Способ расщепления полирибонуклеотидов Советский патент 1979 года по МПК C07H21/02 

Изобретение относится к усоверше ствованному способу расщепления пол рибонуклеотидов с целью расширения набора способов, необходимых при анализе первичной структуры рибонукл иновой кислоты (РНК). Известен способ расщепления поли рибонуклеотидов с применением пирими диловой рибонуклеазы с последующим разделением продуктов реакции извест ными методами. До стадии расщепления полирибонуклеотидов рибонуклеазой (РНКаэа) предварительно вводят водорастворимый карбодиимид, что позволяет блокировать расщепление пиримидил.РНКазой по уриднновым остаткам и иозволяет специфически расщеплять модифицированный полимер лишь по цитидиловым остаткам. Для установления нервичной структуры полирибонуклеотидов и РНК во многих случаях необходимо избиратель ное расщепление только по уридиновьв звеньям, которое невозможно по известному способу. Целью изобретения является избирательное расщепление полирибонуклеотидов по уридиновым звеньям. Поставленная цель достигается предварительной обработкой полирибонуклеотидов смесью метрксиал)ина и метабисульфита натрия при рН ,1 м температуре 37-40°С и инкубацией при рН 8-9. Предварительная обработка .полирибонуклеотидов приводит к уётойчивости фосфодиэфирной связи между .цитидиновнмн основаниями, модифицирован ными Совокупным действием метоксиамина и метабисульфита натрия и соседним в 3-положении нуклеотидом при гидролизе пиримидил-РНКаэой. В результате при действии на люоые модифицированные полириб6нуклеотйд;ы пиримидил-РНКазой образуются олигорибонуклеотиды, содержащие уридиновые остатки лишь в 3-положенин, т.е. расщепление ферментом цепи происходит лишь по уридиновым звеньям. Способ состоит в предварительной обработке полирибонуклеотида смесью метоксиамина и метабисульфита натрия при рН ,1 при температуре 37-40С и инкубации при рН 8-9, в расщеплении полирибонуклеотида пиримидиловой рибонуклеазой с последующим разделением продуктов реакции. П p и M e p,,;0,5 МГ РНК из 50 S рибосомных субчастиц E.coCi инкубиру ют в течение 4 ч при 37-40 С в 0,1 м раствора, содержащего 125 г/л метоксиамина и 380 г/л метабисульфита натрия при рН 5--0,1. После окончания реакции РНК наносят на колонку объемом 5 мл, иаполнениую смолой Сефадексом Г-25. Смола в колонке уравновешена водой при рН 8. Скорос протока жидкости через колонку 5 мл/ч. С 1,7 до 3 мл собирают раст вор, содержащий РНК, освобожденную от модификаторов. Раствор упаривают до 0,5 мл, добавляют аммиак до рН 8 9 и вщдерясивают в течение 12-14 ч при комнатной температуре для дёМодификации остатков урйдина. КО,5 мл раствора РНК добавляют бикарбонат аммония до pli 8 и 0,002 пиримидил-РНКазы и выдерживают при 37-38 С в течение 24 ч, . Затем растйор наносят на колонку объемом 2,5 мл, заполненную смолой ДЕАЕ-Сефадексом А-25.Смола в колонке уравновешена буфером А, содержащим, г/л : 2,42 оксиметиламино мвтанатрис и 420 мочевины, рН 7,5-0/1. ; На колсгйку подают раствор из дву последовательйо соединенных сосудов S первом сосуде буферный раствор А, во втором - буферный раствор Б раствор фосфомоноэстеразы (0,6 г/л) рН ,1 и 37-40с, ;,,.,Полученный Ьбразёц уШрййаюти наносят на пластинку 1бх1б см, покрытую тгонким слоем целлюлозы (3,5г Пластинку помещают в герметичный резервуар, на дно которого наливают 100 Ш1 раствора нормального бутанола, насыщенного водой. Восходящую хроматографию в этой системе проводят при комнатной температуре в течение 3-5 ч, пОка граница поднимающегося раствора не достигает верхне17О края пластинки. По дамньа хроматографии единстве ;нам Движущимся нуклеоэидом в анализ руемой смёсН является уридин.Оставш ся на старте материал элюиps oт.c

4 пластины и гидролизуют до нуклёотиов 18-часовой инкубацией в 0,3 М КОН при 37-38 С. Раствор нейтрализуют нее 04 , удаляют КСЕО4 центрифугированием при 3000 об/мин и наносят на кварцевую пластину (16x16), покрытую тонким слоем целлюлозы. Восходящую хроматографию проводят в нормальный бутанол, насыщенный водой в которой движутся лишь нуклеозиды. В результате дефосфорилирования и щелочного гидролиза смеси олигонуклеотидов нУклеозидным является лишь 3-концевой остаток, соответствующий уридину. Остальной материал выскребают с пластины, элюируют воДой, дефосфорилируют. Хроматография в тонком слое обнаруживает,что материал состоит лишь из остатков М -метоксицитидина, аденозина и гуанозина. В процессе анализа обнаружено, что 5, б-дйгидфо-б-сульфо N-метоксицйтидин превращается в N-метоксицитидин при обработке 0,3 М КОН при 37-38С за 3 ч. Таким образом, исходные олигО1 уклеотиды содержат уридин лишь на 3 конце, т.е. описанное расщепление . полимера проходит лишь по остаткам урйдина. Специфичность расщепления достаточно высока, так как не обнаружено при анализе состава олигонуклеотидов никаких продуктов, кроме указанных. /Формула изобретения Способ расщепления, полирибонуклеотидов с применением пиримидиловой рибрнуклеазы с последующим разделением продуктов реакции, отличающийся тем, что, с целью избиратедьнрго расщепления по уридиНовым звеньям, полирибонуклеотид предварительно обрабатывают смесью метоксйамина, и метабисульфита натрил при рП ,1 и температуре 3740°С, а затем инкубируют при рН 8-9,