СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЛИПАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК C12N11/08 C12N9/20 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для очистки животноводческих отходов и сточных вод.

Способ получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите (патент США №5667634, публ. 16.09.1997, МКИ D21C 9/08).

Однако липаза, полученная известным способом, недостаточно эффективна при высоких температурах ее использования.

Техническим эффектом предлагаемого изобретения является повышение активности целевого продукта при высоких температурах.

Технический эффект достигается в предлагаемом способе получения липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите тем, что в качестве полиэлектролита используют полидиаллилдиметиламмоний хлорид, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут.

Полидиаллилдиметиламмоний хлорид в качестве полимерного коагулянта используется для снижения солесодержания сточных вод (Гоголашвили Э.Л., Куренков В.Ф., Молгачева И.Е., Гайсина А.И. Влияние органических полимерных коагулянтов на эффективность процесса водоочистки // Структура и динамика молекулярных систем, вып.Х, ч.2, с.85-88, 2003).

В научно-технической литературе неизвестно техническое решение, аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию изобретения «новизна».

Полученная согласно предлагаемому способу иммобилизованная липаза может быть использована для очистки животноводческих отходов и сточных вод, т.е. «промышленно применима».

Впервые предложено использование полиэлектролита полидиаллилдиметиламмоний хлорида при определенном авторами массовом соотношении для повышения активности липазы, используемой при высокой температуре субстрата. Авторами впервые показано, что взаимодействие полиэлектролита полидиаллилдиметиламмоний хлорида и липазы приводит к изменению конформации липазы за счет препятствия разворачивания полипептидной цепи и стабилизации каталитически выгодной конформации липазы и, по-видимому, открытию активных центров фермента, т.е. предложение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Предлагаемое изобретение иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1. Далее к 1 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 7,6 при температуре 18°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60°С и 80°С. В результате активность липазы составила 320 и 446 единиц относительной активности липазы при 60°С и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 единиц активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 3,2-4,5 раза.

Пример 2. К 10 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида добавляют 1 мг липазы, полученной из поджелудочной железы /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:10). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 8,2 при температуре 24°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60°С и 80°С. В результате активность липазы составила 893 и 360 единиц относительной активности липазы при 60°С и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 единиц активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 3,6-8,9 раз.

Пример 3. Далее к 1 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида добавляют 1 мг липазы, из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1). Иммобилизацию проводят в течение 10 минут при рН 7,6, при температуре 18°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60°С и 80°С. В результате активность липазы составила 1276 и 460 единиц относительной активности липазы при 60°С и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 единиц активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 12,8-4,6 раз.

Пример 4. К 10 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:10). Иммобилизацию проводят в течение 20 минут при рН 8,2, при температуре 24°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60°С и 80°С. В результате активность липазы составила 1860 и 1357 единиц относительной активности липазы при 60°С и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 единиц активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 13,6-18,6 раз.

Пример 5. К 100 мг полидиаллилдиметиламмоний хлорида добавляют 1 мг липазы, полученной из Mucor javanicus /фирмы Сигма/ (соотношение липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:100). Иммобилизацию проводят в течение 15 минут при рН 7,9, при температуре 21°С.

Полученную иммобилизованную липазу и исходную проверяли на ферментативную активность при температуре субстрата (триацетина), равной 60°С и 80°С. В результате активность липазы составила 141 и 624 единиц относительной активности липазы при 60°С и 80°С соответственно, а исходная активность липазы равна при этих же условиях 100 единиц активности. Т.е. активность липазы, полученной согласно предлагаемому способу, была выше активности исходной липазы в 1,4-6,2 раз.

Таким образом, заявленный способ получения липазы позволяет в 1,4-18,6 раз увеличить ферментативную активность целевого продукта в сравнении с известным способом /прототипом/.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для очистки животноводческих отходов и сточных вод. Способ предусматривает иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. Способ позволяет получить целевой продукт с повышенной ферментативной активностью.

Способ получения иммобилизованной липазы путем иммобилизации ее в полиэлектролите, отличающийся тем, что в качестве полиэлектролита используют полидиаллилдиметиламмоний хлорид, причем иммобилизацию липазы проводят при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 и при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 мин.