Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептидный конъюгат с активностью G-CSF, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью, которая отличается от последовательности hG-CSF человека вплоть до 15 аминокислотных остатков, который конъюгирован с 2-6 остатками полиэтиленгликоля. Конъюгаты имеют низкую биоактивность in vitro, продолжительное время полужизни in vivo, пониженный рецептор-опосредованный клиренс. Изобретение позволяет обеспечивать более быструю стимуляцию образования лейкоцитов и нейтрофилов, чем неконъюгированный рекомбинантный G-CSF человека. 15 з.п. ф-лы, 11 ил., 4 табл.
1. Полипептидный конъюгат, проявляющий активность G-CSF, включающий полипептид с аминокислотной последовательностью, которая отличается на вплоть до 15 аминокислотных остатков от аминокислотной последовательности hG-CSF, приведенной в SEQ ID NO: 1, причем полипептид содержит, по меньшей мере, две замены, выбранные из группы, состоящей из K16R/Q, K34R/Q и K40R/Q, и по меньшей мере, одну замену, выбранную из группы, состоящей из Т105К и S159K, относительно SEQ ID NO: 1, причем конъюгат содержит 2-6 остатков полиэтиленгликоля с молекулярным весом около 1000-10000 Да, присоединенных к связующим группам полипептида.2. Полипептидный конъюгат по п.1, включающий четыре или пять указанных замен.3. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, включающий замену Н170К, H170Q или H170R.4. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, включающий замены, выбранные из группы, состоящей из Q70K+S159K, Q70K+H170K, Q90K+S159K, Q90K+H170K, T105K+S159K, Т105К+Н170К, Q120K+S159K, Q120K+H170K, T133K+S159K, Т133К+Н170К, S159K+H170K, Q70K+Q90K+S159K, Q70K+Q90K+H170K, Q70K+T105K+S159K, Q70K+T105K+H170K, Q70K+Q120K+S159K, Q70K+Q120K+H170K, Q70K+T133K+S159K, Q70K+T133K+H170K, Q70K+S159K+H170K, Q90K+T105K+S159K, Q90K+T105K+H170K, Q90K+Q120K+S159K, Q90K+Q120K+H170K, Q90K+T133K+S159К, Q90K+T133K+H170K, Q90K+S159K+H170K, T105K+Q120K+S159K, T105K+Q120K+H170K, T105K+T133K+S159K, Т105К+Т133К+Н170К, T105K+S159K+H170K, Q120K+T133K+S159K, Q120K+T133K+H170K, Q120K+S159K+H170K, T133K+S159K+H170K, Q70K+Q90K+T105K+S159К, Q70K+Q90K+T105К+Н170К, Q70K+Q90K+Q120K+S159K, Q70K+Q90K+Q120K+H170K, Q70K+Q90K+T133K+S159К, Q70K+Q90K+T133К+Н170К, Q70K+Q90K+S159К+Н170К, Q70K+T105K+Q120K+S159К, Q70K+T105K+Q120K+H170K, Q70K+T105K+T133K+S159К, Q70K+T105К+Т133К+Н170К, Q70K+T105K+S159К+Н170К, Q70K+Q120K+T133K+S159K, Q70K+Q120K+T133K+H170K, Q70K+T133K+S159K+H170K, Q90K+T105K+Q120K+S159K, Q90K+T105K+Q120K+H170K, Q90K+T105K+T133K+S159К, Q90K+T105K+T133K+H170K, Q90K+T105K+S159К+Н170К, Q90K+Q120K+T133K+S159K, Q90K+Q120K+T133K+H170K, Q90K+Q120K+S159K+H170K, Q90K+T133K+S159К+Н170К, T105K+Q120K+T133K+S159K, T105K+Q120K+T133K+H170K, T105K+Q120K+S159K+H170K, T105K+T133K+S159K+H170K и Q120K+T133K+S159K+H170K.5. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, включающий замены, выбранные из группы, состоящей из K16R+K34R, K16R+K40R, K34R+K40R, и K16R+K34R+K40R.6. Полипептидный конъюгат по п.5, включающий замены K16R+K34R+K40R и включающий остаток лизина в положении 23.7. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, в котором аминокислотная последовательность полипептида отличается на вплоть до 10 аминокислотных остатков от SEQ ID NO:1.8. Полипептидный конъюгат по п.7, в котором аминокислотная последовательность полипептида отличается на вплоть до 8 аминокислотных остатков от SEQ ID NO: I.9. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, в котором остатки полиэтиленгликоля присоединены к, по меньшей мере, одному остатку лизина и к N-концевой аминогруппе.10. Полипептидный конъюгат по п.1, в котором полипептид содержит замены K16R, K34R, K40R, Т105К и S159K относительно аминокислотной последовательности hG-CSF, приведенной в SEQ ID NO: 1, и который содержит 2-6 остатков полиэтиленгликоля с молекулярным весом около 1000-10000 Да, присоединенных к связующим группам полипептида.11. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, который гликозилирован по Т 133.12. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, содержащий 3-5, 4-6,
3-4, 4-5 или 5-6 присоединенных остатков полиэтиленгликоля.
13. Полипептидный конъюгат по п.12, содержащий 3-6 присоединенных остатков полиэтиленгликоля с молекулярным весом около 5000-6000 Да.14. Полипептидный конъюгат по п.13, содержащий 4-5 присоединенных остатков полиэтиленгликоля примерно в 5 кДа.15. Полипептидный конъюгат по п.13, содержащий 3 присоединенных остатка полиэтиленгликоля примерно в 5 кДа.16. Полипептидный конъюгат по любому из пп.1 или 2, обладающий биоактивностью in vitro в диапазоне около 2-30% от биоактивности неконъюгированного hG-CSF при определении методом определения активности G-CSF in vitro, описанным в настоящем изобретении.Приоритет по пунктам:
11.07.2001 - пп.5-9, 11 и 16;22.03.2002 - пп.13-14;08.05.2002 - пп.1, 10, 12 и 15;10.07.2002 - пп.2-4.
