СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/564 

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики аутоиммунных процессов при хроническом воспалении в легочной ткани.

В настоящее время диагностика аутоиммунных процессов при разных видах хронического воспаления осуществляется путем относительно длительных клинических наблюдений при проведении соответствующих анализов - определение антинуклеарного и ревматоидного факторов, уровней аутоантител к нативной и денатурированной ДНК (Лабораторное дело, 1988, N 1, с. 40-43). Недостатком этих методов является их длительность, невозможность выявления аутоиммунного компонента хронического воспалительного процесса на его ранних стадиях.

Известны методы экспресс-диагностики аутоиммунных процессов при системной красной волчанке, ревматоидном артрите и других заболеваниях воспалительного характера с помощью инструментального анализа изменения отдельных биологических или физико-химических параметров организма с последующим сопоставлением полученных показателей у здоровых людей (пат. РФ N 2059245, 1992, кл. G 01 N 33/53, пат. РФ N 2012887, 1991, кл. G 01 N 33/53, авт. св. СССР N 1812500, 1991, кл. G 01 N 33/53).

Прототипом заявляемого изобретения является способ диагностики аутоиммунной патологии (пат. РФ N 2012887, 1991, кл. G 01 N 33/53) заключающийся в том, что лимфоциты крови подвергают лазерному импульсному облучению, определяют в качестве значимого показателя низко- и среднеаффинные Е-РОК, сопоставляют их отношение с аналогичными параметрами в контрольной пробе и констатируют наличие аутоиммунной патологии.

Недостатком прототипа является ограниченное применение и относительно невысокая точность при диагностике заболеваний легких.

Задачей, стоявшей перед авторами, явилось создание надежного и более точного способа диагностики патологических аутоиммунных процессов при хроническом воспалении в легочной ткани на основании исследования данных о влиянии дисбаланса в протеиназо-антипротеиназной системе в легких на активность деструктивных процессов легочной ткани и соединительнотканного каркаса легких и формирование системного аутоиммунного ответа, в частности, при хронических воспалительных заболеваниях легких - идиопатическом фиброзирующем альвеолите (ИФА) и саркоидозе легких (СЛ).

В основу изобретения были положены исследования авторами механизма процессов, протекающих в легких при различных патологиях.

Известно, что при активном воспалительном процессе в легочной ткани альвеолярными макрофагами, эндотелиальными и эпителиальными клетками производится большое количество хемоаттрактантов для нейтрофилов, включая интерлейкин-8 (ИЛ-8), C_5a-компонент комплемента, лейкотриен B₄ (LT В4) и ряд других, что приводит к активации нейтрофилов и их миграции из периферической крови в легочную ткань.

При этом было установлено, что в очаге воспаления активированные нейтрофилы могут освобождать оксиданты и протеолитические ферменты, способные к повреждению соединительнотканных белков легочной ткани - эластина и коллагена, а также пневмоцитов I и II типов. При этом наибольшей повреждающей способностью обладает сериновая протеиназа - эластаза, которая содержится в азурофильных гранулах нейтрофилов и экзоцитируется в окружающее межклеточное пространство при активации нейтрофилов.

Главным ингибитором сериновой эластазы нейтрофилов в легочной ткани является основной ингибитор протеиназ α₁-ИП. Исследования показали, что при высоком содержании активированных нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) и высокой активности эластазы в очаге воспаления развивается выраженный дисбаланс в системе протеиназы-ингибиторы, что способствует активации деструктивных процессов, образованию аутоантигенных детерминант ткани легкого, эластина и коллагена, образованию аутоантител и иммунных комплексов с последующим выходом их в системную циркуляцию.

В этих условиях было высказано предположение, что уровень аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого, определяемые в периферической крови, могут являться показателем интенсивности деструктивных процессов, развитие которых в легочной ткани связано с повышенным числом нейтрофилов и высокой активностью эластазы, а также со степенью дисбаланса в системе протеиназы-ингибиторы в легочной ткани при хронических воспалительных заболеваниях, и изменение этих показателей может свидетельствовать о наличии в легких аутоиммунного патологического процесса.

Для решения поставленной задачи предлагается способ диагностики патогенных аутоиммунных процессов путем измерения показателей: уровня аутоантител к эластину, коллагену, антигенам тканей легкого в крови; числа нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), активности эластазы и уровня α₁- ингибитора протеиназ в ЖБАЛ, определения средних аналогичных показателей у здоровых и на их основе определения диагностического коэффициента К по формуле:

где А - уровень аутоантител к эластину в крови (усл.ед.);
В - уровень аутоантител к коллагену в крови (усл.ед.);
C - уровень аутоантител к ткани легкого в крови (усл. ед.);
D - число нейтрофилов в ЖБАЛ (10⁶/мл);
E - активность эластазы в ЖБАЛ (нмоль 10⁶кл/ мл);
F = E/D - относительная активность эластазы (усл.ед.);
G - уровень α₁-ингибитора протеиназ в ЖБАЛ (мкг/мл);
Н = G/F показатель степени дисбаланса в системе
α₁- ИП-эластаза в ЖБАЛ (усл. ед.),
и диагностирование наличия аутоиммунного компонента патогенного аутоиммунного процесса при значении диагностического коэффициента К > 70%.

При этом появляется возможность уточнить диагноз и диагностировать обострение идиопатического фиброзирующего альвеолита при К > 70% и величине суммарного уровня аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого (А+В+C) > 10 (усл.ед.).

Для получения данных, необходимых для уточнения диагноза, были использованы комплексные методы исследования биохимических процессов в легких, включая спектрофотометрию и ракетный электрофорез. Для оценки уровня аутоантител в крови больных использовали иммуноферментный анализ.

Измерение каждого из вышеперечисленных показателей осуществляли по общепринятым методикам:
определение активности эластазы проводили с помощью метода спектрофотометрии с использованием в качестве субстрата р-нитрофенилового эфира бутилтритокси α- -аланина: (Meyer К.C., Lewandovski J.R., Zimerman J., Nunley D. , Calcoun W., Dopico G.A. Human neutrophil elastase complex in cystic fibrosis. // Am. Rev. Resp. Dis. - 1991. - Vol. l44. - P. 580-585);
определение α₁- ИП проводили с помощью метода ракетного электрофореза по методике (Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. Под ред. Н. Аксельсен, И. Кремль, Б. Вески. М., Мир, 1977, с. 200);
определение уровня аутоантител проводили с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем: (Энциклопедия клинических лабораторных тестов. Под ред. Н. Тица, М" "Лабинформ", 1997, с. 68.)
Сущность и практическая применимость заявляемого способа иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1
В ГНЦ пульмонологии было проведено обследование группы больных с установленным диагнозом диссеминированных процессов в легких с использованием методов иммуноферментного анализа, спектрофотометрии, ракетного электрофореза.

В качестве моделей воспалительных процессов в легких были выбраны больные идиопатическим фиброзирующим альвеолитом (ИФА) и саркоидозом легких (СЛ). Полученные результаты и данные их обсчета по вышеизложенной методике приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, у здоровых лиц величина диагностического коэффициента К составляет 2.5, если к этой величине прибавить сумму средних ошибок всех показателей, входящих в формулу для определения К, то можно рассчитать "пороговое " значение коэффициента К, причем, чем выше величина указанного коэффициента К, тем более выражена интенсивность аутоиммунных процессов. Как видно из табл. 1, самое большое значение К определяется у больных ИФА при обострении заболевания - его величина составляет 77±14, что соответствует наиболее выраженной интенсивности аутоиммунного компонента хронического воспалительного процесса. Если сумма уровней аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого (А+В+C) у больных ИФА более 10 усл.ед., это свидетельствует о выраженном обострении заболевания и о высокой интенсивности аутоиммунных процессов.

У больных саркоидозом легких как при активном процессе, так и в стадии стабилизации величина коэффициента К менее 20 (табл. 1), что указывает на отсутствие аутоиммунных реакций у этих больных.

Пример 2.

Больная И. ,1932 года рождения, жительница Сургута, поступила в клинику 04.10.1994. Диагноз - диссеминированный процесс в легких неясной природы с жалобами на одышку при минимальной физической нагрузке, чувство неполного вдоха, кашель сухой. Считает себя больной с 1991 года, когда появилась одышка, кашель, больная похудела на 10 кг. Лечилась с диагнозом: хронический бронхит - бронхолитиками и антибиотиками. В 1994 году ее состояние ухудшилось - значительно возросла одышка при минимальной физической нагрузке, на рентгенограммах органов дыхания появились двухсторонние изменения, которые расценивались как проявления двусторонней пневмонии, по поводу которой проводилась антибактериальная терапия. В связи с отсутствием эффекта больная была направлена в ГНЦ пульмонологии для уточнения диагноза.

Из анамнеза жизни. Работала библиотекарем. Из сопутствующих заболеваний отмечает гипертоническую болезнь.

При обследовании: Клинический анализ крови: Эр. - 5,0•10¹²/л, Hb - 148 г/л, L - 6,8•10⁹/л, Э - 1%, П - 5%, C - 77%, Л - 20%, М - 2%, СОЭ - 31 мм/час
IgA - 2,75, IgG - 16,91, IgM - 1,93, ЦИК - 346%
Клеточный состав ЖБАЛ -цитоз 11•10⁴, нейтрофилы - 29%, лимфоциты - 18%, альвеолярные макрофаги - 52 %.

ЭХО КГ - признаки гипертрофии миокарда правого желудочка. Давление в легочной артерии 42-45 мм рт.ст.

КГ - синусовый ритм. ЧСС 68. Гипертрофия левого желудочка, правого желудочка. A-v блокада 1 степени.

На рентгенограммах грудной клетки - выраженные интерстициальные изменения в нижних и средних отделах легких. Объем легких уменьшен.

При исследовании ФВД определялось снижение ЖЕЛ до 1,6 л - 55% от должного, снижение диффузной способности легких в устойчивом состоянии до 0,03 - 35,9% (N = 84%) Общая емкость легких снижена до 2,99 л - 59,5% от нормы.

Установлен диагноз - идиопатический фиброзирующий альвеолит.

При обследовании по предложенной формуле были получены следующие данные:
(А) - уровень аутоантител к эластину в крови - 5.47 (усл.ед);
(В) - уровень аутоантител к коллагену в крови - 5.65 (усл.ед.);
(C) - уровень аутоантител к ткани легкого - 4.07 (усл.ед.);
(D) - число нейтрофилов в ЖБАЛ - 3.2•10⁶/мл;
(Е) - активность эластазы - 3.5 нмоль•10⁶ кл/мл;
(F) - относительная активность эластазы -1.09 (усл.ед.);
(G) - уровень α₁-ингибитора протеиназ в ЖБАЛ - 10(мкг/мл);
(Н) - показатель степени дисбаланса в системе α₁- ИП-эластаза в ЖБАЛ - 9.17 (усл.ед.);
(К) - величина диагностического коэффициента - 60%
Суммарный уровень аутоантител (А+В+C) = 5.47+5.65+4.07=15.19
По величине суммарного уровня аутоантител и по величине диагностического коэффициента К можно сделать заключение о наличии обострения и о выраженном аутоиммунном компоненте воспалительного процесса у данной больной ИФА.

Пример 3.

Больной П. , 1958 года рождения, работает слесарем, житель сельской местности. При поступлении в клинику жалоб не предъявлял.

Считает себя больным в течение двух месяцев, когда при флюорографическом осмотре были выявлены изменения в легких.

Диагноз саркоидоза подтвержден гистологически на основании исследования материалов чрезбронхиальной биопсии.

Клинический анализ крови: Эр. - 4,8•10¹²/л, Hb - 148 г/л, ЦП - 0.92; L -5•10⁹/л, Э -1%, П - 2%, С - 54%, Л - 29%, М - 8%, СОЭ - 4 мм/час.

Клеточный состав ЖБАЛ: цитоз - 8•10⁴; нейтрофилы - 3%, лимфоциты - 24%; альвеолярные макрофаги - 73%.

IgA - 3,03; IgG - 13,45; IgM - 2,25; ЦИК - 175%
На рентгенограммах органов дыхания отмечена сетчатая деформация легочного рисунка.

При исследовании ФВД - спирографии - показатели в пределах нормы.

При обследовании по предложенной формуле были получены следующие данные:
(А)-уровень аутоантител к эластину в крови - 2.71 (усл.ед);
(В) - уровень аутоантител к коллагену в крови - 2.92 (усл.ед.);
(C) - уровень аутоантител к ткани легкого составил 2.84 (усл.ед.);
(D) - число нейтрофилов в ЖБАЛ - 0.24•10⁶/мл;
(Е) - активность эластазы - 2.0 нмоль•10⁶кл/мл;
(F - относительная активность эластазы - 8.33 (усл.ед.);
(G) - уровень α₁- ингибитора протеиназ в ЖБАЛ - 17 (мкг/мл);
(Н) - показатель степени дисбаланса в системе α₁- ИП-эластаза в ЖБАЛ - 2.04 (усл.ед.);
(К) - величина диагностического коэффициента - 24 %
Суммарный уровень аутоантител (А+В+C)= =2.71+2.92+2.84=8.47 (усл.ед.)
По величине суммарного уровня аутоантител и по величине диагностического коэффициента К можно сделать заключение об отсутствии аутоиммунного компонента у этого больного саркоидозом легких.

Как показали проведенные исследования, предлагаемый способ практически не требует дорогостоящей аппаратуры и реактивов, достаточно прост, надежен, воспроизводим и достоверен в постановке и интерпретации результатов. При этом время анализа сокращается с нескольких суток до 12-16 часов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики аутоиммунных процессов при воспалительных заболеваниях бронхолегочной системы. Способ основан на оценке интенсивности аутоиммунных процессов с помощью иммуноферментного анализа, спектрофотометрии и ракетного электрофореза путем измерения показателей. В качестве показателей определяют уровни аутоантител к эластину, коллагену, антигенам тканей легкого в крови, число нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, активность эластазы и уровень α1-ингибитора протеиназ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Определяют средние значения аналогичных показателей у здоровых людей. Рассчитывают диагностический коэффициент К по формуле К = [(G/F)/(A+B+C)]•100%, где A - уровень аутоантител к эластину в крови (усл. ед.), B - уровень аутоантител к коллагену в крови (усл. ед.), C - уровень аутоантител к ткани легкого в крови (усл. ед.), D - число нейтрофилов в ЖБАЛ (10⁶ кл/мл), E - активность эластазы в ЖБАЛ (нмоль • 10⁶ кл/мл), F = E/D - относительная активность эластазы (усл. ед. ), C - уровень α1-ингибитора протеиназ в ЖБАЛ (мгк/мл). Диагностируют наличие аутоиммунного компонента хронического воспалительного процесса при значении диагностического коэффициента К, большем 70%. При значении коэффициента К, большем 70%, и величине суммарного уровня аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого (A+B+C), большей 10 усл. ед. , диагностируют обострение идиопатического фиброзирующего альвеолита. Способ не требует дорогостоящей аппаратуры и реактивов, достаточно прост, надежен, воспроизводим и достоверен, позволяет сократить время проведения анализа. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ диагностики аутоиммунной патологии, включающий в себя анализ параметров жидких систем организма, включая анализ параметров крови с помощью инструментальных методов, определение значимых показателей, анализ полученных показателей по отношению к контролю и диагностирование патологии, отличающийся тем, что в качестве инструментальных методов используют иммуноферментный анализ, спектрофотометрию и ракетный электрофорез, в качестве значимых показателей определяют уровни аутоантител в крови к эластину, коллагену, к антигену легочной ткани, в жидкости бронхоальвеолярного лаважа определяют число нейтрофилов, активность эластазы и основного ингибитора протеина - α1-ИП, в ходе анализа показателей определяют средние аналогичные показатели у здоровых людей, рассчитывают диагностический коэффициент K по формуле

где A - уровень аутоантител к эластину в крови, усл.ед.;
B - уровень аутоантител к коллагену в крови, усл.ед.;
C - уровень аутоантител к ткани легкого в крови, усл.ед.;
D - число нейтрофилов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, 10⁶ кл/мл;
E - активность эластазы в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, нмоль • 10⁶ кл/мл;
F - E/D - относительная активность эластазы, усл.ед;
G - уровень a1-ингибитора протеиназ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, мкг/мл;
H - G/F - показатель степени дисбаланса в системе a1-ИП-эластаза в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (усл.ед.),
и диагностируют наличие аутоиммунной патологии хронического воспалительного процесса при значении диагностического коэффициента K > 70%. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что диагностируют в качестве патологии обострение идиопатического фиброзирующего альвеолита и активацию аутоиммунных процессов при значении K > 70% и величине суммарного уровня аутоантител к эластину, коллагену и к антигенам ткани легкого (A + B + C) > 10, усл.ед.