СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/49 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии.

Известен способ диагностики рака шейки матки (см.Патент РФ №2343485, кл. G01N 33/53_; опубл. 10.01.2009 г.), включающий лектин-иммуноферментный анализ вагинального секрета, в котором определяют концентрацию лектин-связанных РЭА/РЭА - подобных антигенов.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известного способа, относится невозможность определения стадии рака шейки матки.

Известен способ дифференциальной диагностики гиперплазии, интраэпителиальных неоплазий и рака шейки матки (см. патент РФ №2321859, кл. G01N 33/483, опубл. 10.04.2008 г.), включающий компьютерный анализ мазков, полученных из канала шейки матки и окрашенных ядерным красителем.

К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известного способа, относится невозможность определения стадии рака шейки матки.

Использование предполагаемого изобретения обеспечивает следующий технический результат: определение стадии рака шейки матки.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что суспензию нейтрофилов (Нф), полученную из свеженабраннойгепаринизированной венозной крови, подвергают фемтосекундному лазерному излучению (ФСЛИ) в различных дозах и определяют в Нф активностьмиелопероксйдазы (МПО), кислой фосфатазы (КФ), уровень катионных белков (КБ) и активность в нитросинеготетразолияв(НСТ)-тесте. Причем, при начальном РТТТМ (Ia по FIGO) в Нф после ФСЛИ средней дозы 84,53 мДж/см² уровень КБ выше значения 1,65 среднего цитохимический коэффициента (СЦК), а КФ выше значения 0,96 СЦК, причем в норме - КБ ниже 1,65 СЦК, а КФ выше 0,96 СЦК.

При местноограниченном процессе (Ib-IIa по FIGO) РШМ в Нф после ФСЛИ средней дозы 23,7 мДж/см² НСТ выше 1,45 СЦК, а МПО ниже 2,22 СЦК.

При распространенном РШМ (IIb-IV по FIGO) в Нф при ФСЛИ 8,5 мДж/см² КФ ниже 1,28 СЦК, а при ФСЛИ 71,1 мДж/см² НСТ ниже 1,38 СЦК.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».

Исследования проводят следующим образом. Суспензию нейтрофилов (Нф), полученную из свеженабранной гепаризированной венозной крови больных раком шейки матки с целью уточнения стадии заболевания, подвергают фемтосекундному лазерному излучению (ФСЛИ) в различных дозах и определяют в Нф цитохимически активность миелопероксидазы (МПО) по методу Грэхема-Кнолля (см. Долгушин И.А., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз.Екатеринбург, 2001).Свежие мазки фиксируют в 4% формалиново-спиртовом растворе 30 сек. В темном месте и в среде повышенной влажности на фиксированные мазки наносят инкубационную среду (250 мг бензидина растворяли в 6 мл спирта 96% и 4 мл воды с добавлением 0,02 мл 3% перекиси водорода) на 10 мин. Докрашивают цитоплазму 0,5% спиртовым раствором эозина в течение 10 мин, а ядра -0,5% спиртовым раствором метиленового синего (15 мин). Промывают проточной водой в течение 10 сек и высушивают на воздухе. Фермент выявляют в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул.

В Нф определяют активность кислой фосфатазы (КФ) методом азосочетания по методу Burstone и Li (см. Шубич М.Г., Нестерова И.В. О специфичности цитохимического выявления кислой фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах // Лаб. дело. - 1980. - №3. - С.150-154). Свежие высушенные мазкификсируют в 10% растворе формалина на этиловом спирте в течение 30 сек. Промытые дистиллированной водой и высушенные мазки помещают в емкость с инкубационной средой (рН 5,2-5,4), предварительно профильтрованной (40 г нафтола-АБ-фосфата, 1 мл диметилформамида, 0,1 н раствор ацетата натрия, 8 капель парарозанилина и 8 капель раствора азотистокислого натрия) и помещают в термостат на 2 ч при температуре 37°C. После инкубации мазки промывают дистиллированной водой, высушивают и докрашивают ядра гематоксилином Майера в течение 15 мин. Активность КФ выявляют в виде гранул красноватой окраски.

В Нф также определяют уровень катионных белков (КБ) по методу М.Г. Шубича с бромфеноловым синим (см. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология. - 1974. - №10. - С.1321-1322). Свежие мазки фиксируют в 5% водном растворе сульфосалицилловой кислоты в течение 60 сек. Далее окрашивают 0,1%-ным раствором бромфенолового синего в боратном буфере 2 мин и промывают в трех сменах 0,05 М боратного буфера (рН 7,2) по 1 мин. Затем мазки высушивают и ядра докрашивают 1%-ным водным раствором сафранина в течение 30 сек. Пробы промывают проточной водой, высушивают имикроскопируют (при увеличении ×1350) под иммерсией. КБ выявляют в цитоплазме Нф в виде синих гранул.

Далее определяют активность Нф в НСТ-тесте. Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя нитросинеготетразолия (НСТ) в нерастворимый диформазан. Высушенные мазки помещают в емкость с краской-фиксатором Мая-Грюнвальда в течение 3-5 мин. Затем мазки помещают в кювету с разведенным (1:10) раствором красителя Романовского на 20-30 мин. Далее промывают проточной водой и на влажные мазки в темном месте наносят раствор тетразолиянитросинего с концентрацией 1 мг/мл на 5-7 мин и промывают. А затем выявляют зерна формазана синего цвета.

При начальном РШМ (Ia по FIGO) в Нф после ФСЛИ средней дозы 84,53 мДж/см² уровень КБ выше 1,65 СЦК (средний цитохимический коэффициент), а КФ выше 0,96 СЦК. В норме КБ ниже 1,65 СЦК, а КФ выше 0,96 СЦК.

При местноограниченном процессе (Ib-IIa по FIGO) РШМ в Нф после ФСЛИ средней дозы 23,7 мДж/см² НСТ выше 1,45 СЦК, МПО ниже 2,22 СЦК. При распространенном РШМ (IIb-IV по FIGO) в Нф при ФСЛИ 8,5 мДж/см² КФ ниже 1,28 СЦК, а при ФСЛИ 71,1 мДж/см² НСТ ниже 1,38 СЦК. На основании предложенных тестов дообследования уточнение стадий РШМ было проведено у 19-ти пациенток, впервые лечившихся в период с января 2010 г. по сентябрь 2010 г. в Ульяновском областном клиническом онкологическом диспансере. У 8 из них стадия злокачественного процесса была изменена.

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, и описывает способ дифференциальной диагностики рака шейки матки (РШМ), где суспензию нейтрофилов (Нф), полученную из свеженабранной гепаринизированной венозной крови, подвергают фемтосекундному лазерному излучению (ФСЛИ) в различных дозах и определяют в Нф активность миелопероксидазы (МПО), кислой фосфатазы (КФ), уровень катионных белков (КБ) и активность в нитросинего тетразолия (НСТ)-тесте, причем при начальном РШМ (Ia no FIGO) в Нф после ФСЛИ средней дозы 84,53 мДж/см² уровень КБ выше значения 1,65 среднего цитохимический коэффициента (СЦК), а КФ выше значения 0,96 СЦК, причем в норме - КБ ниже 1,65 СЦК, а КФ выше 0,96 СЦК; при местноограниченном процессе (Ib-IIa по FIGO) РШМ в Нф после ФСЛИ средней дозы 23,7 мДж/см² НСТ выше 1,45 СЦК, а МПО ниже 2,22 СЦК; при распространенном РШМ (IIb-IV по FIGO) в Нф при ФСЛИ 8,5 мДж/см² КФ ниже 1,28 СЦК, а при ФСЛИ 71,1 мДж/см² НСТ ниже 1,38 СЦК. Способ позволяет определить стадию рака шейки матки.

Способ дифференциальной диагностики рака шейки матки (РШМ), отличающийся тем, что суспензию нейтрофилов (Нф), полученную из свеженабранной гепаринизированной венозной крови, подвергают фемтосекундному лазерному излучению (ФСЛИ) в различных дозах и определяют в Нф активность миелопероксидазы (МПО), кислой фосфатазы (КФ), уровень катионных белков (КБ) и активность в нитросинего тетразолия (НСТ)-тесте, причем при начальном РШМ (Ia пo FIGO) в Нф после ФСЛИ средней дозы 84,53 мДж/см² уровень КБ выше значения 1,65 среднего цитохимического коэффициента (СЦК), а КФ выше значения 0,96 СЦК, причем в норме КБ ниже 1,65 СЦК, а КФ выше 0,96 СЦК; при местноограниченном процессе (Ib-IIa пo FIGO) РШМ в Нф после ФСЛИ средней дозы 23,7 мДж/см² НСТ выше 1,45 СЦК, а МПО ниже 2,22 СЦК; при распространенном РШМ (IIb-IV пo FIGO) в Нф при ФСЛИ 8,5 мДж/см² КФ ниже 1,28 СЦК, а при ФСЛИ 71,1 мДж/см² НСТ ниже 1,38 СЦК.