Способ расщепления рибонуклеиновых кислот Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/68 C07H21/04 

Изобретение относится к биотехнологии и биохимии нуклеиновых кислот и может быть использовано для получения фрагментов рибонуклеиновых кислот (РНК), создания противовирусных препаратов, для изучения функций РНК, для создания ген- направленных соединений и т,п.

Наиболее близким к предлагаемому является способ расщепления РН К с помощью основных пептидов путем инкубации РНК с расщепляющим агентом.

Существенным недостатком этого способа, как и всех известных неферментативных методов расщепления РНК, является недостаточно высокая специфичность (т.е. множественность разрывов цепи РНК).

Целью изобретения является повышение специфичности за счет обеспечения единичного разрыва РНК в заданном месте.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу расщепления рибонуклеиновых кислот путем инкубации рибонуклеиновой кислоты с основным пептидом в качестве основного пептида используют пептид (Leu - Агд)з - Gly (R), ковалентно связанный с Б -КОНЦОМ олигонуклеотида или его производного, комплементарного участку

разщепляемой рибонуклеиновой кислоты, прилежащему к месту разрыва, причем R - -NH2 или -OAlk.

Пример 1. В качестве РНК используют меченный радиоактивным фосфором гептадекарибонуклеотид (10-7 М) формулы

51 - 32Р - pGAGGACGAAACAACAAC-31, в качестве расщепляющего реагента берут пептид, ковалентно связанный с гептаде- зоксирибонуклеотидом, комплементарным б -концу РНК (подчеркнуто):

З1 - d CTCCTGCpXLeu - Arg)3 - Gly(R), где R - -NH2, -OAlk.

Реагент взят в концентрации М, его инкубацию с РНК осуществляют в течение 2 сут при комнатной температуре в 10 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1,100 мМ NaCI и 1 мМ ЭДТА, рН 7.9. Реакцию останавливают осаждением реакционной смеси 2%-ным перхлоратом лития в ацетоне. После отделения остаток растворяют в 5 мкл 10 М мочевины и 1мкл смеси ксиленци- анола и бромфенола в формамиде (1 : 10) и наносят на 20%-ный полиакриламидный гель. Проводят гель-электрофорез (при 1000-1200 В, 2 ч) и экспонируют гель для получения радиоавтографа (для контроля

-Ч

сл к

VI

VJ со

инкубируют в тех же условиях указанный выше гептадекарибонуклеотид без расщепляющего реагента), Электрофоретический анализ свидетельствует, что в реакционной смеси, помимо исходной РНК, присутствует один укороченный радиоактивномеченый фрагмент:

5 4 P pGAGGACGAAACA. Структура фрагмента установлена по методу Донис-Келлер с помощью расщепления его специфическими ферментами, чувствительными к определенным типам гетероциклических оснований молекулы олигорибонуклеотида. Степень расщепления РНК, оцененная с помощью лазерного сканирования рентгеновской пленки на Ultroscan XL Laser Dens tometer(LKB, Швеция), составляет в указанных условиях 30%.

Пример 2. В качестве РНК используют гептадекарибонуклеотид, указанный в примере 1, в качестве реагента используют Ы-(2-оксиэтил)феназиниевое (Phn) производное указанного в примере 1 основного пептида

О

СИАОИ i(-oPOCTC{TGCp)(u«-flr9))

rt4vH(0

)

Эксперимент ведут аналогично описан- ному в примере 1. Получают единичный раз- рыв РНК с образованием того же укороченного фрагмента, Степень расщепления 70% (известно, что введение остатка Phn в олигонуклеотид повышает прочность образующихся дуплексов между нуклеиновой кислотой и олигонуклеотидом).

Пример 3. В качестве РНК используют тетрадекарибонуклеиновую кислоту формулы

:1-г32г

,(

5 T P pGAUUGAAAAUCCCC-3 .. в качестве расщепляющего реагента - производное формулы

о с№н j(-o-po-CTflRCTf)-(L«u ftrgkGtyC)

((Лг)И

tr

где олигонуклеотидная часть комплементарна 5 -концу РНК (подчеркнуто). Условия проведения эксперимента аналогичны вышеописанным. Получен единичный разрыв РНК с образованием укороченного фрагмента формулы

5432P pGAUUGAAAAU. Степень расщепления 55%.

В контрольных экспериментах при инкубации РНК в тех же условиях, что указаны в примере 1, но с использованием в качестве расцепляемого реагента только его пептидной части или ее смеси с олигодезок- сирибонуклеотидом расщепление не наблюдается.

Формула изобретения

Способ расщепления рибонуклеиновых кислот путем инкубации рибонуклеиновой кислоты с основным пептидом, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности за счет обеспечения единичного разрыва РНК в заданном месте, в качестве основного пептида используют пептид (Leu - Агд)з - Gly. ковалентно связанный с у -концом олигонуклеотида или его производного, комплементарного участку расщепляемой рибонуклеиновой кислоты, прилежащему к месту разрыва, где R -NH2, или -OAlk.

Использование: для изучения функций РНК, создания противовирусных препаратов. Сущность изобретения: гидролиз РНК с помощью пептида - (Leu - Агд)з - Gly (R), ковалентно связанного с олигонуклеоти- дом, комплементарным участку РНК, прилежащему к сайту расщепления R -NH2 или -OAlk.