СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПНЕВМОНИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/84 

Изобретение относится к медицине, а именно к методам определения активности воспаления при различных формах хронической пневмонии у детей.

Различные формы бронхолегочной патологии, особенно врожденные пороки развития бронхов и легких и хроническая пневмония у детей, являются частой причиной ранней инвалидизации таких больных (Врожденные и наследственные заболевания легких у детей / Под ред. Ю.Е.Вельтищева, С.Ю.Каганова, В.Таля. - М.: Медицина, 1986. - 304 с.; Болезни органов дыхания у детей // Под ред. С.В.Рачинского, В.К.Таточенко. - М.: Медицина, 1987. - С.254-401; Практическая пульмонология детского возраста // Под ред. В.К.Таточенко. - М.: Изд., 2000. - 207 с.).

Хронические пневмонии у детей нередко протекают без выраженных клинических проявлений, что требует точного определения активности воспаления, так как это необходимо для дифференциальной диагностики, оценки эффективности и качества проводимой терапии (Каганов С.Ю., Розинова Н.Н., Голикова Т.М. и др. Хронические заболевания легких у детей и критерии их диагностики. - М., 1979. - 248 с.; Балаболкин И.И. Бронхиальная астма у детей. - М.: Медицина, 2003. - 320 с.).

Известен способ диагностики активности воспаления в легких путем рентгеновских исследований (рентгеноскопия, рентгенография, томография), позволяющий установить характер и распространенность воспалительных изменений в паренхиме легких и бронхах (Бакланова В.Ф., Васильев Ю.Д., Ватолин К.В., и др. Рентгенодиагностика в педиатрии: Руководство для врачей в 2-х томах. - М.: Медицина, 1988, т.1. C.164-302).

Недостатками способа являются значительная лучевая нагрузка на детский организм и, в ряде случаев, травматичность. Поэтому применение этих исследований в педиатрии должно быть ограничено. Следует учитывать, что лучевые способы диагностики позволяют выявлять уже сформированные воспалительные изменения, когда в результате активного воспаления уже произошло патологическое ремоделирование легочной ткани. Кроме того, недостатком рентгеновских способов диагностики хронических пневмоний у детей является значительная доля субъективизма при интерпретации полученных данных.

Известен способ диагностики активности воспаления в легких путем трахеобронхоскопии (Климанская Е.В. Основы детской бронхологии. - М., 1972. - 176 с.). Способ позволяет восстанавливать проходимость дыхательных путей, получать содержимое бронхов и эндобронхиально вводить лекарственные препараты. Недостатком этого способа являются травматичность и необходимость проведения процедуры у детей только под общим обезболиванием. Способ не дает представления о состоянии и воспалительных изменениях легочной ткани. Кроме того, для выполнения способа необходим комплекс дорогостоящего бронхологического и анестезиологического оборудования и специально обученный персонал (Филиппов В.П., Ловачева О.В. Диагностический бронхоальвеолярный лаваж. - М., 1988. - С.5-16).

Одним из современных методов оценки активности воспаления при хронических формах бронхолегочной патологии является количественное определение биологически активных соединений в качестве маркеров воспаления, которые могут использоваться как при оценке степени обострения, так и эффективности терапии этих заболеваний у детей.

Известен способ оценки активности воспаления в дыхательных путях путем определения метаболитов оксида азота (NO) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом, выбранный нами за прототип (Невзорова В.А., Лукьянов П.А., Кулакова Н.В., Гельцер Б.И. Способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей: Патент RU 2152617 С1 от 07.10.2000).

Способ осуществлялся следующим образом: у больных обоего пола в возрасте 20-60 лет проводили трахеобронхоскопию и субсегментарный бронхоальвеолярный лаваж по методике, описанной Г.И.Лукомским и соавт.(Лукомский Г.И., Шулутко М.В., Виннер М.Г. Бронхопульмонология. - М.: Медицина, 1982. - 400 с.). Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) получали в объеме 25 мл. Аликвоту ЖБАЛ, содержащую в своем составе 10 частей 2% раствора ЭДТА, центрифугировали, исследования проводили с бесклеточными фракциями ЖБАЛ.

В ЖБАЛ больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом определяли сумму метаболитов оксида азота - NO₂ ^- и NO₃ ^-. Так как NO₂ ^- является неустойчивым анионом и при воздействии окислителей легко доокисляется до NO₃ ^-, для определения всей суммы метаболитов нитрат-ион восстанавливали с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью до нитрит-иона, содержание которого определяли с помощью реактива Грейса (Green L.C., Wagner D.A., Glogowski J. et al. Analysis of Nitrate, Nitrite and [15N] Nitrate in Biological Fluids//Analytical Biochemistry. - 1982. - Vol.126. - P.131-138).

Для определения NO₂ ^- и NO₃ ^- к 1 мл супернатанта в пробирку добавляли 0,3 г кадмиевой пыли, импрегнированной медью, и нагревали на водяной бане 60 мин при температуре 100°С. При охлаждении пробу центрифугировали 3 мин при 12000 об/мин. Полученный супернатант использовали для определения суммы метаболитов NO.

К 100 мкл пробы супернатанта в пластиковом планшете добавляли 50 мкл 5% раствора NH₄Cl, 50 мкл 2% раствора сульфаниламида в воде и 50 мкл 0,2% раствора нафтилэтилендиамина в 5% растворе Н₃PO₄. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре Dynatech при 540 нм. Количество NO₂ ^- и НО₃ ^- выражали в нмоль/мл или в нмоль/мг белка ЖБАЛ.

Недостатками этого способа является обязательное проведение эндоскопического исследования (трахеобронхоскопии и субсегментарного бронхоальвеолярного лаважа), которые у детей проводятся под наркозом, что делает способ травматичным и опасным для здоровья. Кроме того, этот способ является сложным при заборе образцов, требует использования дорогостоящего стационарного эндоскопического оборудования, практически не выполним у детей раннего и дошкольного возраста, не обеспечивает возможностей для выполнения отсроченного анализа и проведение исследований в малых клиниках скорой помощи и в условиях районных больниц.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового точного неинвазивного способа диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей непосредственно в пораженном легком без использования травматичных бронхоскопических методов.

Поставленная задача решается путем количественного определения содержания метаболитов оксида азота в биологическом материале у детей, при этом в качестве биологического материала используют сыворотку крови, в которой определяют концентрацию метаболитов оксида азота (х_i) и по формуле y_i=034x_i+5,4 расчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и при увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой диагностируют высокую активность воспалительного процесса, при этом в качестве нормы принимают концентрацию метаболитов оксида азота в сыворотке крови 23,57±2,35 мкМ/л и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

Сущность заявляемого изобретения заключается в прямом аналитическом определении содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови у детей, больных хроническими пневмониями, на основании чего рассчитывают концентрации метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) по уравнению регрессии:

где:

y_i и x_i - коррелируемые (сопоставляемые) величины (содержание метаболитов NO в ЖБАЛ и сыворотке крови конкретных больных),

x_ср, y_ср - средняя арифметическая ряда х (значения концентраций метаболитов NO в сыворотке крови) и ряда у (значения концентраций метаболитов NO в ЖБАЛ),

R_y/x - расчетный коэффициент линейной регрессии, который определяют при линейной корреляции по формуле: ,

r_y/х - коэфффициент линейной корреляции,

σ_y, σ_х - средние квадратические отклонения сопоставляемых рядов.

Числовые значения x_ср, y_ср, R_y/x, r_y/х, σ_y, σ_х устанавливаются по данным обследования для каждой группы больных.

С помощью этого уравнения с высокой достоверностью можно рассчитать концентрации метаболитов оксида азота в ЖБАЛ по значениям содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови каждого конкретного больного с пневмонией без проведения трахеобронхоскопии и субсегментарного бронхоальвеолярного лаважа.

Способ осуществляется следующим образом. Забор проб крови проводится у детей в условиях физиологического покоя утром, натощак, из локтевой вены не ранее чем через час после сна в пластиковые пробирки. После 30 мин экспозиции кровь 20 минут центрифугируют при 4°С - 2000 g. Полученную сыворотку крови можно хранить до следующего этапа исследования при -20°С. Для осаждения белка к 1 мл сыворотки крови добавляют 100 μл 35% сульфосалициловой кислоты. Пробы тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Затем пробы центрифугируют при 5000 g 15 минут для полного осаждения белка. Супернатант после доведения рН 10 μл 5N NaOH до 7,8-8,0 используют для определения содержания метаболитов оксида азота. Для этого к полученному супернатанту добавляют индикаторный порошок. При этом происходит восстановление нитрат-аниона в нитрит-анион, который вступает в реакцию диазотирования-азосочетания с компонентами индикаторного порошка (сульфаниловая кислота и α-нафтиламин). В результате этой реакции образуется окрашенное в красный цвет азотсодержащее соединение в концентрации, пропорциональной содержанию нитрата натрия в анализируемом растворе. Измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 520 нм и рассчитывают концентрацию нитрита (NO₂) по градуировочному графику, построенному по шести известным концентрациям NaNO₃.

Нами было обследовано 125 детей в возрасте 3-17 лет. Из них было 84 ребенка, больных хронической пневмонией с длительностью заболевания - от 1 года до 12 лет. Исследование содержания метаболитов NO в сыворотке крови проводилось также у 18 практически здоровых детей, составивших контрольную (референтную) группу. Контрольную группу при исследовании NO в лаважной жидкости составили 23 больных хронической пневмонией с односторонним процессом, у которых был взят секрет из бронхов сохранного легкого.

Для определения объема и локализации воспаления было проведено рентгено-бронхологическое обследование. У всех больных был проведен анализ газового состава и кислотно-основного состояния крови, а у детей старше 5 лет были исследованы функции внешнего дыхания с определением статических и динамических легочных объемов. Эти данные позволили документировать стадии обострения и стадии ремиссии хронической пневмонии у детей.

Проведенные исследования показали, что существует тесная прямая корреляция между содержанием метаболитов оксида азота в сыворотке крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у всех исследованных нами больных хронической пневмонией - коэффициент корреляции r=0,9 (р<0,01).

На этом основании можно количественно определить концентрации оксида азота в лаважной жидкости (y) в зависимости от его содержания в сыворотке крови (x).

Для проведения расчетов используются следующие параметры:

y_i и x_i - коррелируемые (сопоставляемые) величины, обозначающие соответственно содержание метаболитов NO в ЖБАЛ и сыворотке крови конкретных больных),

x_ср, y_ср - средние арифметические ряда x и ряда y (средние значения концентраций метаболитов NO в сыворотке крови и в ЖБАЛ всех больных),

R_y/x - расчетный коэффициент линейной регрессии, который определяют при линейной корреляции по формуле: ,

r_y/x - коэфффициент линейной корреляции,

σ_y, σ_x - средние квадратические отклонения сопоставляемых рядов.

Числовые значения коэффициентов линейной регрессии, линейной корреляции, средних квадратических отклонений устанавливаются по данным обследования разных групп больных и группируются в соответствии со стандартными статистическими методами (См. 7.2.2. - Метод группировок. - С.190-197, а также 7.4.1. - Линейный коэффициент корреляции. - С.206-213. В кн.: Теория статистики: Учебник / Под ред. проф. Г.Л.Громыко. - М.: Инфра-М, 2002.).

В результате расчетов для обследованных больных с хронической пневмонией нами получено значение x_cp=37,26, (x_cp - средняя арифметическая из всех значений (обследуемой группы) концентраций метаболитов NO в сыворотке крови), y_ср=18,07, (y_cp - средняя арифметическая из всех значений (обследуемой группы) концентраций метаболитов NO в ЖБАЛ).

Рассчитанные значения: r_y/x (коэффициент корреляции)=0,8;

В результате преобразуем уравнение

Отсюда

Таким образом, уравнение преобразовано и в окончательном виде представляет собой удобную форму для расчетов:

Подставляя в это уравнение значение концентрации NO в сыворотке крови больного (х_i), вычисляем концентрацию метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (y_i) данного больного.

Используя фактические данные наших исследований содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови в группе больных с хронической пневмонией по уравнению , были сделаны следующие расчеты (табл.1).

Достоверность регрессии R_y/x в примере составила р<0,01.

Таблица 1NO в сыворотке кровиNO в лаважной жидкости(x)(y)x₁=37,42y₁=0,34×37,42+5,4=18,12x₂=42,40y₂=0,34×42,40+5,4=19,80x₃=36,02y₃=0,34×36,02+5,4=17,60x₄=14,22y₄=0,34×14,22+5,4=10,23x₅=54,50y₅=0,34×54,50+5,4=24,00

Полученные по расчету значения содержания метаболитов оксида азота в лаважной жидкости y (при заданных значениях NO в сыворотке крови x) сравнили с фактическими значениями концентраций метаболитов оксида азота (табл.2).

Как показано в таблице 2, рассчитанные значения содержания метаболитов NO в ЖБАЛ существенно не отличаются от имеющихся фактических данных.

Таблица 2
Содержание метаболитов оксида азота в лаважной жидкости при разных уровнях оксида азота в сыворотке крови (мкМ/л)Метаболиты NO в сыворотке кровиМетаболиты NO в лаважной жидкости (M±tm)Разность между фактическим и расчетным значениемфактические значениярасчетные значения123437,4216,6118,12-1,5142,417,8219,8-1,9836,0220,5017,6+2,914,229,8610,23-0,3754,521,3024,00-2,7

Для оценки величин, составляющих ряд регрессии (столбец 3, т.е. значения, вычисленные по формуле), применяется среднее квадратическое отклонение регрессии σR_y/х (σR_y/х=σ_y√1-r² _xy), составляющее в нашем случае σ_y/х=±2,37 (расчетное значение).

Зная вычисленные средние значения концентраций(столбец 3) метаболитов NO в ЖБАЛ, определяем и их колебания в пределах, в которых могут находиться индивидуальные значения метаболитов NO в ЖБАЛ:

18,12±2,37

19,80±2,37

17,60±2,37

10,23±2,37

24,00±2,37

Определив среднюю ошибку коэффициента регрессии (m_Ry/х) и оценив полученные выборочные коэффициенты регрессии с помощью критерия t (t=Ry/x/m_Ry/x), получили степень достоверности коэффициентов регрессии, в нашем случае р<0,01.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет рассчитывать концентрации метаболитов оксида азота в лаважной жидкости без проведения бронхоскопического исследования, что позволяет точно определять локальную активность воспалительного процесса (по существу в зоне воспаления) и применять данный способ для диагностики и оценки эффективности лечения хронической пневмонии у детей.

Проведенные нами исследования указывают на то, что оксид азота, как в сыворотке крови, так и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа является диагностическим критерием степени активности воспаления при различных формах хронической пневмонии у детей. Определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови является простым, щадящим и точным методом исследования по сравнению с комплексом эндоскопических процедур получения жидкости бронхоальвеолярного лаважа и определением в ней метаболитов оксида азота. Благодаря этому расчету диагностический алгоритм упрощается - первым шагом является аналитическое определение содержания метаболитов оксида азота в сыворотке крови больного, а затем производится расчет концентрации метаболитов оксида азота в ЖБАЛ предложенным нами способом по формуле

Было получено, что повышение концентрации метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой свидетельствует о высокой активности воспалительного процесса у детей с хронической пневмонией. При этом в качестве нормы следует использовать значения концентраций метаболитов оксида азота 23,57±2,35 мкМ/л в сыворотке крови и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.

Примеры конкретного осуществления способа.

Пример 1. Лена Г., 14 лет (История болезни 6012/01) поступила в пульмонологическое отделение с диагнозом: Хроническая двусторонняя пневмония: пневмосклероз, деформация бронхов левой верхней доли и бронхов левой нижней доли. Нижнедолевой катарально-гнойный эндобронхит. С 7 летнего возраста отмечались частые бронхиты, протекающие с обструктивным синдромом. Назначаемая антибактериальная и муколитическая терапия существенного эффекта не имели; сохранялся кашель с гнойной мокротой. При аускультации легких хрипы не выслушиваются. На рентгенограмме органов грудной клетки: выраженная деформация легочного рисунка нижних долей легких. Снижение перфузии верхних долей легких. Расширение корней обоих легких. При проведении трахеобронхоскопии выявлен двусторонний нижнедолевой гнойный эндобронхит. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 73,40 мкМ/л, в лаважной жидкости - 27,76 мкМ/л; содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, рассчитанное по формуле, - 30,35 мкМ/л.

Заключение: у обследованной больной выявлено превышение нормы содержания метаболитов оксида азота в крови более чем в 3,0 раза и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа - в 1,8 раза, что указывает на очень высокую активность воспалительного процесса в обоих легких. Причем расчетное значение концентраций метаболитов оксида азота также превышало их нормальные уровни в 1,9 раза. Эти лабораторные показатели адекватно соответствовали тяжелой клинической картине обострения хронической двусторонней пневмонии у больного ребенка, что потребовало назначения комплексной терапии - антибактериальной, муколитической, бронхолитической и симптоматической.

Пример 2. Анна О., 14 лет (История болезни 2459/01) поступила в пульмонологическое отделение с диагнозом: Хроническая левосторонняя пневмония. Пневмосклероз базальных и язычковых сегментов левого легкого. Деформация и расширение бронхов С 4, 5, 8, 9, 10. Левосторонний гнойно-катаральный эндобронхит. С 3-х лет часто болела респираторными вирусными инфекциями, бронхитами. При поступлении: жалобы на кашель с выделением слизисто-гнойной мокроты. При аускультации слева при форсированном дыхании выслушиваются сухие и влажные среднепузырчатые хрипы. Рентгенография грудной клетки: усиление и деформация легочного рисунка в базальных и язычковых сегментах левого легкого. Корни легких структурно изменены. Трахеобронхоскопия: левосторонний катарально-гнойный эндобронхит. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 46,75 мкМ/л, в лаважной жидкости - 21,56 мкМ/л; значения, рассчитанные по формуле, - 21,30 мкМ/л.

Заключение: у обследованной больной выявлено превышение нормы содержания метаболитов оксида азота в крови более чем в 1,9 раза, в жидкости бронхоалъвеолярного лаважа - в 1,4 раза, а расчетные значения концентраций метаболитов оксида азота в лаважной жидкости превышали референтный уровень более чем в 1,3 раза, что указывает на высокую активность воспалительного процесса в обоих легких. Это заключение было подтверждено дальнейшим клиническим наблюдением и тяжелым течением хронической пневмонии у этой больной, что потребовало назначения эффективной антибактериальной и муколитической терапии.

Пример 3. Алексей Ш., 12 лет (История болезни 764/01) находился на лечении с диагнозом: правосторонняя нижнедолевая хроническая пневмония, деформирующий бронхит сегментов 7-10 правого легкого. Бронхообструктивный синдром. В легких выслушивается ослабленное дыхание, единичные сухие хрипы справа. Флоуметрия: умеренно выраженные нарушения проходимости периферических бронхов. Рентгенограмма органов грудной клетки: очаговых и плевральных изменений нет. Трахеобронхоскопия: правосторонний катаральный эндобронхит в фазе стихания. При обострении бронхолегочного процесса получал антибактериальную и муколитическую терапию. Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови составил 24,92 мкМ/л, в лаважной жидкости - 13,68 мкМ/л; значения, рассчитанные по формуле, - 13,87 мкМ/л.

Заключение: у обследованного больного не выявлено значимого увеличения содержания метаболитов оксида азота в крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, при этом расчетные концентрации метаболитов оксида не отличались от аналитически установленных, что указывает на отсутствие воспаления в бронхолегочной системе данного больного, подтверждено клиническим наблюдением и свидетельствует также об эффективности проведенной комплексной терапии.

Таким образом, конкрентые клинические примеры и опыт использования предлагаемого способа для диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей свидетельствует об адекватности результатов, получаемых заявленным способом, не только аналитически установленным данным, но и клинической картине течения хронической пневмонии у обследованных больных, а именно измеренные аналитически концентрации метаболитов оксида азота в крови и в жидкости бронхоальвеолярного лаважа соответствуют расчетным значениям содержания метаболитов оксида азота в лаважной жидкости, указывают на активность воспалительного процесса и подтверждаются дальнейшим клиническим наблюдением за больными детьми.

Этот способ диагностики активности воспаления при хронической пневмонии у детей непосредственно в пораженном легком без использования травматичных бронхоскопических методик является достоверным, точным и неинвазивным.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу определения активности воспалительного процесса непосредственно в пораженном легком у детей с хронической пневмонией. Сущность способа: в сыворотке крови определяют содержание метаболитов оксида азота, затем по формуле у_i=0,34х_i+5,4 рассчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. При увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой у детей диагностируют высокую активность воспалительного процесса. Применение способа позволяет с высокой точностью выявлять локальные концентрации метаболитов оксида азота в бронхоальвеолярном пространстве при различных формах хронической пневмонии без проведения травматичной диагностической процедуры трахеобронхоскопии. 2 табл.

Способ диагностики активности воспаления при хронической пневмонии путем количественного определения содержания метаболитов оксида азота в биологическом материале, отличающийся тем, что у детей в качестве биологического материала используют сыворотку крови, в которой определяют концентрацию метаболитов оксида азота (x_i) и по формуле у_i=0,34х_i+5,4 рассчитывают содержание метаболитов оксида азота в жидкости бронхоальвеолярного лаважа и при увеличении концентраций метаболитов оксида азота в сыворотке крови более чем в 1,6 раза, а в жидкости бронхоальвеолярного лаважа более чем в 1,3 раза по сравнению с нормой диагностируют высокую активность воспалительного процесса, при этом в качестве нормы принимают концентрацию метаболитов оксида азота в сыворотке крови 23,57±2,35 мкМ/л и 15,69±2,60 мкМ/л в жидкости бронхоальвеолярного лаважа.