Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме Российский патент 2024 года по МПК C12N11/02 C12N11/08 C12N9/16 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для гидролиза молочного жира, для производства и улучшения качества сыров.

В настоящее время изучение липолитических ферментов является перспективным направлением благодаря их уникальным свойствам. Одним из преимуществ липаз является контролируемый и избирательный липолиз, который успешно применяется в различных сферах практической деятельности человека: в медицине, в пищевой, легкой и химической промышленности [Гамаюрова B.C., Зиновьева М.Е., Елизарова Е.В. и др. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / Вестник Казанского технологического университета. - 2007. №2 - С. 103-108].

Липаза (КФ 3.1.1.3) - сериновая гидролаза, катализирующая гидролиз триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот. Липазы широко доступны и повсеместно присутствуют в тканях животных и растений, а также в различных микроорганизмах. Активный центр липазы состоит из каталитической триады, которая включает Ser-His-Asp/Glu и оксианионное отверстие, покрытое lid-доменом. Домен lid претерпевает конформационное изменение в присутствии ингибитора [Е.D. Yushkova, Е.A. Nazarova, А.V. Matyuhina et al. Application of Immobilized Enzymes in Food Industry // Journal of agricultural and food chemistry Microb Cell Fact. - 2019. V. 67, №42 - P. 11553-11567].

Оптимальным pH для функционирования липазы являются значения от 4.0 до 8.0. Липазы, продуцируемые Chromobacterium viscosum, A. niger и Rhizophus sp., активны при кислом pH, а P. nitroaeducens продуцируют липазу, активную при сильнощелочном рН. Оптимальная температура для большинства липаз составляет от 30 до 50°С. Фермент обладает субстратной специфичностью [Tian-Tian Liu, Xiao-Tian Liu, Qing-Xi Chen, Yan Shi. Lipase Inhibitors for Obesity: A Review // Biomedicine & Pharmacotherapy. - 2020. V. 128. - P. 110314-110323].

В настоящее время липазы используются в различных отраслях промышленности. В молочной промышленности фермент применяется для гидролиза молочного жира, в производстве сырных продуктов и в переработке кислых масел. Также липаза используется как лекарственное средство при заместительной терапии, и в качестве агента, специфически разрушающего нежелательные продукты обмена веществ в организме больного [Стурова Ю.Г., Гришкова А.В. Исследование активности прегастральных липаз // Ползуновский вестник. - 2019. Т. 4. - С. 29-33].

В современной биотехнологии широко применяются ферменты, иммобилизованные на синтетических полимерных носителях. Одним из условий успешной иммобилизации фермента является правильный выбор носителя, при котором удается существенно повысить время активного функционирования ферментов, модулировать их каталитическую активность и специфичность действия, а также многократно использовать энзимные препараты. К одним из перспективных носителей для иммобилизации гидролитических ферментов относят ионообменные смолы [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т.5, №5 - С. 704-711].

Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, представляющие собой высокомолекулярные синтетические соединения с трехмерной гелевой или макропористой структурой, которые содержат различные функциональные группы, способные осуществлять ионный обмен [K. Biswas, S. Ghosh, В. Basu. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52]. Ионообменные смолы делятся на анионообменные и катионообменные. Катионообменные смолы содержат функциональные группы, способные к обмену положительных ионов, анионообменные - к обмену отрицательных.

Катионнообменные смолы представляют собой гетерополикислоты, состоят из высокомолекулярной матрицы, к которой присоединены катионогенные группы. Катиониты могут быть получены посредством реакции полимеризации или поликонденсации из мономерных соединений, уже содержащих ионогенные группы, или на основе готовых нерастворимых продуктов с последующим введением в них ионогенных групп [Приходько А.Е., Валевко С.А. Методы предварительной подготовки и получения воды для фармацевтических целей / Химико-фармацевтический журнал. - 2002. Т. 36, №10. - С. 31-711].

Катионнообменные смолы подразделяют на смолы с катионами сильных кислот, изготовляемые из полистирола с сульфонатной функциональной группой (SO^3-), которая заряжена либо ионами водорода (Н⁺), либо ионами натрия (Na⁺) и на смолы на катионах слабых кислот, которые состоят из акрилового полимера с группами карбоновых кислот в качестве функциональных групп и обладают высоким сродством к ионам водорода.

Благодаря своим универсальным свойствам катионообменные смолы используются в области ионного обмена и гетерогенного катализа. Эти смолы обладают высокой обменной способностью и устойчивостью к осмотическому удару. Катионнобменные смолы, произведенные с высокой степенью чистоты, могут быть перспективными катализаторами в различных пищевых технологиях. Во многих случаях их применение ограничено относительно низкой термостойкостью [Pravin U. Singare, Ram S. Lokhande, Rupa S. Madyal. Thermal degradation studies of some strongly acidic cation exchange resins // Open journal of physical chemistry. - 2011. V. 1, №2 - P. 45-54].

Устойчивым к термическому и химическому воздействию оказались сульфокатионит КУ-2 с активными группами -SO₃H, синтезируемый на основе сополимера стирола с дивинилбензолом, и катионит КУ-2-8 с активными сульфогруппами, полученный сульфированием гранульного сополимера стирола с 8% дивинилбензолом [Полянский Н.Г., Тулупов П.Е. Термическая устойчивость катионообменных смол / Успехи химии. - 1971. Т. 40, №12 - С. 2250-2279].

Смолы КУ-2 и КУ-2-8 нерастворимы в воде, в большинстве органических растворителей, растворах кислот и щелочей. Рабочий диапазон рН от 0 до 14, максимальная рабочая температура для КУ-2 составляет 120-130°С, а для КУ-2-8 - 110-120°С [Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / Холявка М.Г., Наквасина М.А., Артюхов В.Г. - Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. - 161 с.].

Ионообменная смола обладает двумя основными характеристиками -ионообменной емкостью и селективностью. Ионообменная емкость определяется способностью нерастворимой функциональной группы внутри мембраны подвергаться вытеснению ионов, которые включаются и свободно присоединяются к ее структуре противоположно заряженными ионами, доступными в окружающем растворе [Олыпанникова С.С., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. Т. 21, №3 - С. 408-416].

Ионообменные смолы применяются в различных сферах производства: в теплоэнергетике для умягчения и обессоливания воды, в гидрометаллургии для разделения цветных металлов, для регенерации отходов гальванотехники и металлообработки, в органическом синтезе в качестве катализатора, при очистке сточных вод, в пищевой промышленности. Ионообменные смолы могут выступать в качестве носителя при иммобилизации ферментов [Олыпанникова С.С., Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. Т. 21, №3 - С. 408-416].

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.

В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.

Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные смолы не растворимы в воде.

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.

Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.

Анионообменная смола АВ-17-2П уже рассматривалась в литературе в качестве носителя для иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus 1403 [Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова А.С.Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т. 8. Вып. 6. - С. 1035-1041; Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Трофимова О.Д., Беленова А.С, Воропаева Е.Н. Исследование термодинамических аспектов реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005 - Т. 5. Вып. 3. - С. 353-360]. Авторы показали, что оптимальным методом иммобилизации является модифицированный глутаральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связывающего звена между липазой и анионитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизация липазы адсорбционным методом на товарных анионообменных смолах АВ-26 и АВ-17-2П не дала положительных результатов [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М., Селеменев В.Ф., Трофимова О.Д., Холявка М.Г., Китаева Т.А. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. - Т. 5. Вып. 5. - С. 704-711].

Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине.

Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.

В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковалентной модификации.

Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler М., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гидролазной (липазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяют вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.

Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN 108148827 A, CN 101712951 A, CN 106867989 A, JPH 01273588 A, JPH 03160992 A, US 5273898 A, WO 2015081879 A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO 2008084470 A2, CN 102839166 А], Lewatit, Dowex [US 5292649 A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN 114657169 А], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO 2008139455 A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO 2009069116 A2] Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.

Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 А1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.

В качестве прототипа служил способ, описанный в патенте [US 5292649 A], согласно которому 1 г макропористой слабокислотной катионообменной смолы Lewatit CNP 80 производства Bayer AG смешивали с 50 мг 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-n-толуолметосульфоната и 10 мл воды. Полученную смесь выдерживали при комнатной температуре, при этом значение рН доводили до 4-5 добавлением 6 М HCl. После стабилизации значения рН полученную реакционную смесь тщательно промывали для удаления избытка 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимид-n-толуолметосульфоната. Затем к смеси добавляли 2 мл 1/15 М буфера McIlvaine с рН 4 и 50 мкл раствора липазы (1450 единиц) и полученную смесь оставляли на ночь в прохладной комнате для проведения реакции. В результате была получена липаза, иммобилизованная на Lewatit CNP 80.

В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменной смоле КУ-2-8 в Н-форме, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, равной 2656 мкмоль/мг для липазы, иммобилизованной на КУ-2-8, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора; согласно изобретению в качестве носителя используют катионообменник КУ-2-8, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменной смолы КУ-2-8 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионобменнике, проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Фиг.2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные смолы КУ-2 и КУ-2-8 (ГОСТ 20298-74) фирмы ООО «АКВАХИМ».

Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами HCl в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации 0,5-3,0 М до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0,1-0,25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в Н-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали до постоянной массы при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. - 2012. - №6 - С. 31-42].

Иммобилизацию липазы на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. 1 г предварительно кондиционированной катионообменной смолы в Н-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М фосфатного буфера с рН 5,8. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М фосфатном буфере с рН 5,8 в концентрации 1 мг/мл добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм

Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис. к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С.- Воронеж, 2011. - 162 с.]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.

Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:

А=а/В⋅t,

где а - количество жирных кислот, мкмоль;

В - содержание белка в препарате, мг;

t - время гидролиза, мин.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты отражены на фиг. 1-3.

Высокие значения содержания белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации липазы адсорбционным методом на катионообменных смолах КУ-2 и КУ-2-8 (фиг. 1). Однако более высокие значения общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот), а также ее удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) были зарегистрированы при сорбции фермента на КУ-2-8 (фиг. 2, 3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на катионите КУ-2-8.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; при этом перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии катионообменной смолы КУ-2-8 в буфере 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Изобретение позволяет получать нерастворимый в воде биокатализатор на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на катионообменной смоле КУ-2-8 в Н-форме, включающего только иммобилизованную липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой удельной активностью, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями. 3 ил., 1 пр.

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на катионообменных смолах КУ-2-8 в Н-форме, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу катионообменника в процессе инкубации липазы и катионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора; отличающийся тем, что в качестве носителя используют катионообменник КУ-2-8, перед иммобилизацией катионообменник в Н-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г катионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г катионообменной смолы КУ-2-8 в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 1 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и предшествующего ей выдерживания катионообменника используют 0,05М фосфатный буфер с рН 5,8, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на катионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют помощью диализа с использованием целлофанового мешочка, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.