Данное изобретение относится к композиции для покрытия имплантируемого медицинского устройства, которая включает, по меньшей мере, один полимер и, по меньшей мере, одно биологически активное вещество.
Различные композиции для покрытия имплантируемых медицинских устройств и способы нанесения покрытия на такие устройства достаточно хорошо известны в данной области техники.
Имплантируемые медицинские устройства с нанесенным покрытием используют, например, в качестве заменителей кожи, костей или хрящей, и они имеют очень важное значение в качестве протезов для сосудистой хирургии.
Протезы указанных типов имплантируют в просвет организмабольного, например в кровеносный сосуд, с целью заменить участки указанных сосудов, чтобы обеспечить протекание соответствующих жидкостей на определенном участке, например в случае протезов сосудов, или с целью расширить сосуды и поддерживать их в открытом состоянии открытыми с помощью так называемого стента. В таких случаях протезы, которые обычно имеют цилиндрическую форму, поддерживают выстилку сосуда и предотвращают разрушение сосудов или блокирование выстилкой прохода через сосуды. Материалы, которые обычно применяют для изготовления протезов, представляют собой, например, синтетические материалы, такие как переплетенные нити полиэтилентерефталата (PET) или вспененного политетрафторэтилена (ePTFE), но, кроме того, используют также различные металлы.
Нет необходимости проводить инвазивное хирургическое вмешательство в каждом случае сужения или окклюзии сосуда (стеноза). Даже в случаях окклюзии коронарных сосудов сердца во многих случаях можно избежать операции на «открытом» сердце, используя протез, который вводят через сосуды (интраваскулярно). Для этой цели, например, через вену вводят катетер, на кончике которого имеется надувной баллон и способный увеличиваться в размерах механический каркас для сосуда (стент), до места сужения сосуда. Сосуд и стент одновременно расширяются накачиванием баллона, следовательно, таким образом кровоток через сужение сосуда опять становится возможным.
Указанное, до некоторой степени принудительное, расширение связано с повреждением сосуда. Сосуд удерживается от разрушения жестким стентом. Даже если стент имеет очень редкосетчатую структуру в развернутом состоянии, имеется множество точек соприкосновения поврежденной стенки сосуда с жесткими материалами каркаса. В результате возникают две следующие проблемы.
Все повреждения сосудов вызывают тромбогенные эффекты. В результате активации тромбоцитов веществом сосуда под эндотелием в просвете происходит образование тромба, который, предположительно предотвращает кровотечение. Инородные поверхности, такие как металлы и пластмассы, из которых изготавливают стенты, также обладают тромбогенным действием и могут из-за образования тромба опять привести к окклюзии сосудов (рестенозу) за короткий период времени.
Во время лечения сосуда, который поврежден при расширении, кроме того, имеет место образование рубцов, особенно там, где имеется постоянное давление на регенерирующую ткань в местах, на которые давит жесткий стент. Избыточная пролиферация рубцовой ткани приводит к рестенозу приблизительно в 30% всех случаев использования стентов, не имеющих покрытия, после относительно длительного времени.
Покрытие для стента, которое должно быть жестким, как и материал для каркаса, предназначено для того, чтобы устранить обе угрозы возникновения рестеноза - кратковременный риск из-за тромба и длительную опасность из-за пролиферации рубцовой ткани.
К решению указанных проблем, а именно к предотвращению коагуляции и пролиферации и предотвращению активации тромбоцитов, в предшествующем уровне техники имеются различные подходы. Такими научными решениями, например, являются покрытия стентов, которые предназначены для повышения гемосовместимости. Например, в течение относительно длительного времени в покрытиях стентов применяют антикоагулянты, противовоспалительные или антипролиферативные средства, которые обычно называют "биологически активными" веществами. Подразумевается, что указанные вещества высвобождаются из материала покрытия стента таким образом, что предотвращают воспаление окружающей ткани, избыточный рост гладкомышечных клеток или точечной коагуляции крови.
В патенте США № 5788979 излагается способ покрытия биосовместимого вещества, которое вступает в соприкосновение с кровью больного, причем композиция для покрытия предназначена для того, чтобы предотвратить коагуляцию крови за счет биоматериала. В данном способе рассасывающийся материал, который совместим с кровью и тканями человеческого организма, сначала получают в жидком состоянии, а затем в жидкий рассасывающийся материал вводят антикоагулирующую композицию. Таким путем получают жидкий материал для покрытия, который можно наносить на биосовместимый материал непрерывно и затем сушить. Данным способом и с указанными материалами можно получать слои покрытия толщиной менее 100 мкм.
Кроме того, в патенте США № 5788979 сообщают, что рассасывающийся материал может представлять, в частности, рассасывающиеся синтетические полимеры, такие как, например, полимеры полигликолевых кислот, полимеры молочных кислот, полигидроксибутираты, полигидроксивалераты, полидиоксаноны, модифицированные крахмалы, целлюлозы и т.п.
Кроме того, предполагается, что, наряду с антикоагулирующей композицией, в покрытии могут находиться дополнительные вещества, такие как, например, противовоспалительные, антипролиферативные вещества и антибиотики. Примерами таких веществ, упомянутыми в патенте, являются дексаметазон, гентамицин и гирудин.
Недостатком указанных покрытий является то, что при применении антикоагулянтных композиций необходимо в высшей степени тщательно соблюдать дозу и тип введения, подходящие для каждого конкретного больного, так как указанные вещества всегда связаны с высоким риском острых кровоизлияний. Кроме того, после контакта с рекомбинантно продуцируемым гирудином у многих больных вырабатываются антитела против комплексов гирудин-тромбин, что делает антитромботическое действие данного вещества нерегулируемым. Применение глюкокортикоидов, таких как дексаметазон, вызывает особенно при относительно длительных периодах побочные эффекты в отношении белкового и углеводного метаболизма, которые обычно наблюдаются для указанных гормонов.
В патенте Германии № 19521642 описаны имплантаты, которые состоят, по меньшей мере частично, из рассасывающегося материала и которые содержат активное вещество - антибиотик в указанном рассасывающемся материале, где данное активное вещество высвобождается в окружающие ткани в результате разрушения фазы рассасывающегося материала. Активное вещество - антибиотик, упомянутое в данном патенте, конкретно представляет собой гентамицин.
Недостаток применения гентамицина состоит в том, что существуют большие индивидуальные колебания в его терапевтической и токсической концентрациях. Так, описаны побочные эффекты гентамицина, такие как нефротоксичность, неврональные блокады и, конкретно, вестибулярные и кохлеарные расстройства.
Соединениями, которые еще можно упомянуть в этой связи, являются цитостатики: таксол (паклитаксел) и рапамицин и их производные. Однако для них также из литературы известно множество побочных эффектов и осложнений при их применении в покрытиях для стентов, например высокая тромбогенность таксола (F. Liistro, A. Colombo, "Late acute thrombosis after paclitaxel eluting stent implantation", Heart, 86: 262-264 (2001)).
При применении рапамицина в качестве покрытия стента (США 2001027340) последние клинические исследования показали только ограниченное уменьшение рестеноза (исследования Cordis SIRIUS: 10% рестеноз). Кроме высокой токсичности, недостатками указанных цитостатиков являются химическая нестабильность и возникающие трудности с точной дозировкой. Так, в вышеупомянутом исследовании у некоторых больных также проявлялись симптомы передозировки (утоньшение стенок сосудов).
Дополнительная опасность, например, в случае стентов с нанесенным покрытием, известная в данной области техники, состоит в повреждении материала покрытия во время процессов, происходящих при адаптации стента к соответствующему сосуду, - расширений и сжатий. В связи с этим ухудшается покрытие и его функционирование и уменьшается высвобождение биологически активного вещества и его действие.
Существует, кроме того, необходимость проще и точнее регулировать доставку биологически активного вещества из покрытия в окрестности имплантата.
В WO 01/64214 описано применение ингибиторов топоизомеразы, таких, например, как камптотецин, антрациклины, и 1,4-нафтохинонов, таких как юглон, менадион и плюмбагин для лечения воспалительных заболеваний.
В WO 01/21326 описан способ получения полимера с несущей поверхностью, где композиция для покрытия может включать циклический дикетон, такой, например, как нафтохинон.
Несмотря на часто предлагаемые в предшествующем уровне техники различные рассасывающиеся материалы для покрытий и несмотря на множество композиций, обладающих антибиотическим, антимикробным или антикоагулянтным действием, которые были исследованы в связи с этим, рестеноз сосудов и реакции отторжения имплантатов остаются серьезной проблемой. Соответственно, несмотря на все сказанное, существует большая потребность в устройствах, которые могут, например, постоянно поддерживать сосуды в свободном состоянии и которые обеспечивают хорошую биорезорбцию.
Таким образом, цель данного изобретения состоит в том, чтобы получить покрытие, которое включает полимер с новым биосовместимым и биологически активным агентом, предпочтительно с оптимизацией механических свойств покрытия; в которое можно вводить определенные количества данного биологически активного вещества и просто регулировать его высвобождение из покрытия.
По данному изобретению указанная цель достигается композицией для покрытия, упомянутой в начале данного описания, в которой биологически активным веществом является нафтазарин и/или производное нафтазарина.
Таким путем полностью достигается цель данного изобретения.
Автор данного изобретения понимает, что можно, используя полимеры и конкретные производные нафтазарина в покрытии, получать имплантируемые медицинские устройства, которые обладают отличными механическими свойствами, т.е. могут противостоять как сжатиям, так и расширениям, и что введение производных нафтазарина не ухудшает механических свойств, вернее, данное вещество сохраняется как биологически активный агент.
Кроме того, автор данного изобретения понимает, что можно, применяя некоторые производные нафтазарина визуально проверять, успешно ли нанесено покрытие на имплантируемое медицинское устройство и в какой степени. Это осуществимо благодаря окрашиванию, свойственному некоторым производным нафтазарина: если покрытие содержит производное нафтазарина, то можно определить по окрашиванию, нанесено, не нанесено или частично нанесено покрытие на устройство.
Нафтазарин известен в данной области техники как базовая структура в многих природных пигментах, которые, кроме того, представляют собой и лекарственные средства. Применяя нафтазарин и/или производные нафтазарина, можно добиться двух полезных эффектов с помощью одного вещества. Во-первых, упомянутые природные продукты окрашены, так что можно визульно проверить, успешно ли осуществилось нанесение покрытия, и, во-вторых, они одновременно оказывают и лечебное воздействие, поэтому нет необходимости прибавлять в покрытие еще одно биологически активное вещество.
На фиг.lb показана основная структура нафтазарина. Нафтазарин, в свою очередь, считается производным 1,4-нафтохинона, основная структура которого представлена на фиг.la.
Производные нафтазарина в данном случае включают в себя все соединения, которые имеют основную структуру нафтазарина, а радикал R может, например, представлять собой любой алифатический радикал, который может быть ациклическим или циклическим, неразветвленным или разветвленным или находиться в замещенной (например, гидроксизамещенной) форме.
В еще одном варианте осуществления данного изобретения производное выбирают из группы, содержащей шиконин, алканнин, арнебин и их производные. Особенно предпочтительным в этой связи является шиконин.
Автор данного изобретения сумел показать в своих экспериментах, что можно предотвратить агрегацию тромбоцитов и фибробластов с помощью стентов, на которые нанесено покрытие с производным нафтазарина - шиконина.
Диапазон эффектов шиконина значительно шире, чем у соединений, ранее применявшихся в покрытиях, таких, например, как рапамицин или таксол. Шиконин, алканнин, их производные известны в течение некоторого времени как красные природные пигменты и в качестве лекарственных средств. Так, например, в обзорной статье Papageorgiou et al., "Chemie und Biologie von Alkannin, Shikonin und verwandten Naphthazarin-Naturstoffen", Angew. Chemie 111: 280-311, 1999, описаны биологические и фармакологические свойства данных веществ, которые известны для них в течение относительно длительного времени, и обсуждаются биоорганические, препаративные и медицинские аспекты; так, в статье цитируются другие публикации, в которых показано, что сам шиконин обладает противовоспалительным и антимикробным действием. Кроме того, в статье Papageorgiou et al. цитируется публикация, в которой описано антитромботическое действие нескольких производных нафтазарина, но указанное действие нельзя однозначно приписать семейству шиконина.
Доказано, что шиконин обладает противоопухолевым действием и представляет собой противогрибковое, противомикробное и ранозаживляющее средство. Цитостатики (например, рапамицин или таксол), используемые до настоящего времени, не обладают уникальным комплексом действия шиконина.
В работе Hisa et al., "Shikonin, an Ingredient of Lithospermum Erythrorhizon, Inhibits Angiogenesis in Vivo and in Vitro", Anticancer Res. 18: 783-790, 1998, показано, что шиконин способен ингибировать пролиферацию бычьих эндотелиальных клеток, что приводит к ингибированию ангиогенеза. Однако в упомянутой статье не указывается и не объясняется, могут ли шиконин или вещества, родственные шиконину, предотвращать пролиферацию фибробластов, особенно миофибробластов, пролиферация которых, как указано выше,связана срестенозом сосудов.
Результаты, полученные автором данного изобретения, являются неожиданными, если принимать во внимание статью Sakaguchi et al., "Granulomatous Tissue Formation of Shikon and Shikonin by Air Pouch Method", Biol. Pharm. Bull 24(6): 650-655, 2001, в которой объясняется, что шиконин стимулирует неоангиогенез. Наоборот, считается, что известные до недавних пор свойства шиконина препятствуют применению шиконина или других производных нафтохинона и нафтазарина в случаях, связанных с имплантируемым медицинским устройством. Автор данного изобретения был первым, кто сумел показать, что шиконин способен предотвращать агрегацию тромбоцитов и поэтому предотвращает как тромбозы, так и продолжительные рестенозы.
Ранее нафтазарины не предлагали вводить в покрытия имплантируемых медицинских устройств.
Кроме того, производные нафтазарина подходят для лучшей оценки кинетики высвобождения в динамике. Другие красители, например, не обладающие никакой биологической активностью, представляли бы собой просто дополнительные инородные вещества в покрытии и повышали бы риск возникновения аллергической и воспалительной реакции.
Соответственно, применение шиконина или других производных нафтазарина обеспечивает окончательную визуальную проверку того, нанесено ли покрытие на имплантат и насколько хорошо оно нанесено.
Такой проверке не препятствует тот факт, что композиция для покрытия также содержит некоторое число производных нафтазарина или в композицию для покрытия также включены еще и другие сопутствующие вещества, такие как, например, антикоагулянты и вещества с противомикробной и противовоспалительной активностью.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения композиция для покрытия содержит нафтазарин и/или производные нафтазарина, содержание которых составляет от 0,01 до 1% масс.
Кроме того, предпочтительно, если содержание нафтазарина и/или производных нафтазарина составляет величину, выбранную из группы, содержащей 0,04% масс., 0,05% масс., 0,06% масс., 0,07% масс., 0,08% масс., 0,09% масс., 1% масс.
Автор данного изобретатения сумел показать в своих экспериментах, что применение в покрытии от 0,1 до 1% масс. производного нафтазарина, особенно шиконина, подходит для создания достаточного эффекта, ингибирующего адгезию тромбоцитов и фибробластов.
В этой связи полимер может представлять собой биосовместимый полимер, из которого диффундирует биологически активное вещество, или рассасывающийся полимер, из которого активное вещество высвобождается при деструкции полимера.
В еще одном варианте осуществления изобретения предпочтительно, если полимер является рассасывающимся сложным полиэфиром и выбран, в частности, из группы, содержащей полигликолевую кислоту, полимолочную кислоту, поликапролактон, полигидроксиалканоаты и их сложные сополиэфиры.
Такие рассасывающиеся сложные полиэфиры и сополиэфиры достаточно хорошо известны в данной области техники, и доказано, что они полезны для применения, в частности, в медицине.
В этой связи особенно предпочтительно, если полигидроксиалканоат выбран из группы, содержащей полигидроксибутират, полигидроксивалерат и их сложные сополиэфиры.
Автор данного изобретения смог показать в своих экспериментах, что, в частности, сложные сополиэфиры полигидроксибутирата и полигидроксивалерата, как материалы для покрытия, обладают исключительно ценными свойствами. Покрытия из указанных сложных полиэфиров обладают отличными механическими свойствами и являются рассасывающимися. Кроме того, из опытов автора изобретения следует, что производное нафтазарина, включенное в указанный сложный сополиэфир, проявляет высокую биологическую активность.
Известно, что многие органические рассасывающиеся полимеры способны высвобождать активные вещества в течение некоторого периода времени. Однако многие материалы не подходят в качестве покрытия, так как они не являются полностью биосовместимыми. Так, например, в работе van der Giessen et al. "Marked Inflammatory Sequelae to Implantation of Biodegradable and Nonbiodegradable Polymers in Porcine Coronary Arteries", Circulation 94: 1690-1697, 1996, показано что полилактиды и другие полимеры, которые считаются биосовместимыми, вызывают воспалительные реакции тканей при разложении в организме.
Кроме того, известно, что многие рассасывающиеся полимеры не обладают подходящими механическими свойствами. Так, например, наличие кристаллических областей может привести к внезапному образованию трещин. По указанным причинам покрытие для имплантируемого механического устройства должно обладать специфическими механическими свойствами и выдерживать как сжатие, так и расширение, - например надувание катетера.
В еще одном варианте осуществления изобретения сложный сополиэфир содержит полигидроксивалерат, содержание которого составляет от 20 до 30% масс., предпочтительно 25% масс., и полигидроксибутират, содержание которого составляет от 70 до 80% масс., предпочтительно 75% масс.
Автор данного изобретения смог показать опытным путем, что данное соотношение является особенно подходящим для материала покрытия, так как при таком соотношении обеспечивается хорошая растворимость и одновременно достигаются отличные механические свойства.
Кроме того, предпочтительно в еще одном варианте осуществления изобретения, если рассасывающийся полимер и шиконин предпочтительно растворимы по меньшей мере в одном растворителе, предпочтительно диметилацетамиде и/или тетрагидрофуране.
Можно было показать, что механические и биологические свойства покрытия не ухудшаются при растворении активных компонентов в указанных растворителях.
Данное изобретение относится к способу покрытия имплантируемого медицинского устройства, содержащего стадии:
(а) нанесения новой композиции для покрытия на имплантируемое медицинское устройство,
(b) сушки имплантируемого медицинского устройства,
(с) повторения по необходимости стадий (a) и (b).
В одном из вариантов осуществления данного изобретения предпочтительно, если композицию для покрытия распыляют на имплантируемое медицинское устройство.
Для распыления можно использовать различные методики, которые достаточно хорошо известны в данной области техники.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения покрытие наносят путем погружения имплантируемого медицинского устройства в композицию для покрытия.
Способы нанесения покрытия повторяют до тех пор, пока не образуется слой покрытия нужной толщины на имплантируемом медицинском устройстве, например слой толщиной от 1 до 100 мкм.
Предпочтительный вариант осуществления способа нанесения покрытия на имплантируемое медицинское устройство по данному изобретению состоит в нанесении покрытия, которое включает сложный сополиэфир полигидроксибутират-полигидроксивалерат, в котором отношение полигидроксибутират : полигидроксивалерат составляет 3:1, и содержание шиконина составляет от 0,01 до 5% масс.
Автор данного изобретения понимает, что можно с помощью указанной композиции получить особенно подходящее покрытие, в котором, кроме оптимальных физических свойств также можно эффективно использовать двойную функцию шиконина - как красителя и как биологически активного вещества. Свойства шиконина - красителя и биологически активного вещества - сохраняются даже после введения его в покрытие по данному изобретению.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения в способе нанесения покрытия на имплантируемое медицинское устройство, в качестве устройства используют стент.
В связи с этим можно применять, например, стенты, которые включают в себя, по меньшей мере, один металл и/или один синтетический материал. Стенты указанных типов и способы нанесения покрытия на стенты указанных типов достаточно хорошо известны в данной области техники.
Однако это не препятствует тому, что покрытие из композиции для покрытия по данному изобретению можно нанести на имплантируемые медицинские устройства других типов. Так, например, также подходят имплантаты кожи, заменители хрящей и костей, которые могут иметь плоскую форму, форму прямоугольника, цилиндра или конфигурацию клапана.
Если в качестве имплантируемого медицинского устройства используют протез сосуда, его трубчатая конструкция может иметь любую форму, то есть, например, форму разветвленной или неразветвленной трубки и т.п.
Данное изобретение, кроме того, относится к применению новой композиции для покрытия, как указано выше, для нанесения покрытия на имплантируемые медицинские устройства.
Кроме того, данное изобретение относится к применению нафтазарина и/или производных нафтазарина, особенно шиконина, для получения композиции для покрытия имплантируемого медицинского устройства и к ее применению для нанесения покрытия на имплантируемое медицинское устройство.
Кроме того, изобретение относится к имплантируемому медицинскому устройству, на которое нанесена новая композиция для покрытия, как указано выше, и особенно к стентам.
Дополнительные преимущества очевидны из описания, которое приводится ниже.
Должно быть понятно, что признаки, упомянутые выше и которые будут объяснены ниже, могут быть использованы не только в комбинациях, упомянутых в каждом случае, но также и в других комбинациях или самостоятельно, не выходя за пределы объема данного изобретения.
Данное изобретение объясняется ниже более подробно на примерах применения и выполнения и с помощью чертежей.
На фиг.1а представлена формула 1,4-нафтохинона;
на фиг.lb показана общая формула базовой структуры производных нафтазарина.
Пример
1. Композиции, применяемые для покрытия
Указанные ниже полимерные композиции испытывали в качестве материалов для покрытия:
- композитное покрытие из нерассасывающегося полиуретана марки Elastollan (эластоллан) с шиконином и без шиконина;
- рассасывающийся сложный сополиэфир поли(β-гидроксибутират-со-β-гидроксивалерат) (далее обозначаемый P(HB-HV)) с содержанием полигидроксивалерата 12% масс.
- рассасывающийся сложный сополиэфирP(HB-HV)) с содержанием полигидроксивалерата 25% масс. с шиконином и без шиконина.
Испытываемыми растворителями были диметилацетамид (далее ДМАА) и тетрагидрофуран (далее ТГФ).
Из изложенного следует, что наиболее подходящей композицией является композиция, содержащая 25% масс. полигидроксивалерата (далее PHV) с 75% масс. полигидроксибутирата (далее PHB). Кроме того, композиция с таким соотношением с максимальной концентрацией до 1,5% масс. в обоих растворителях может быть растворена в обоих растворителях при нагревании.
В связи с этим рабочий раствор (I), содержащий P(HB-HV) с 25% масс. PHV, указанного ниже состава использовали для композиции для покрытия:
P(HB-HV): 1,5 г
ДМАА или ТГФ: 100 мл
Кроме этого чистого сополимера сложных эфиров, испытывали покрытие другого состава, а именно P(HB-HV) с содержанием PHV 25% масс., и содержащее шиконин. Рабочий раствор (II), используемый для этого, имел следующий состав:
P(HB-HV): 1,5 г
шиконин: от 15 до 75 мг
ДМАА или ТГФ: 100 мл
Испытания проводили, используя, во-первых, стенты (изготовленные из нержавеющей стали с электрополированной поверхностью, Translumina GmbH, Hechingen, Германия), с покрытием, нанесенным с помощью растворов I и II, и, во-вторых, полимерные пленки из указанных рабочих растворов I и II, отлитые в чашках Петри.
2. Исследования адгезии клеток и пролиферации клеток
a) Пленки из материала марки Elastollan
Материалы и способы
Испытывали пленки из материала марки Elastollan (эластоллан), содержащие 0,1 и 0,5% масс. шиконина, пленки из эластоллана (Elastollan) без шиконина.
Хотя Elastollan представляет собой не рассасывающийсяполимер, все же результаты, полученные с данным полимером, показывают, что шиконин активен в качестве ингибитора адгезии клеток и пролиферации клеток. Это означает, что в данном случае активный агент высвобождается в результате вымывания, а не разрушения матрицы эластоллана.
В упомянутых экспериментах использовали эмбриональные фибробласты человека. Клетки культивировали в среде Игла, причем прибавляли 10% фетальной телячьей сыворотки и пассировали два раза в неделю, используя раствор трипсин-EDTA. Для испытаний использовали клетки после 14-го пассирования. Митоцин С, растворенный в среде для культивирования в концентрации 20 мкг/мл, использовали в качестве отрицательного контроля.
Испытывали экстракты из пленок эластоллана, не содержащих шиконин, пленок эластоллана, содержащих 0,1% масс., 0,5% масс., 1% масс. и 5% масс. шиконина (в расчете на полиуретан), и чистый шиконин.
Экстракты получали инкубацией чашек, на которые наносили испытываемые полимеры (например, пленки эластоллана, содержащие или не содержащие шиконин), средой Игла при 37°C в течение 3 ч. Нерастворенные твердые вещества удаляли фильтрованием. Контроль, содержащий только шиконин (в культурной среде), культивировали в тех же условиях.
Соответствующие фильтраты использовали в качестве экстрактов для испытаний, причем pH экстракта эластоллана, содержащего шиконин, предварительно доводили 0,1N раствором HCl и таким же количеством фосфатного буфера, так как это было необходимо для регулирования рН экстрактов Elastollan/шиконин, которые добавляли к контрольному экстракту (Elastollan без шиконина) и к экстракту, содержащему только шиконин.
Параллельно порции (объемом 1 мл) суспензии клеток (фибробластов, см. выше), содержащие 4×104 клеток/мл, помещали в 24-луночные планшеты. После культивирования в течение 24 ч среду удаляли и прибавляли тестируемые экстракты (положительный контроль: свежая среда без экстрактов; отрицательные контроли: прибавление митомицина С в течение 2 ч).
Затем клетки промывали раствором Хэнкса и в лунки помещали свежую среду. Затем клетки инкубировали в течение 72 ч. После инкубирования клетки дважды промывали фосфатным буфером и инкубировали с 2,5% глутаровым альдегидом при 4°С в течение 30 мин. Затем клетки опять дважды промывали и окрашивали по Гимзе при 37°С во влажной атмосфере в течение 3 ч.
Краситель, удерживаемый клетками, элюировали смесью фосфатный буфер/спирт (1:1) при комнатной температуре в течение 15 мин. Оптическую плотность полученных растворов определяли на спектрофотометре с длиной волны 620 нм.
Результаты
В положительном контроле (исследуемый экстракт: только культурная среда), фибробласты покрывали почти всю поверхность лунки и показывали удлиненную форму и типичную картинуроста.
В отрицательном контроле (исследуемый экстракт: культурная среда + митомицин С) не наблюдали роста клеток. Плотность клеток была низкой и соответствовала плотности на второй день эксперимента. Клетки имели удлиненную форму, но не соприкасались друг с другом. Некоторые клетки были округленными или лизированными.
Рост клеток на экстракте только из эластоллана был аналогичен росту клеток на положительном контроле. При использовании шиконинсодержащих экстрактов эластолана можно было наблюдать ингибирующий и даже цитотоксический эффекты: некоторые клетки были слипшимися, большая часть клеток была округлена.
Данный тест показывает, что шиконин и экстракты из пленок эластоллана, содержащего шиконин, обладают ингибирующим действием на клетки человека in vitro.
b) Адгезия эмбриональных фибробластов легких человека к пленкам из эластоллана и из шиконинсодержащего эластоллана in vitro
Для данного теста использовали чашки Петри, на которые наносили пленки из растворов из эластоллана и из шиконинсодержащего эластоллана. Концентрация шиконина в образцах полиуретана составляла 0,01% масс., 0,05% масс. и 0,5% масс. (в расчете на полиуретан). В качестве положительного контроля использовали чашку Петри из пластмассы.
Клетки высевали на поверхность чашек Петри, покрытую полимерными композициями в концентрации 4×104 клеток/мл в среде Игла с 10% фетальной телячьей сывороткой. Количество слипшихся фибробластов подсчитывали после инкубирования при 37°C в течение 0,5 ч и 2 ч.
Результаты
Полученные подсчеты приведены в таблице I
Как очевидно из таблицы при сравнении с положительным контролем, шиконин в концентрации 0,5% масс. в пленках полимера марки Elastollan ингибирует адгезию фибробластов практически полностью.
Таблица I
(0,01% масс.)
(0,05% масс.)
(0,5% масс.)
с) Адгезия тромбоцитов на пленках сложного сополиэфира P(HB-HV) и на пленках (P(HB-HV)-Sh) сложного сополиэфира P(HB-HV), содержащего шиконин, и на стентах с покрытием из этих пленок
Известно, что адгезия тромбоцитов к биоматериалам отражает совместимость медицинских устройств с кровью в зависимости от активации клеток крови и тканей.
Предполагают, что адгезия происходит через множество стадий: сначала тромбоциты связываются с поверхностью, затем активируются и создают псевдоподы, а затем они развертываются и образуют агрегаты. Последующее высвобождение внутриклеточных компонентов, включая факторы свертывания крови, стимулирует адгезию и агрегацию дополнительных тромбоцитов.
Кроме того, считают, что инфильтрация активно пролиферирующих миоцитов из сред в интиму, сопровождаемая продуцированием распространенных внеклеточных матричных компонентов (коллагена, протеоаминогликанов), является основным механизмом рестеноза. Немедленное оседание тромбоцитов в месте повреждения сосуда и последующее высвобождение миопролиферативных веществ (например, фактора роста (PDGF), β-трансформирующего фактора (β-TGF), эндотелиального фактора роста (EDGF) и т.п.), вероятно, представляют собой стимулирующие факторы.
Таким образом, адгезия тромбоцитов во время имплантации стента играет главную роль как в развитии тромбоза, так и в отношении рестеноза.
Состояние активации прилипших тромбоцитов можно оценивать по их морфологии. Более сильное действие материала на тромбоциты дает в результате более слипшиеся клетки, причем они распределяются или агрегируются на поверхности материала.
В данном тесте испытывали как стенты без покрытия, так и стенты с нанесенным покрытием из P(HB-HV)-Sh. Средняя толщина слоя покрытия составляла приблизительно 15-20 мкм.
Для нанесения покрытия на стенты использовали следующие растворы:
- 0,75% P(HB-HV) с 25% HV в ДМАА или ТГФ;
- 0,75% P(HB-HV) с 25% HV + 0,5% масс. шиконина (в расчете на массу P(HB-HV)) в ДМАА или ТГФ;
- 0,75% P(HB-HV) с 25% HV + 1% масс. шиконина (в расчете на массу P(HB-HV)) в ДМАА или ТГФ.
Покрытия на стенты наносили несколько раз погружением в различные растворы или распылением. Время сушки между отдельными стадиями распыления составляло от 2 до 15 мин. Окончательно стенты сушили при температуре 45-50°С в течение 30 мин. Общее количество шиконина на стентах с напыленным покрытием из P(HB-HV)-1,0 Sh составляло от 2 до 4 мкг.
Оказалось, что покрытие стентов из шиконина устойчиво в расширенном состоянии в течение 28 дней.
Кроме того, полимерные пленки из указанных растворов (P(HB-HV), содержащие или не содержащие шиконин) испытывали в планшетах из нержавеющей стали из тех же растворов с толщиной слоя от 20 до 30 мкл. Поверхность стента, на который не нанесено покрытие, служит контролем.
Подготовка крови
Цельную кровь здоровых взрослых доноров помещали в силиконизированные стеклянные сосуды. Свертывание 10 мл крови предотвращали прибавлением цитрата натрия в соотношении (кровь: цитрат натрия) 9:1. Обогащенную тромбоцитами плазму получали центрифугированием цельной крови при 100×g в течение 20 мин при комнатной температуре. Обогащенную тромбоцитами фракцию плазмы удаляли пластиковой пипеткой и сразу же использовали в экспериментах.
Капли (50 мкл) полученной фракции плазмы, обогащенной тромбоцитами, помещали на поверхности образцов в планшете и инкубировали в течение 15 мин. Для испытания стентов с нанесенным покрытием их помещали в сосуд с обогащенной тромбоцитами плазмой и инкубировали в течение 30 мин. Количество тромбоцитов, прилипших к поверхности за указанное время, было достаточным для анализа, так как тромбоциты не образовывали больших тромбоподобных структур. Образцы промывали физиологическим раствором для того, чтобы отмыть от неадсорбированных белков плазмы и слабо прилипших тромбоцитов. Образцы затем фиксировали в 2,5% глутаральдегиде, и затем дегидратировали по обычным методикам с увеличением содержания этанола.
Адгезию тромбоцитов исследовали методом сканирующей электронной микроскопии (SEM) (на приборе JSM T330, JEOL, Япония). Все образцы делали проводящими путем нанесения меди (1,2 кВ, 10 мА, 7 мин) (JEOL JFC-1100, Япония). Исследования микроскопией проводили при напряжении 5 кВ, 25 участков, каждый размером 400 мкм2, выбраны беспорядочно для каждого образца. Затем оценивали количественно общее число тромбоцитов Ntot и число тромбоцитов NI следующих двух категорий клеток, которые непосредственно отражали активацию тромбоцитов. Каждая категория включала два морфологических класса слипшихся тромбоцитов:
Ia) одиночные, неактивированные или слабо активированные деформированные клетки;
Ib) клетки, образующие псевдоподы, или клетки на ранней стадии рассеивания.
IIa) полностью рассеянные тромбоциты;
IIb) агрегаты (из двух или более тромбоцитов).
Что касается вышеупомянутой классификации, тромбоциты категории I только слабо взаимодействуют с поверхностью; в отличие от них имеет место сильное взаимодействие между тромбоцитами категории II и поверхностью.
Результаты
a) Нанесение покрытия из 0,75% масс. раствора P(HB-HV) в ДМАА и раствора P(HB-HV) + шиконин в ДМАА
Количество клеток на стентах, не имеющих покрытия, оказалось очень низким, и там, где имелись прилипшие тромбоциты, практически все клетки были полностью распределены на стенте, не имеющем покрытия. Общее число клеток на пленке P(HB-HV) было выше, чем на контроле, и все морфологические классы клеток присутствовали на указанной поверхности, но число агрегатов оказалось очень низким.
Введение шиконина, наоборот, позволяло явно уменьшать количество прилипших тромбоцитов по сравнению с пленками только из P(HB-HV). В данном случае можно было наблюдать только два морфологических класса клеток категории I: слабо активированные тромбоциты и клетки, образующие псевдоподы.
На основании полученных результатов очевидно, что пленки P(HB-HV)-Sh больше подходят, чем пленки из чистого P(HB-HV), так как поверхности, содержащие шиконин, проявляют более низкое сродство к связыванию клеток.
Для того чтобы определить связь между активацией тромбоцитов и концентрацией шиконина, определяли адгезию тромбоцитов к пленкам чистого P(HB-HV), P(HB-HV), содержащего 0,1% масс. шиконина (P(HB-HV)-0,1Sh), и P(HB-HV), содержащего 0,5% масс. шиконина (P(HB-HV)-0,5Sh), для времени инкубирования 15 мин и 30 мин. Было можно продемонстрировать таким образом, что прибавление шиконина может уменьшить количество тромбоцитов и степень их активации.
b) Нанесение покрытия с 0,75% масс. раствором P(HB-HV) в ТГФ и с раствором P(HB-HV) + шиконин в ТГФ
Покрытия наносили как многослойные пленки на расширенные и нерасширенные стенты. Стенты покрывали полимером путем погружения в разбавленный рабочий раствор полимера (примерно 2-4 раза). Затем каждый слой сушили горячим воздухом.
Проводили сравнительный анализ адгезии тромбоцитов к стенту, не имеющему покрытия, к стенту с алмазоподобным углеродным покрытием и к стенту, на который нанесено покрытие P(HB-HV)-0,5Sh. Время инкубирования образцов в обогащенной тромбоцитами плазме составляло от 15 до примерно 30 мин.
На стентах с покрытием из P(HB-HV)-0,5Sh не наблюдали тромбоцитов. Однако в то же время, можно было обнаружить тромбоциты на стентах, не имеющих покрытия, и на стентах с углеродным покрытием. Это означает, что свойства шиконина в отношении активации тромбоцитов сохраняются и при использовании ТГФ в качестве растворителя.
с) Сравнение покрытия из полимера (P(HB-HV)-1,0Sh), содержащего 1% масс. шиконина с алмазоподобным углеродным покрытием (DLC)
Сравнительный анализ стентов с покрытием, содержащим 1% масс. шиконина, со стентами с DLC-покрытием выявил, что в случае стентов с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh in vitro практически отсутствуют тромбоциты, прилипшие к стентам.С другой стороны, было обнаружено несколько рассеянных тромбоцитов на стентах с DLC-покрытием.
3. Определение биологических свойств полученных пленок
Данные исследования проводили в соответствии с международным стандартом биологических исследований на медицинских устройствах ISO 10993 и в соответствии с национальным стандартом ГОСТ Р ИСО 10993.
а) Определение гемолитических свойств
Гемолиз определяли получением экстрактов материалов, конкретно P(HB-HV) и P(HB-HV)-0,5Sh, в физиологическом растворе в каждом случае. К полученным экстрактам прибавляли цельную кровь, затем инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Экстракты удаляли, смесь центрифугировали (50 мин при 400×g) и осторожно удаляли бесклеточный супернатант. Концентрацию гемоглобина для указанного супернатанта определяли фотометрически и гемолитический индекс (%) рассчитывали из отношения выделившегося гемоглобина к гемоглобину присутствующему. В качестве контроля в данном случае использовали чистый физиологический раствор.
Оказалось, что в данных условиях оба экстракта, а именно экстракт P(HB-HV) и экстракт P(HB-HV)-Sh, являются негемолитическими (гемолитический индекс: 0%).
b) Определение активации системы комплемента
Совместимость полимерных пленок с кровью проверяли определением гемолитической активности системы комплемента плазмы крови человека до и после ее инкубирования образцом пленки или экстрактом. Испытываемыми образцами были пленки P(HB-HV), P(HB-HV)-Sh и купрофана (контроль).
Концентрация гемоглобина, выделившегося из-за литического воздействия системы комплемента эритроцитов овцы, покрытых антителами, отражает активность комплемента в образце сыворотки. Параметром для анализа было время, которое требуется для того, чтобы 100 мкл анализируемой сыворотки (τ1/2) лизировало 50% 5 мл чувствительных эритроцитов овцы (5×108 клеток/мл). Температуру реакционной смеси поддерживали постоянной 37°С, используя термостат.
Сыворотку человека сначала разбавили буфером (содержащим 0,15 ммоль CaCl2 и 0,5 ммоль MgCl2) и затем инкубировали с образцами полимера или без образцов полимера при 37°C в течение 60 мин. Величины остающейся активности комплемента ((CH50)R %) определяли в качестве критерия активирующих свойств полимеров следующим образом:
(СН50)R i = (τ1/2)0/(τ1/2)(t)i(с) 100%
где (τ1/2)0 представляет собой время 50% лизиса эритроцитов овцы комплементом сыворотки до инкубирования образцом;
(τ1/2)(t)i представляет собой время 50% лизиса эритроцитов овцы комплементом сыворотки после инкубирования образцом полимера в течение времени t;
(τ1/2)(t)(с) представляет собой время 50% лизиса эритроцитов овцы комплементом сыворотки после инкубирования в течение времени t в контроле (без образца полимера).
Результаты проведенных испытаний суммированы в таблице II.
Таблица II
Из данных таблицы II очевидно, что активность комплемента сыворотки, инкубированной экстрактом P(HB-HV)-Sh, оказалась ниже, чем активность комплемента сыворотки, инкубированной экстрактом чистого P(HB-HV). Кроме того, значение CH50 приблизительно то же, что и для купрофана.
c) Тесты на высвобождение ATP
В еще одном сравнительном анализе исследовали стенты с покрытием из DLC и стенты с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh. Для этой цели использовали свежую обогащенную тромбоцитами плазму человека (PRP). Стенты инкубировали 450 мкл PRP при 37°C в течение 5 мин. Измеряли агрегацию тромбоцитов и способность к секреции методом биолюминесценции, используя высокочувствительный LUMI-AGREGOMETER (CHRONO-LOG Corp., США).
Показано, что стенты с покрытием, содержащим шиконин, не изменяют функциональный статус тромбоцитов (в отношении высвобождения ATP), тогда как стенты с DLC-покрытием из DLC ингибируют высвобождение ATP.
d) Тест внутримышечной имплантации
1. Пленки чистого P(HB-HV) и P(HB-HV)-Sh имплантировали в соответствии со стандартом ИСО 10993 (часть 6) в мышцы морскихсвинок. Размер образцов пленки был 0,5×1 см и толщина 20-30 мкм. Каждый тип образца испытывали на двух морских свинках, за которыми наблюдали в течение 7 дней.
Через 7 дней было показано, что вокруг пленок P(HB-HV) и P(HB-HV)-Sh образовались монослои фибробластов. Оказалось, что инфильтрация макрофагов и лимфоцитов вокруг указанных имплантатов является обычной реакцией тканей в течение 7 дней после имплантации. Тем не менее, можно показать, что степень воспалительной реакции на рассасывающийся полимер, содержащий шиконин, была меньше, чем на пленку чистого P(HB-HV).
2. Взрослых крыс-самцов линии Wistar (массой 230-250 г) разделяли на две группы: животным группы А (n=6) имплантировали стенты с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh, а животным группы В (n=4) имплантировали стенты с алмазоподобным покрытием (DLC стенты) в качестве контроля. Стенты оставляли имплантированными подкожно в спину крысы в течение 2 и 6 недель для последующего макроскопического и микроскопического определения субхронических (кратковременных) эффектов (для каждого отдельного периода n=3 для группы A и n=2 для группы B). Животных анестезировали натрийтиопенталом и после завершения экспериментов умервшляли передозировкой данного вещества.
Для гистологических исследований имплантаты с окружающей тканью фиксировали в 12% формальдегиде, заключали в желатин и делали срезы алмазным лезвием.
Гистологические и макроскопические исследования показали, что в обеих группах нельзя было наблюдать никаких хронических воспалительных реакций на инородное тело, но в стентах с покрытием из DLC определили значительное число макрофагов и некоторых углеродных частиц в окружающей ткани. Фиброзная капсула, которая образовалась вокруг стентов была значительно тоньше в случае стентов с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh, чем у стентов с покрытием из DLC.
В целом, стабильность и биосовместимость стентов с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh выше, чем у стентов с покрытием из DLC.
В дополнительных экспериментах стенты имплантировали в аорту кошек. Для этой цели подопытных животных разделили на две группы: животные группы А (n=2) получали стенты с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh, животные группы В (n=2) - стенты c DLC-покрытием. Взрослых кошек-самок (массой 2,5-3,5 кг) анестизировали внутримышечно 5-процентным раствором кетамина (0,65 мг/кг) и 0,25-процентным раствором дроперидола (0,1 мг/кг). Стенты имплантировали в брюшную часть аорты. Никаких дополнительных антикоагулянтов не вводили.
Через 18-24 дня после имплантации животных анестезировали, удаляли сегменты аорты, фиксировали в 10% формалине и дегидратировали. Сегменты, содержащие стент, заключали в метилметакрилат и делали срезы алмазным лезвием.
В обеих тест-группах не наблюдали острой тромботической окклюзии или роста фиброзной соединительной ткани в просвете. Гистологические исследования показали, что имеется несколько углеродных частиц и относительно большое число макрофагов в стенке аорты, окружающей стенты с покрытием из DLC. Через 24 дня после имплантации наблюдалось образование неоинтимы в случае стентов с покрытием из P(HB-HV)-1,0Sh. Она имела более регулярное расположение, чем в случае стентов с DLC-покрытием. Не наблюдалось никаких признаков острого или хронического воспаления.
Сущность изобретения
На основании полученных результатов может быть показано, во-первых, что композиция, содержащая 25% масс. полигидроксивалерата и 75% масс. полигидроксибутирата, оказалась оптимальной композицией для покрытия, и что указанная смесь с конкретным содержанием шиконина проявляет высокую адгезию к металлическим поверхностям. Кроме того, показано, что на свойства полимерного покрытия не влияет многократное расширение стента с нанесенным покрытием.
Кроме того, можно было показать, что концентрация шиконина до 5% масс. практически полностью ингибирует адгезию тромбоцитов человека к поверхности полимеров in vitro. Следовательно, шиконин (в приемлемых концентрациях) можно использовать для предотвращения пролиферации клеток.
Сравнительное изучение биологических свойств пленки чистого P(HB-HV) или пленки P(HB-HV)-Sh в ТГФ in vitro показало, что шиконин обладает хорошей совместимостью в отношении активации комплемента и адгезии тромбоцитов.
Полученные результаты дополнительно показывают, что после нанесения на стент покрытия P(HB-HV)-Sh вокруг него образуется гладкий тонкий фиброклеточный слой, что приводит к повторной эндотелизации, причем диаметр подходит для нормального кровотока.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ШОВНЫЙ МАТЕРИАЛ С АНТИТРОМБОТИЧЕСКИМ ПОКРЫТИЕМ | 2013 |
|
RU2555502C2 |
| Покрытие для имплантируемых медицинских изделий, способ приготовления и нанесения покрытия | 2022 |
|
RU2814661C1 |
| ГРУНТОВКА-УСИЛИТЕЛЬ АДГЕЗИИ ДЛЯ ПОВЕРХНОСТЕЙ С ПОКРЫТИЕМ | 2009 |
|
RU2522390C2 |
| ПОКРЫТИЕ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО УСТРОЙСТВА, ВКЛЮЧАЮЩЕЕ АНТИТРОМБОТИЧЕСКИЙ КОНЪЮГАТ | 2008 |
|
RU2472529C2 |
| ЗАХВАТ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ ЭЛЮИРУЮЩИМ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ИМПЛАНТИРУЕМЫМ МЕДИЦИНСКИМ УСТРОЙСТВОМ | 2006 |
|
RU2400256C2 |
| СПОСОБ НАНЕСЕНИЯ СПЛОШНОГО ПОКРЫТИЯ НА СТЕНТ И СТЕНТ, ПОЛУЧЕННЫЙ НАЗВАННЫМ СПОСОБОМ | 2006 |
|
RU2458708C2 |
| АНТИМИКРОБНЫЕ/АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕДИЦИНСКИЕ УСТРОЙСТВА, ПОКРЫТЫЕ ТРАДИЦИОННЫМИ СРЕДСТВАМИ КИТАЙСКОЙ МЕДИЦИНЫ | 2009 |
|
RU2524635C2 |
| БИОИНТЕГРИРУЕМЫЙ КОМПОЗИТНЫЙ МАТЕРИАЛ И СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ПОКРЫТИЯ НА ИЗДЕЛИЯХ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОИНТЕГРИРУЕМОГО КОМПОЗИТНОГО МАТЕРИАЛА | 2013 |
|
RU2535067C1 |
| СТИМУЛИРУЮЩАЯ АДГЕЗИЮ ВРЕМЕННАЯ МАСКА ДЛЯ ПОКРЫТЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ | 2009 |
|
RU2526885C2 |
| ПОКРЫТИЕ СТЕНТА | 2008 |
|
RU2380059C1 |
Изобретение относится к медицине, в частности к композиции для покрытия имплантируемого медицинского устройства, которая содержит, по меньшей мере, один полимер и, по меньшей мере, одно биологически активное вещество, например нафтазарин и/или производное нафтазарина, в частности шиконин. Устройства с нанесенным покрытием используют в качестве заменителей кожи, костей или хрящей, и они имеют важное значение в качестве протезов для сосудистой хирургии. 8 н. и 14 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.
(a) нанесения композиции для покрытия по любому из пп.1-11 на имплантируемое медицинское устройство,
(b) сушки имплантируемого медицинского устройства.
(a) нанесения композиции для покрытия по любому из пп.1-11 на имплантируемое медицинское устройство,
(b) сушки имплантируемого медицинского устройства,
(c) повторения стадий (а) и (b), по меньшей мере, один раз.
| СТЕНТ | 1993 |
|
RU2089131C1 |
| Регулятор уровня воды в дренажной сети | 1974 |
|
SU496349A1 |
| СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАН | 1995 |
|
RU2071788C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (СО)ПОЛИМЕРА ВИНИЛХЛОРИДА | 1985 |
|
RU2012565C1 |
