СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО СПОНДИЛИТА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения активности туберкулезного спондилита.

Туберкулезный спондилит - длительное хроническое волнообразно протекающее заболевание, лечение которого не всегда приводит не только к излечению, но даже к затиханию. Определение активности туберкулезного процесса в позвоночнике необходимо для уточнения стадии заболевания, выбора лечебной тактики, определения длительности противотуберкулезной терапии и контроля за эффективностью лечения.

Известны клинические и рентгенологические способы определения активности туберкулезного спондилита (1).

Известны лабораторные способы определения активности туберкулезного спондилита путем выявления изменений в формуле крови, в иммунологических и биохимических показателях (2, 3, 4, 5, 6). В гемограмме частота патологических отклонений различных параметров колеблется от 7,5% (лимфопения) до 77,8% (ускоренная СОЭ). В биохимических показателях патологические отклонения составляют от 17,6% (уровень ВНСММ) до 89% (активность фермента АДА). В иммунологических показателях выявлены частота определения ПТАТ в 75%, увеличение IgA в 84,6%, IgM в 61,5%, IgE в 53,9% случаев.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности туберкулезного спондилита путем проведения лабораторных исследований, включающих альфа-2-глобулины, гамма-глобулины, А/Г-коэффициент, СРБ, церулоплазмин, гаптоглобин, экскрецию оксипролина с мочой (7). В данном способе некоторые показатели, часто встречающиеся при активном туберкулезном спондилите, не могут быть использованы для определения активности процесса, т.к. и при затихшем спондилите частота встречаемости их велика. В частности, церулоплазмин встречается в 71,4% при активном спондилите и в 72,2% - при его последствиях, экскреция оксипролина с мочой в 95,2% при активном процессе и в 42,1% - при последствиях. Для выявления активности туберкулезного спондилита требуется определение значительного количества показателей.

Недостатками известных способов определения активности туберкулезного спондилита являются:

во-первых, недостаточно высокая частота выявления патологических показателей при активном туберкулезном спондилите;

во-вторых, частая встречаемость патологических показателей и при активном, и при неактивном процессе;

в-третьих, необходимость проведения разнообразных исследований для определения активности туберкулезного процесса в позвоночнике.

Известно, что нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются одними из ключевых клеток в реакциях врожденного иммунитета, играющих важную роль в развитии воспалительного процесса (8). НГ способны фагоцитировать микробы благодаря наличию в их гранулах микробоцидных веществ (миелопероксидазы, лактоферрина, дефенсинов и других белков и пептидов). Миелопероксидаза (МПО) и лактоферрин (ЛФ) являются чувствительными маркерами, позволяющими проводить дифференциальную диагностику некоторых вирусных и бактериальных заболеваний. В частности, при вирусных инфекциях ЛФ сыворотки крови снижается, при гнойном менингите увеличивается. МПО увеличивается и при вирусных нфекциях, и при гнойном менингите, но при гнойном менингите значительно выше.

Способы использования функциональных показателей НГ периферической крови для определения активности туберкулезного спондилита в литературе не описаны.

Задачей предлагаемого способа является повышение точности установления диагноза активного туберкулезного спондилита и сокращение количества изучаемых показателей.

Поставленная задача решается параллельным изучением содержания внутриклеточных и сывороточных индивидуальных лизосомально-катионных белков нейтрофильных гранулоцйтов крови и при величине лизосомально-катионного теста ≥1,6 сцк, миелопероксидазы ≥200 нг/ мл и лактоферрина ≥1300 нг/мл диагностируют активный туберкулезный спондилит.

Способ осуществляется следующим образом.

Содержание внутриклеточных катионных белков (дефенсинов и родственных им пептидов) в лизосомах НГ крови оценивали с помощью цитохимического лизосомально-катионного теста (ЛКТ) по методике В.Е. Пигаревского (9). Фиксацию и окраску мазков крови проводили с помощью 0,1% раствора красителя прочного зеленого в 0,1 М трис-HCl буфере, 50% метаноле (рН 8,1-8,2) в течение 20 минут, после чего препараты промывали и докрашивали 0,25% водным раствором азура А для выявления клеточных ядер. Суммарное содержание катионных белков в НГ определяли полуколичественно по среднему цитохимическому коэффициенту исходя из следующей формулы:

СЦК - средний цитохимический коэффициент. Буквы (а-ж) обозначают количество однотипно окрашиваемых прочным зеленым клеток, а цифры (3-0) - степень интенсивности окрашивания цитоплазмы НГ, n - количество НГ (не менее 100).

Определение содержания сывороточных белков миелопероксидазы и лактоферрина производили методом твердофазного иммуноферментного анализа (10): в лунки планшета для ИФА (Falcon 3912 Microtest Ш Flexible Assay Plate) вносили по 100 мкл раствора анти-МПО (анти-ЛФ) в концентрации 4 мкг/мл в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,5 и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Затем планшеты не менее 4-х раз отмывали буфером для промывки (0,01 М Na-фосфатный буфер рН 7,2, содержащий 0,15 М NaCl и Tween-20). В промытые лунки вносили по 100 мкл буфера для промывки с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Затем буфер удаляли и в лунки вносили исследуемые образцы (сыворотки крови) в объеме 100 мкл, разведенные до рабочих концентраций буфером для промывки с 1% БСА 10 и 100 раз. Этим же буфером делали последовательные разведения стандартного раствора МПО (ЛФ) для получения следующих концентраций: 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С. После инкубации планшеты промывали буфером для промывки вносили по 100 мкл конъюгатов анти-МПО-ПХ в разведении 1:2000 (анти-ЛФ-ПХ в разведении 1:20000) (разводили буфером, содержащим 1% БСА) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем планшеты особенно тщательно промывали и вносили по 100 мкл раствора субстрата для ПХ (0,2 мг/мл о-фенилендиамина в 20 мМ цитратном буфере рН 5,0, содержащем 0,5 мкл/мл 30% H₂O₂), реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2,5 М H₂SO₄, измеряли экстинцию при длине волны 492 нм (Multiscan). На основании стандартных разведений МПО (ЛФ) строили калибровочную кривую и по ней определяли содержание МПО (ЛФ) в исследуемых образцах.

Полученный результат соотносили с пороговым, составляющим для ЛКТ - 1,6 сцк, МПО - 200 нг/мл и для ЛФ - 1300 нг/мл. При величине ЛКТ ≥1,6 сцк, МПО>200 нг/мл и ЛФ>1300 нг/мл определяли, что туберкулезный спондилит находится в активной стадии. При величине ЛКТ<1,6 сцк, МПО<200 нг/мл и ЛФ<1300 нг/мл определяли, что туберкулезный спондилит находится в неактивной стадии.

Апробацией заявляемого способа служат результаты обследования двух групп больных туберкулезным спондилитом, всего 39 человек. 1-ю группу составили 27 больных туберкулезным спондилитом в стадии разгара, 2-ю - 12 больных туберкулезным спондилитом в стадии затихания.

Оказалось, что в 1 группе ЛКТ был ≥1,6 сцк (1,6-1,99 сцк) у 26 больных, у одного пациента ЛКТ составил 1,53 сцк. Следовательно, чувствительность заявляемого способа по определению ЛКТ равняется 96,3%.

МПО была >200 нг/мл (223-951 нг/мл) у 25 больных. У остальных 2 больных МПО была <200 нг/мл и выражалась 135 и 162 нг/мл. Следовательно, чувствительность заявляемого способа по определению МПО составляет 92,6%.

ЛФ >1300 нг/мл (1361-6208 нг/мл) обнаружен у 27 больных. Чувствительность заявляемого способа по определению ЛФ составляет 100,0%.

Таким образом, по комплексу ЛКТ+МПО+ЛФ чувствительность способа равняется 100%.

Во 2 группе ЛКТ у всех 12 больных был <1,6 сцк (1,31-1,56 сцк), следовательно, специфичность предлагаемого теста по ЛКТ составляет 100%.

МПО у 11 больных составила <200 нг/мл (74-162 нг/мл), у 1 больного МПО была выше порогового уровня и составляла 207 нг/мл. Следовательно, специфичность предлагаемого теста по МПО составляет 91,7%.

ЛФ <1300 нг/мл (326 - 1292) обнаружен у 10 пациентов, ЛФ >1300 нг/мл у 2-1531 и 1795 нг/мл. Специфичность заявляемого способа по ЛФ составляет 83,3%.

Таким образом, специфичность заявляемого комплекса по ЛКТ+МПО+ЛФ составляет 83,3%.

В целом, по двум группам больных активность туберкулезного процесса в позвоночнике правильно определена в 37 случаях из 39. Следовательно, диагностическая эффективность теста по трем показателям ЛКТ+МПО+ЛФ равна 94,9%.

Примеры реализации предлагаемого способа.

1. Больной П., 30 лет болен туберкулезным спондилитом 3 года, в течение последних 6 месяцев получал противотуберкулезное лечение с улучшением. Рентгенологически: очаги деструкции в телах Th 7-10 позвонков. В клиническом анализе крови изменений нет. ЛКТ - 1,6 сцк, МПО - 943 нг/мл, ЛФ - 6208 нг/мл. Процесс признан активным. Во время операции найдены очаги деструкции в телах Th 7-10 с грануляциями и гноем. Больному в послеоперационном периоде проводилось противотуберкулезное лечение в течение 12 месяцев.

2. Больная Б., 53 лет страдает туберкулезом позвоночника 35 лет, отмечает ухудшение в последние 3 года в виде появления болей и неврологических нарушений. Рентгенологически: очаги деструкции в телах Th 7-12. В клиническом анализе крови без патологии. ЛКТ - 1,56 сцк, МПО -152 нг/мл, ЛФ - 492 нг/мл. Процесс в позвоночнике признан затихшим. Во время операции обнаружены сухие обызвествленные казеозные массы без признаков активности туберкулеза. Больной в послеоперационном периоде проводилось противотуберкулезное лечение в течение 2 месяцев.

Таким образом, предлагаемый тест позволяет повысить точность определения активности туберкулезного спондилита, сократить количество исследований и определить длительность необходимой противотуберкулезной терапии.

Литература

1. Корнев П.Г. Хирургия костно-суставного туберкулеза. - Л., 1971. - Т.3.- С.46-50.

2. Внелегочный туберкулез /Под ред. А.В.Васильева. - СПб, 2000. - С.49-56, 123-144, 192-195.

3. Применение стандартизованного многоуровневого алгоритма иммунодиагностики туберкулеза различных локализаций в современной эпидемиологической обстановке: Пособие для врачей / Сост. А.В.Васильев, Р.И.Шендерова, Н.М.Чужова и др. - СПб, 2000. - 32 с.

4. Титаренко О.Т., Дьякова М.Е., Перова Т.Л. и др. Биохимические критерии дифференциальной диагностики туберкулеза и остеомиелита позвоночника //Туберкулез в Северо-Западном регионе России: современные проблемы. - СПб, 2002. - С.110-116.

5. Гусева В.Н., Иванов В.М., Потапенко Е.И. и др. Иммунный статус больных активным туберкулезным спондилитом //Пробл. туб. и болезней легких. - 2003. - №6. - С.25-28.

6. Костно-суставной туберкулез /Под ред. Ю.Н.Левашева и А.Е.Гарбуза. М., 2003. - С.49-54.

7. Титаренко О.Т., Перова Т.Л., Гусева В.Н., Момот Д.С., Тиходеев С.А. Биохимические характеристики активности процесса при туберкулезном спондилите. Депонир во ВНИИМИ. - №17682, 1989.

8. Иванов В.М., Гусева В.Н., Шендерова Р.И. и др. Клинико-лабораторные особенности при туберкулезе и остеомиелите позвоночника// Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2003. №10, с.34-37.

9. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. - СПб, 1999. - 70 с.

10. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест: Метод, письмо. - Л, 1987. - 13 с.

11. Ботерашвили Н.М., Алешина Г.М., Сорокина М.Н., Иванова В.В. Миелопероксидаза и лактоферрин в сыворотке крови и ликворе детей больных менингитом. //Мед. иммунология. 2002. Т.4. №4-5, С.565-572.

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для определения активности туберкулезного спондилита. Сущность способа: параллельно изучают содержание внутриклеточных лизосомально-катионных белков нейтрофильных гранулоцитов крови с помощью цитохимического лизосомально-катионного теста и содержание сывороточных белков миелопероксидазы и лактоферрина. Активный туберкулезный спондилит диагностируют при величине лизосомально-катионного теста ≥1,6 сцк, миелопероксидазы >200 нг/ мл и лактоферрина >1300 нг/мл. Использование способа дает возможность повышения точности диагностики активного туберкулезного спондилита и сокращения количества изучаемых показателей, что позволяет определить стадию заболевания, оценить тяжесть состояния больного, подобрать соответствующее лечение, а также определить длительность противотуберкулезной терапии и оценить ее эффективность.

Способ определения активности туберкулезного спондилита путем проведения лабораторных исследований, отличающийся тем, что параллельно изучают содержание внутриклеточных лизосомально-катионных белков нейтрофильных гранулоцитов крови с помощью цитохимического лизосомально-катионного теста и содержание сывороточных белков миелопероксидазы и лактоферрина, при величине лизосомально-катионного теста ≥1,6 сцк, миелопероксидазы >200 нг/ мл и лактоферрина >1300 нг/мл диагностируют активный туберкулезный спондилит.