СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N11/08 C12N9/20 

Предлагаемое изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для очистки животноводческих отходов и сточных вод.

Способ получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите (патент США №5667634, публ. 16.09.1997, МКИ D21C 9/08).

Однако липаза, полученная известным способом, недостаточно эффективна при высоких температурах ее использования.

Техническим эффектом предлагаемого изобретения является повышение активности целевого продукта при высоких температурах.

Технический эффект достигается в предлагаемом способе получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите тем, что в качестве полиэлектролита используют полистиролсульфонат натрия, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:полистиролсульфонат натрия 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут.

Известно использование пленки полистиролсульфоната натрия как селективной, ультратонкой перегородки для переноса анионов (Layered polyelectrolyte films as selective, ultrathin barriers for anion transport. Harris Jeremy J., Stair Jacqueline L., Bruening Merlin L. Chem. Mater. 2000. 12, №7, с.1941-1946).

В научно-технической литературе неизвестно техническое решение, аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения "новизна".

Полученная согласно предлагаемому способу иммобилизованная липаза может быть использована для очистки животноводческих отходов и сточных вод, т.е. "промышленно применима".

Впервые предложено использование полиэлектролита полистиролсульфоната натрия при определенном авторами массовом соотношении для повышения активности липазы, используемой при высокой температуре субстрата. Авторами впервые показано, что взаимодействие полиэлектролита полистиролсульфоната натрия и липазы приводит к изменению конформации липазы за счет препятствия разворачивания полипептидной цепи и стабилизации каталитически выгодной конформации липазы и, по-видимому, открытию активных центров фермента, т.е. предложение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. К 1 мг полистиролсульфоната натрия добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полистиролсульфонат натрия 1:1). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 7,6, при температуре 18°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60 и 80°С. В результате активность иммобилизованной липазы составила 755 и 2677 единиц относительной активности липазы при 60 и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 ед. активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 7,5-26,7 раза.

Пример 2. К 10 мг полистиролсульфоната натрия добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полистиролсульфонат натрия 1:10). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 8,2, при температуре 24°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60 и 80°С. В результате активность иммобилизованной липазы составила 1083 и 722 единиц относительной активности липазы при 60 и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 ед. активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 7,2-10,8 раза.

Пример 3. Далее к 1 мг полистиролсульфоната натрия добавляют 1 мг липазы, из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полистиролсульфонат натрия 1:1). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 7,6, при температуре 18°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60 и 80°С. В результате активность липазы составила 202 и 205 единиц относительной активности липазы при 60 и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 ед. активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 2 раза.

Пример 4. К 10 мг полистиролсульфоната натрия добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полистиролсульфонат натрия 1:10). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 8,2, при температуре 24°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60 и 80°С. В результате активность липазы составила 1298 и 1500 единиц относительной активности липазы при 60 и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 ед. активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 13-15 раз.

Пример 5. К 50 мг полистиролсульфоната натрия добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полистиролсульфонат натрия 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 15 минут при рН 7,9, при температуре 21°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60 и 80°С. В результате активность липазы составила 377 и 1483 единиц относительной активности липазы при 60 и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 ед. активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 3,7-14,8 раз.

Таким образом, заявленный способ получения липазы позволяет в 2-26 раз увеличить ферментативную активность целевого продукта в сравнении с известным способом /прототипом/.

Изобретение относится к биотехнологии. Для иммобилизации липазы в качестве полиэлектролита используют полистиролсульфонат натрия. Иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:полистиролсульфонат натрия 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. Ферментативная активность иммобилизованной липазы увеличена до 26 раз в сравнении с известной липазой (прототипом).

Способ получения иммобилизованной липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролита используют полистиролсульфонат натрия, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:полистиролсульфонат натрия 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 мин.