигонуклеотидов, такая как проиллюстрирована для особенно предпочтительного олигонуклеотида G10, приводящая к полной или по меньшей мере практически полной денатурации и к получению мономеров перед началом этапа агрегации, является весьма предпочтительной и важной. При наличии вторичных структур, димеров, тримеров или квадруплексов олигонуклеотидов, этап агрегации будет более вариабельным, а конечные агрегированные олигонуклеотиды будут крупнее и будут иметь более широкое распределение по размеру.
ПРИМЕР 6
Сравнение агрегированных олигонуклеотидов G10, полученных способом по изобретению и способами предшествующего уровня техники
Материалы G10, полученные в результате экспериментов по денатурации, описанных в примере 5, подвергали агрегации, как описано в предшествующем уровне техники (WO2007/144150) или как описано в процессе по изобретению и как описано в примере 1 выше.
Полученные агрегированные олигонуклеотиды анализировали методом ДРС, как описано в примере 3 в данном документе, и они проиллюстрированы на Фиг. 3A (агрегация согласно предшествующему уровню техники G10 низкой чистоты, денатурированного способом предшествующего уровня техники), Фиг. 3B (агрегация согласно предшествующему уровню техники G10 высокой чистоты, денатурированного способом предшествующего уровня техники) и Фиг. 3C (агрегация по изобретению G10 высокой чистоты, денатурированного способом по изобретению).
Материал низкой чистоты, денатурированный и агрегированный способом предшествующего уровня техники, привел к получению агрегированных олигонуклеотидов, которые не только находятся в верхней части необходимого диапазона среднего диаметра (6-16 нм), но, кроме того, 10% материала имеет слишком крупный размер (30-40 нм) для последующей надлежащей упаковки в ВПЧ РНК-бактериофагов, предпочтительно РНК-бактериофагов Qβ (Фиг. 3А). В результате этого большего и широкого распределения частиц конечные упакованные ВПЧ будут менее чистыми по данным ЭХ и ДРС, а на электронных микрофотографиях будут наблюдаться стержнеподобные структуры (смотрите пример 8 ниже). Следует отметить, что указанные стержнеподобные структуры обычно нельзя отделить путем очистки фильтрованием, и требуется более дорогостоящая и интенсивная очистка с помощью хроматографии, что очень невыгодно для производства в крупных масштабах и, в частности, для производства НПП.
Материал высокой чистоты, денатурированный и агрегированный способом предшествующего уровня техники, привел к получению агрегированных олигонуклеотидов, которые все были слишком крупными для упаковки в ВПЧ РНК-бактериофагов, предпочтительно РНК-бактериофагов Qβ, и, следовательно, приведет к получению нестабильных ВПЧ (Фиг. 3B). Дополнительно определяется второй пик на ~ 100 нм. Стоит отметить, что оптимизацию способа предшествующего уровня техники с использованием материала высокой чистоты путем уменьшения времени агрегации не проводили из-за того, что в этом случае необходимые времена нагрева и охлаждения были бы меньше, чем те, которые можно было бы легко контролировать в лабораторном или в производственном масштабе. Фактически, представленные способы по изобретению могут преодолеть указанный недостаток способов предшествующего уровня техники.
Таким образом и в отличие от предшествующего уровня техники, материал высокой чистоты, денатурированный и агрегированный способом по изобретению, привел к получению агрегированных олигонуклеотидов, имеющих средний диаметр 12 нм, что указывает на надлежащую агрегацию (Фиг. 3B). Эти хорошо контролируемые и определенные по размеру агрегированные олигонуклеотиды G10 в необходимом особенно предпочтительном диапазоне в соответствии с данным изобретением будут приводить к получению имеющих очень высокую чистоту и хорошо сформированных упакованных ВПЧ.
Надлежащая агрегация олигонуклеотидов, такая как проиллюстрирована для особенно предпочтительного олигонуклеотида G10, приводящая к полному или по меньшей мере практически полному определенному в узком диапазоне распределению диаметров по размеру, является еще более предпочтительной и важной. Контроль агрегации, приводящий к получению агрегированных олигонуклеотидов со средним диаметром 11-13 нм, предпочтительно со средним диаметром 12 нм по определению методом ДРС, как описано в примере 3, гарантирует и обеспечивает получение упакованных ВПЧ высокой чистоты.
Если агрегированные олигонуклеотиды слишком крупные, полученный материал после этапа упаковки будет иметь большое количество примесей, как показывает ДРС, и деформированные ВПЧ, такие как стержнеподобные структуры, как показывают электронные микрофотографии. Если агрегированные олигонуклеотиды очень большие, > 50 нм, это может привести к образованию нестабильных ВПЧ.
ПРИМЕР 7
Упаковка ВПЧ Qβ агрегированными олигонуклеотидами G10 путем разборки/повторной сборки
Разборка ВПЧ Qβ: 45 мг ВПЧ Qβ (2,5 мг/мл по определению в анализе Брэдфорда) в ФСБ (20 мМ фосфат, 150 мМ NaCl, pH 7,5) восстанавливали 10 мМ ДТТ в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании. Затем добавляли хлорид магния до конечной концентрации 0,7 М и продолжали инкубацию в течение 15 мин при комнатной температуре при перемешивании, что приводило к осаждению инкапсулированной РНК клетки-хозяина и одновременной дезинтеграции ВПЧ. Раствор центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин при 4°C (Eppendorf 5810 R, ротор A-4-62 с фиксированным углом, используемый на всех следующих этапах), чтобы удалить осажденную РНК из раствора. Супернатант, содержащий высвобожденный димерный белок оболочки Qβ, использовали для этапов хроматографической очистки.
В альтернативном и предпочтительном способе разборку капсида Q-бета на димеры Q-бета осуществляли путем добавления 1 М ДТТ до конечной концентрации 10 мМ ДТТ. Нуклеиновую кислоту и белки клетки-хозяина осаждали, увеличивая концентрацию NaCl до 600 мМ и доводя рН до 2,6 добавлением 1 М фосфата натрия, 0,75 М лимонной кислоты. Осажденные нуклеиновые кислоты и БКХ (белки клетки-хозяина) удаляли с помощью ТПФ (тангенциальной поточной фильтрации), используя систему Sartoflow Beta Crossflow, оснащенную 2 x 0,5 м2 мембранами Millipore Biomax 300, со следующими рабочими параметрами: Pподача = 0,9, Pретентат = 0,4 бар и Pпермеат = 0,2 бар с получением ТМД 0,45 бар. Материал подвергали диафильтрации против 3 ОД 20 мМ фосфата натрия, 20 мМ лимонной кислоты, 300 мМ хлорида натрия, pH 3,3.
Очистка белка оболочки Qβ методом катионообменной хроматографии и эксклюзионной хроматографии: супернатант реакции разборки, содержащий димерный белок оболочки, белки клетки-хозяина и остаточную РНК клетки-хозяина, загружали в колонку SP-Sepharose FF (xk16/20, 6 мл, Amersham Bioscience). Колонку уравновешивали 20 мМ натрий-фосфатным буфером, pH 7, а образец разводили водой 1:15, чтобы отрегулировать проводимость ниже 10 мСм/см для обеспечения надлежащего связывания белка оболочки с колонкой. Элюирование связанного белка оболочки осуществляли ступенчатым градиентом до 20 мМ фосфата натрия/500 мМ хлорида натрия, и собирали белок в дольном объеме приблизительно 25 мл. Хроматографию проводили при комнатной температуре со скоростью потока 5 мл/мин на всех этапах, а поглощение регистрировали на 260 нм и 280 нм. На втором этапе выделенный белок оболочки Qβ (элюированная фракция из катионообменной колонки) загружали в колонку Sephacryl S-100 HR (xk26/60, 320 мл, Amersham Bioscience), уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия/250 мМ хлоридом натрия; pH 7,2. Хроматографию проводили при комнатной температуре со скоростью потока 2,5 мл/мин, а поглощение регистрировали на 260 нм и 280 нм. Собирали по 5 мл фракций.
Определение характеристик очищенного белка оболочки Qβ методом аналитической эксклюзионной хроматографии. Образец очищенного белка оболочки Qβ анализировали методом аналитической эксклюзионной хроматографии (Фиг. 4C) и сравнивали с i) интактными ВПЧ Qβ (Фиг. 4A), которые выделяли из лизата E.coli и использовали в качестве исходного материала для процедуры очистки, и ii) супернатантом реакции разборки (Фиг. 4B). На эффективное отделение молекул РНК от белка оболочки указывает отсутствие какого-либо РНК-подобного пика (типичное соотношение A280/A260 = 0,5) на Фиг. 4C и наличие однозначного белкового пика (типичное соотношение A280/A260 = 1,7).
В альтернативном и предпочтительном способе очистку белка оболочки Qβ осуществляли с помощью катионообменной хроматографии и мембраны Mustang Q: КО-хроматографию проводили в качестве этапа захвата димера Q-бета. Колонку BPG140 заполняли смолой SP Sepharose FF, используя систему AKTA Ready Chromatography и 150 мМ NaCl в качестве заполняющего буфера. Высота слоя заполненной колонки составляла 14,0 см, что эквивалентно объему слоя 2,2 л. Анализ ВЭТТ дал коэффициент асимметрии 1,55 и число теоретических тарелок 2560 на метр. Диафильтрат с этапа разборки перед загрузкой фильтровали через капсулу Millipore Opticap XL 5. Хроматографию проводили, используя метод, приведенный в Таблице 2.
Таблица 2: Метод катионообменной хроматографии
Фильтрацию через капсулу Mustang Q проводили для уменьшения количества эндотоксинов и любых остаточных нуклеиновых кислот. Пул КО первоначально фильтровали, используя 0,2 мкм фильтр Millipak 60 (номер в каталоге № MPGL06GH2), перед фильтрацией через фильтр Mustang Q при скорости потока 200 мл/мин. Проточный материал, собранный с фильтра Mustang Q, затем пропускали через второй 0,2 мкм фильтр Millipak 60.
Сборка QβG10 диафильтрацией: очищенный белок оболочки (в 20 мМ фосфате натрия, pH 7,2, 250 мМ NaCl) смешивали с водой и исходными растворами мочевины, NaCl, ДТТ и агрегированных олигонуклеотидов G10 (приготовленных, как описано в примере 1). Объем смеси составлял 50 мл, а конечные концентрации компонентов составляли 1 мг/мл белка оболочки, 1,0 М мочевины, 250 мМ NaCl, 2,5 мМ ДТТ и 0,24 мг/мл G10. Затем раствор подвергали диафильтрации при комнатной температуре против 300 мл 20 мМ фосфата натрия, 250 мМ NaCl, pH 7,2, используя картридж с отсечением 30 кДа (Pellicon XL, Millipore), скорость поперечного потока 10 мл/мин и скорость объемного потока 2,5 мл/мин. Добавляли H2O2 до конечной концентрации 7 мМ и инкубировали раствор в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы индуцировать образование дисульфидных связей. Затем раствор подвергали диафильтрации против 500 мл 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,2, используя картридж с отсечением 300 кДа (Pellicon XL, Millipore), скорость поперечного потока 10 мл/мин и скорость объемного потока 2,5 мл/мин, чтобы удалить избыток H2O2 и неупакованные олигонуклеотиды G10 из прошедшего сборку продукта QβG10.
В альтернативном варианте упаковку ВПЧ Qβ агрегированными олигонуклеотидами G10, полученными в соответствии с данным изобретением, также можно дополнительно проводить, как описано в примере 10 в WO2007/144150.
ПРИМЕР 8
Сравнение ВПЧ Qβ, в которые упакованы агрегированные олигонуклеотиды G10, полученных способами данного изобретения и предшествующего уровня техники - ДРС и ЭM
ВПЧ Qβ получали аналогично примеру 7, описанному выше, используя не только агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные, как описано в примере 1, но также используя агрегированные олигонуклеотиды G10, полученные способами предшествующего уровня техники, как описано в примере 6 выше.
Агрегированные олигонуклеотиды, проиллюстрированные на Фиг. 3A, которые были получены способом агрегации G10 низкой чистоты предшествующего уровня техники, денатурированного способом предшествующего уровня техники, и имеющие широкое распределение по размерам, причем 10% из них оказались слишком крупными для упаковки на этапе упаковки, приводили к получению ВПЧ, характеризующихся ДРС, приведенным на Фиг. 5A, и ЭM, приведенной на Фиг. 5B. ДРС выявило наличие основного пика (96%) со средним диаметром 28 нм, соответствующим правильно сформированным ВПЧ (30 нм ± 2 нм), но также наблюдались дополнительные пики крупных частиц. Соответствующая ЭМ демонстрирует сферические ВПЧ с указанным средним диаметром, а также стержнеподобные структуры, намного крупнее необходимых 30 нм ВПЧ.
В противоположность этому, материал высокой чистоты, денатурированный и агрегированный способом по данному изобретению, после этапа упаковки приводил к получению упакованных ВПЧ с одним средним диаметром и полностью сформированными ВПЧ. ДРС демонстрирует единственный пик на 30 нм и отсутствие крупных частиц (Фиг. 5C), а ЭM демонстрирует лишь сферические ВПЧ без стержнеподобных структур (Фиг. 5D).
ПРИМЕР 9
Этап денатурации способа по изобретению, проводимый с изменяемыми параметрами.
Денатурацию олигонуклеотида G10 (SEQ ID NO:1), описанную в примере 1, исследовали, варьируя концентрацию мочевины, время денатурации и температуру, применяемую для указанной денатурации. Основной раствор олигонуклеотида G10 получали путем растворения G10 (высокая чистота в 94%) в воде до концентрации 1 мМ. Растворы мочевины добавляли для получения конечных денатурирующих растворов 500 мкМ G10 с концентрациями мочевины от 0,1 М до 1 М. Затем аликвоты этих образцов инкубировали в диапазоне температур от 25°C до 85°C в течение 20 или 60 минут. Образцы немедленно охлаждали на бане лед/вода до 0°C, вынимали из ледяной бани, оставляли естественным образом нагреться до комнатной температуры и проводили измерения ДРС, как описано в примере 3. В Таблице 3 показано, что успешной денатурации, т. е. среднего диаметра 1 нм или меньше, можно достичь независимо от концентрации мочевины от 0,2 М до 1,0 М.
Таблица 3: Влияние концентрации мочевины и температуры на денатурацию олигонуклеотида G10
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Checkmate Pharmaceuticals
<120> УПАКОВКА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ
<130> P5429PC00
<150> US 62/654,586
<151> 2018-04-09
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 1
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg
30
<210> 2
<211> 10
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 2
gacgatcgtc
10
<210> 3
<211> 31
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 3
gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg g
31
<210> 4
<211> 33
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 4
gggggggggg gggacgatcg tcgggggggg ggg
33
<210> 5
<211> 22
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 5
gggggggacg atcgtcgggg gg
22
<210> 6
<211> 24
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 6
ggggggggac gatcgtcggg gggg
24
<210> 7
<211> 26
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 7
ggggggggga cgatcgtcgg gggggg
26
<210> 8
<211> 28
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 8
gggggggggg acgatcgtcg gggggggg
28
<210> 9
<211> 32
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> химически синтезированная
<400> 9
gggggggggg ggacgatcgt cggggggggg gg
32
<210> 10
<211> 132
<212> Белок
<213> бактериофаг Qb
<400> 10
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
85 90 95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210> 11
<211> 329
<212> Белок
<213> бактериофаг Qb
<400> 11
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1 5 10 15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145 150 155 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
165 170 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
180 185 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
195 200 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
210 215 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
245 250 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
260 265 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
275 280 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
290 295 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305 310 315 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
325
<210> 12
<211> 129
<212> Белок
<213> бактериофаг R17
<400> 12
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
115 120 125
Tyr
<210> 13
<211> 130
<212> Белок
<213> бактериофаг fr
<400> 13
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
100 105 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125
Ile Tyr
130
<210> 14
<211> 130
<212> Белок
<213> бактериофаг GA
<400> 14
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
35 40 45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
50 55 60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65 70 75 80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
100 105 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
115 120 125
Tyr Ala
130
<210> 15
<211> 132
<212> Белок
<213> бактериофаг SP
<400> 15
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1 5 10 15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr
130
<210> 16
<211> 329
<212> Белок
<213> бактериофаг SP
<400> 16
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1 5 10 15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
20 25 30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
35 40 45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
50 55 60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65 70 75 80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
85 90 95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
100 105 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
115 120 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
130 135 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145 150 155 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
165 170 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
180 185 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
195 200 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
210 215 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225 230 235 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
245 250 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
260 265 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
325
<210> 17
<211> 130
<212> Белок
<213> бактериофаг MS2
<400> 17
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1 5 10 15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
20 25 30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
35 40 45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
50 55 60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65 70 75 80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
85 90 95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
100 105 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
115 120 125
Ile Tyr
130
<210> 18
<211> 133
<212> Белок
<213> бактериофаг M11
<400> 18
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1 5 10 15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
130
<210> 19
<211> 133
<212> Белок
<213> бактериофаг MX1
<400> 19
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1 5 10 15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65 70 75 80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
100 105 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
115 120 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
130
<210> 20
<211> 330
<212> Белок
<213> бактериофаг NL95
<400> 20
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1 5 10 15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
35 40 45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
50 55 60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65 70 75 80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
85 90 95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
100 105 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
115 120 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
130 135 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145 150 155 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
165 170 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
180 185 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
195 200 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
210 215 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225 230 235 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
245 250 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
260 265 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
290 295 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305 310 315 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
325 330
<210> 21
<211> 129
<212> Белок
<213> бактериофаг f2
<400> 21
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1 5 10 15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
35 40 45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
50 55 60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65 70 75 80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
85 90 95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
100 105 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
115 120 125
Tyr
<210> 22
<211> 128
<212> Белок
<213> бактериофаг PP7
<400> 22
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
20 25 30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
50 55 60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65 70 75 80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
85 90 95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
100 105 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
115 120 125
<210> 23
<211> 131
<212> Белок
<213> бактериофаг AP205
<400> 23
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
35 40 45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
50 55 60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65 70 75 80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
85 90 95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
100 105 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
115 120 125
Thr Thr Ala
130
<210> 24
<211> 26
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> G6-10
<400> 24
gggggggacg atcgtcgggg gggggg
26
<210> 25
<211> 27
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> G7-10
<400> 25
ggggggggac gatcgtcggg ggggggg
27
<210> 26
<211> 28
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> G8-10
<400> 26
ggggggggga cgatcgtcgg gggggggg
28
<210> 27
<211> 29
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> G9-10
<400> 27
gggggggggg acgatcgtcg ggggggggg
29
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| УЛУЧШЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ ПЕПТИДА L2 ВПЧ | 2017 |
|
RU2743016C2 |
| МУЛЬТИМЕРИЗУЮЩИЕСЯ ПОЛИПЕПТИДЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ОТ ДОМЕНА С УКЛАДКОЙ ТИПА РУЛЕТ ОСНОВАНИЯ ПЕНТОНА АДЕНОВИРУСА | 2019 |
|
RU2820522C2 |
| ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК L1 ПАПИЛЛОМАВИРУСА | 2020 |
|
RU2808002C2 |
| ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ ПАПИЛЛОМАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА | 2020 |
|
RU2806424C2 |
| ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ С ВЫСОКОПЛОТНЫМ ПОКРЫТИЕМ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ЭКСПРЕССИИ АНТИТЕЛ | 2017 |
|
RU2813282C2 |
| Антитела, нацеливающиеся на C5aR | 2020 |
|
RU2823245C2 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ ОТ FMDV И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2745373C2 |
| МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ МЕЗОТЕЛИН И CD137 | 2019 |
|
RU2815066C2 |
| АНТИТЕЛА К ТАУ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2018 |
|
RU2787779C2 |
| МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ REP БЕЛКА ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (ЗКДНК) | 2020 |
|
RU2812850C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения агрегированных олигонуклеотидов и способ получения агрегированных олигонуклеотидов, упакованных в вирусоподобную частицу. В одном из вариантов реализации способ получения агрегированных олигонуклеотидов включает этапы обеспечения олигонуклеотидов, денатурации олигонуклеотидов, агрегации олигонуклеотидов и получения агрегированных олигонуклеотидов. Изобретение расширяет арсенал способов получения агрегированных олигонуклеотидов, упакованных в вирусоподобную частицу. 2 н. и 19 з.п. ф-лы, 13 ил., 3 табл., 9 пр.
1. Способ получения агрегированных олигонуклеотидов, указанный способ включает следующие этапы:
(a) обеспечения олигонуклеотидов, причем указанные олигонуклеотиды содержат по меньшей мере один участок поли-G,
при этом указанные олигонуклеотиды имеют последовательность нуклеиновой кислоты GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 1), и
при этом указанные олигонуклеотиды состоят исключительно из дезоксинуклеотидов, связанных фосфодиэфирными связями;
(b) денатурации указанных олигонуклеотидов, причем указанная денатурация включает этап
(i) инкубации водного раствора I, содержащего указанные олигонуклеотиды и хаотропный агент, при температуре от 75°C до 99°C до тех пор, пока средний диаметр указанных олигонуклеотидов не составит 1 нм или менее, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(c) агрегации указанных олигонуклеотидов, причем указанная агрегация включает этапы:
(i) инкубации водного раствора II, содержащего указанные олигонуклеотиды с указанным средним диаметром 1 нм или менее, полученные на этапе (b), хаотропный агент и катион, при температуре от 75°C до 99°C с образованием указанных агрегированных олигонуклеотидов, при этом указанную инкубацию проводят до получения среднего диаметра указанных образованных агрегированных олигонуклеотидов 7-14 нм, при этом указанный средний диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС);
(ii) доведения температуры указанного раствора II до температуры ниже 40°C; и
(d) получения агрегированных олигонуклеотидов.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный водный раствор I не содержит одно- или двухвалентных ионов в такой концентрации, при которой происходит спонтанная самоагрегация указанных олигонуклеотидов.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, представляет собой мочевину.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что чистота указанных олигонуклеотидов составляет 90% или более по определению методом ВЭЖХ.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что тип ВЭЖХ выбран из группы, состоящей из обращенно-фазовой ВЭЖХ и анионообменной ВЭЖХ.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, выбран из мочевины, фенола, изопропилового спирта, этанола и хлорида гуанидиния.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, являются одинаковым.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе I, и указанный хаотропный агент, содержащийся в указанном растворе II, представляют собой мочевину.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что по меньшей мере 90% указанных агрегированных олигонуклеотидов, полученных указанным способом, имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
11. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что по меньшей мере 95% указанных агрегированных олигонуклеотидов, полученных указанным способом, имеют диаметр от 10,8 нм до 13,2 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
12. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что по меньшей мере 65% указанных агрегированных олигонуклеотидов, полученных указанным способом, имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
13. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что по меньшей мере 70% указанных агрегированных олигонуклеотидов, полученных указанным способом, имеют диаметр от 11,4 нм до 12,6 нм, причем указанный диаметр определяют методом динамического рассеяния света (ДРС).
14. Способ получения агрегированных олигонуклеотидов, упакованных в вирусоподобную частицу, причем указанный способ включает этапы:
(а) создание смеси, содержащей:
(i) белок оболочки РНК-бактериофага;
(ii) агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки; и
(iii) агрегированные олигонуклеотиды, полученные способом по любому из пп. 1-13,
(b) удаление указанного агента из указанной смеси; и
(c) обеспечение возможности самосборки указанного белка оболочки в вирусоподобную частицу и упаковки указанных агрегированных олигонуклеотидов;
(d) получение упакованных агрегированных олигонуклеотидов.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что РНК-бактериофаг представляет собой Qβ.
16. Способ по п. 14 или 15, отличающийся тем, что указанный агент, способный предотвращать самосборку указанного белка оболочки, выбран из группы, состоящей из детергентов, хлорида гуанидиния и мочевины.
17. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что чистота указанных упакованных агрегированных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 99,5% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
18. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что чистота указанных упакованных агрегированных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 99,6% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
19. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что чистота указанных упакованных агрегированных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 99,7% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
20. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что чистота указанных упакованных агрегированных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 99,8% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
21. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что чистота указанных упакованных агрегированных олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 99,9% при определении методом эксклюзионной хроматографии.
| WO 2007144150 A1, 21.12.2007 | |||
| WO 2007068747 A1, 21.06.2007 | |||
| WO 2017197009 A1, 16.11.2017 | |||
| СПОСОБЫ УПАКОВКИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ РНК-СОДЕРЖАЩИХ БАКТЕРИОФАГОВ | 2007 |
|
RU2476595C2 |
