СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ КЛИНИЧЕСКИХ ФОРМ БРУЦЕЛЛЕЗА У ЛЮДЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 G01N33/68 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в диагностике бруцеллеза цитохимическими методами в дополнение к клиническим исследованиям.

Изобретением решается задача повышения точности диагностики при дифференциации различных форм заболевания.

Известно, что дифференциация диагностики между хронической и резидуальной, хронической и первично-хронической, первично-хронической и латентной формами бруцеллеза затруднена тем, что клинические признаки у перечисленных групп сходны.

Известен способ дифференциальной диагностики хронического и резидуального бруцеллеза у людей, основанный на клинических признаках, кожно-аллергических, серологических реакциях, бактериологических исследованиях (Бруцеллез. Под ред. П.А.Вершиловой. Второе, переработанное и дополненное издание. -М., 1972. -439 с.).

Недостатком этого способа является недостоверность полученных результатов в связи со сходными клиническими проявлениями этих двух форм бруцеллеза, отсутствием бактериологических находок и частыми отрицательными результатами серологических и кожно-аллергических реакций не только при резидуальном, но и при хроническом бруцеллезе.

Наиболее близким по существу к заявленному изобретению является дифференциальная диагностика по степени активности щелочной фосфатазы инфекций вирусных и бактериальных. (В.В.Соколов, Р.П.Нарциссов, А.А.Иванова. Цитохимия ферментов в профпатологии. -М.; 1975. -119с.)
Общим признаком прототипа и заявляемого изобретения является определение цитохимических показателей ферментативных реакций в нейтрофилах периферической крови.

Недостатком прототипа является недостаточная достоверность диагностики сходных по клиническим показателям форм бруцеллеза (хронической и резидуальной, хронической и первично-хронической, первично-хронической и латентной), что обусловлено отсутствием цитохимических тестов для дифференциации форм заболевания.

Целью изобретения является повышение достоверности диагностики различных форм бруцеллеза при простате и малых затратах времени выполнения.

Поставленная цель достигается тем, что у больных бруцеллезом определяется цитохимические показатели ферментативных реакций в нейтрофилах периферической крови, диагностику проводят между формами бруцеллеза хронической и резидуальной, хронической и первично-хронической, первично-хронической и латентной, при этом хроническую форму диагностируют по показателям активности ферментов в единицах Кеплоу по пероксидазе 2,48-2,94; неспецифической эстеразе 2,54-2,94; щелочной фосфатазе 0,6-1,0; катионных белков 2,1-2,42, резидуальную при 1,82-2,06; 1,3-1,69; 0,37-0,89; 2,03-2,23, первично-хроническую при 2,88-2,98, 1,0-1,8, 0,34-0,5, 2,05-2,25, латентную при 2,15-2,25 1,93-2,63, 0,71-0,81, 1,6-2,0, соответственно.

Сущность изобретения поясняется следующими соображениями.

Нейтрофил является одним из наиболее активных компонентов в системе гуморально-клеточной кооперации крови в борьбе с возбудителями инфекционных заболеваний, он является индикатором различных нарушений гомеостаза.

Функциональная активность нейтрофилов обусловлена такими биологически активными соединениями, как кислая и щелочная фосфатазы, миелопероксидаза, катионные белки и др.

Метаболизм нейтрофилов крови в настоящее время успешно изучается в помощью цитохимических реакций, к достоинствам которых следует отнести техническую простоту, минимальные требования к объему исследуемого материала, доступность. (Пигаревский В. Е. Зернистые лейкоциты и их свойства.- М.; 1978. -с-128).

В настоящее время исследования с применением цитохимических методов широко применяются при диагностике инфекционных заболеваний (острая дизентерия, брюшной тиф, вирусный гепатит и др.) Аналогичные исследования при бруцеллезе касаются цитохимии только лизосомального катионного белка нейтрофилов больных хроническим бруцеллезом для оценки активности инфекционного процесса. (Нагоев Б.С., Габрилович И.М., Фокичева Н.Х. //Зоонозные болезни человека: Сб.науч.тр. - Орджоникидзе: 1983. -с.13-17).

При установлении цитохимических тестов для диагностики различных форм заболевания были обследованы 104 больных хроническим, резидуальным, первично-хроническим, латентным бруцеллезом, 24 здоровых донора крови.

Исследования активных ферментов проводили по известным методикам. (Сафронова В.М., Локтев Н.А., Руднев С.М.// Депонировано в ВИНИТИ.- 1994.-N 1424. -В. 94. -49с. ; Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия: Пер. с англ. -М.: 1969. -646 с.).

Перед определением активности ферментов мазки крови готовят для каждого вида фермента соответствующим образом.

Для выявления миелопероксидазы высушенные на воздухе мазки крови фиксируют спирт-формолом в течение 1 мин, ополаскивают в дистиллированной воде и помещают в инкубационную среду на 4-7 мин при комнатной температуре. Инкубационную среду готовят раствором 200 мг бензидина в 20 мл 96^o этилового спирта и добавлением 30 мл дистиллированной воды. Непосредственно перед применением в 50 мл раствора добавляют 0,1 мл 3% перекиси водорода. После инкубирования мазки промывают в проточной воде, докрашивают ядра 0,01% водным раствором азура 11 в течение 15-20 с, снова промывают в проточной воде и высушивают на воздухе.

Для выявления неспецифической эстеразы высушенные на воздухе мазки крови фиксируют парами 40: формалина нейтрального (концентрированного) в течение 5 мин, ополаскивают дистиллированной водой и помещают в инкубационную среду на 1 ч при комнатной температуре. Инкубационную среду готовят непосредственно перед применением смешиванием 0,4 мл 1% нафтола- ASD ацетата (на ацетоне), 0,4 мл 1% пропиленгликоля (на ацетоне), 40 мл 0,1М фосфатного буфера с pH 6,9, 60 мл прочного синего раствора и фильтрованием. После инкубирования мазки промывают дистиллированной водой, докрашивают ядра 0,1% водным раствором нейтральрота в течение 5-15 с, снова промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Для выявления щелочной фосфатазы высушенные на воздухе мазки крови фиксируют смесью формалин-метанола в течение 30 сек и помещают в инкубационную среду на 20 мин при комнатной температуре. Инкубационную среду готовят непосредственно перед применением смешиванием 35 мг α -нафтилфосфата натрия, 35 мл прочного синего PP раствора, 35 мл трис-буфера c pH 9,6 и фильтрованием. После инкубирования мазки промывают проточной водой, докрашивают ядра 0,01% водным раствором азура 11 в течение 15-20 с, снова промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Для выявления катионного белка высушенные на воздухе мазки крови фиксируют в метаноле в течение 5 мин и помещают в инкубационную среду на 35 мин. Инкубационную среду готовят смешиванием 100 мл метанолового трис-буфера со 100 мл спиртового забуференного раствора прочного зеленого, доведением pH красителя до 8,1-8,2 путем внесения нескольких капель 0,1 н раствора NaOH или 0,1 н раствора соляной кислоты. После инкубирования мазки промывают в дистиллированной воде, докрашивают ядра 0,25% раствором азура A в течение 20 с, снова промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе.

Результаты реакций по активности ферментов:
если продукт реакции в виде коричневых гранул (пероксидаза, щелочная фосфатаза), сине-фиолетовых гранул (неспецифическая эстераза), зеленых гранул (лизосомальных катионных белков) занимают всю цитоплазму - III степень активности; если есть участки цитоплазмы свободные от гранул - II степень активности; если в цитоплазме единичные гранулы или небольшие участки диффузного окрашивания - I степень активности, если в цитоплазме отсутствуют или диффузное окрашивание - 0 степень активности. Степень окрашивания определяется в 100 полиморфноядерных нейтрофилах.

Единица Кеплоу определяется следующим образом:
Например:
0 степень активности - 50 клеток
I - 10
II - 20
III - 20 - 100 клеток
Степень активности умножают на количество клеток с этой активностью, суммируют и делят на 100. В нашем примере уровень активности 1,1 единиц Кеплоу.

Возможность практического применения изобретения в медицинской практике с использованием всей совокупности заявляемых признаков показана в конкретных примерах диагностики больных различными формами бруцеллеза.

Пример 1. Больная Ч., 13 лет. Поступила в стационар 1.11.94 г. Жалобы: слабость, боли в коленных, локтевых, голеностопных суставах, головная боль, слабость.

Анамнез болезни: больна в течение 1,5 лет. В начале заболевания было повышение температуры. Дважды обследована на предмет ювенильного артрита. Случайно обследована на бруцеллез.

Эпидемиологический анамнез: живет на кошаре. Постоянный контакт с мелким рогатым скотом, мать больна бруцеллезом в течение 2-х лет. Объективно: явление эписклерита, микрополиаденита. Функция суставов не нарушена. Печень ⁺1 см.

Обследование: общий анализ крови - нормограмма. Общий анализ мочи - без патологии. Бактериологический посев крови - отрицательный. Реакция Райта - отрицательная-отрицательная. Реакция Хеддльсона - отрицательная-отрицательная. РПГА - отрицательная-отрицательная. Проба Бюрне: через 24 часа - отек 5х4 см; через 48 часов - отек 6х6 см.

Клинические, бактериологические, серо-аллергические показатели у больной определяли признаки как хронического, так и резидуального бруцеллеза.

При цитохимическом исследовании выявлено, что активность пероксидазы в нейтрофилах составила 2,52-2,88; неспецифической эстеразы 2,56-2,89; щелочной фосфатазы 0,6-0,8; лизосомальных катионных белков 2,1-2,34 единиц Кэплоу.

Выявленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в нейтрофилах периферической крови в комплексе с эпидемиологическим анамнезом, клиническими признаками, результатами кожно-аллергической пробы Бюрне позволяют диагносцировать у больной хроническую форму бруцеллеза.

Пример 2. Больной Р., 45 лет. Поступил в стационар 25.10.94 г. Жалобы: слабость, потливость, головная боль, боли во всех группах крупных суставов при изменении метеоусловий и физической нагрузки, боли в области сердца, раздражительность.

Анамнез болезни: боли с 1978 г., в 1979 г. был установлен диагноз - хронический бруцеллез. По роду работы (скотник), контакт с крупным и мелким рогатым скотом. Хозяйство по бруцеллезу не благополучное, не привит.

Объективно: явления эписклерита, микрополиаденита, гипергидроз. Признаки периартрита плечевых и лучевызапястных суставов, остеоартроз левого плечевого сустава с нарушением функции. Косвенные клинические признаки остеоартрозов коленных и голеностопных суставов. Признаки генерализованного остеохондроза позвоночника с явлениями люмбоишалгии.

Обследование: общий анализ крови - L = 6,0•10⁹/л; Л = 46; СОЭ = 4 мм/час. Общий анализ мочи - норма; СРП; бактериологический посев крови - отрицательный. Реакция Райта - отрицательная-отрицательная. Реакция Ходдльсона - положительная-положительная. РПГА - 1:100 - 1:50.

Клинические, бактериологические, серо-аллергические показатели у больного выявляли признаки как резидуального, так и хронического бруцеллеза.

Цитохимическим исследованием больного выявлено, что активность пероксидазы равнялась 1,83-2,0; неспецифической эстеразы 1,32-1,58; щелочной фосфатазы 0,39-0,82; лизосомальных катионных белков 2,06-2,18 единиц Кэплоу.

Установленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в нейтрофилах периферической крови в комплексе с эпидемиологическим анамнезом, клиническими признаками, результатами бактериологического исследования, кожно-аллергической пробы Бюрне, серологических реакций дают возможность диагносцировать у больного резидуальную форму бруцеллеза.

Пример 3. Больной С., 42 года. Поступил в стационар 02.02.94 г. Жалобы: боли в голеностопных, коленных, локтевых суставах, головная боль, слабость.

Анамнез болезни: болен в течение 2 лет. В начале заболевания было повышение температуры. Обследован на бруцеллез по назначению участкового врача.

Эпидемиологический анамнез: работает на кошаре скотником. Постоянный контакт с мелким рогатым скотом. Не привит.

Объективно: функции суставов не нарушены. Отмечены явления эписклерита, микрополиаденита.

Обследование: общий анализ крови - нормограмма. Общий анализ мочи - без патологии. Бактериологический посев крови - отрицательный. Реакция Райта - отрицательная-отрицательная. Реакция Хеддльсона - отрицательная - отрицательная. РПГА - отрицательная-отрицательная. Проба Бюрне через 24 часа - отек 4,5x5 см, через 48 часов - отек 6,5x6 см.

Эпидемиологический анамнез, клинические, бактериологические, серологические, кожно-аллергические показатели у больного определяли признаки как хронического, так и первично-хронического бруцеллеза.

Цитохимическим исследованием больного установлена, что активность пероксидаза равнялась 2,52-2,91; неспецифической эстеразы 2,58-2,91; щелочной фосфатазы 0,61-0,99; катионных белков 2,12-2,4 единиц Кэплоу.

Выявленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в нейтрофилах периферической крови в комплексе с эпидемиологическим анамнезом, клиническими признаками, результатами кожно-аллергической пробы Бюрне, серологических реакций, бактериологического исследования позволит диагносцировать у больного хроническую форму бруцеллеза.

Пример 4. Больная С., 45 лет. Поступила в стационар 25.10.94 г. Жалобы: слабость, потливость, раздражительность, головная боль, боли во всех крупных и мелких суставах.

Анамнез болезни: больна в течение 1,5 лет, когда появились вышеуказанные жалобы. Впервые выявлены положительные реакции в сентябре 1994 г. при плановом обследовании.

Эпидемиологический анамнез: работает дояркой в течение 5 лет на ферме, неблагоприятной по бруцеллезу крупного рогатого скота. До этого по роду работы с животными связана не была.

Объективно: эписклерит, общий гипергидроз. Явления периартритов плечевых суставов, признаки генерализованного остеохондроза с полирадикулярным синдромом.

Обследование: общий анализ крови: L = 5,5•10⁹/л; Л=45%; СОЭ=10 мм/час; общий анализ мочи - норма. Реакция Райта - 1:50 - отрицательная. Реакция Хеддльсона - положительная-положительная. РПГА - отрицательная 1:50. Проба Бюрне через 48 часов - отек 4x3 см.

Эпидемиологический анамнез, клинические, бактериологические, серо-аллергические показатели у больной определяли признаки как хронического, так и первично-хронического бруцеллеза.

Цитохимическим исследованием нейтрофилов периферической крови выявлено, что активность пероксидазы равнялась 2,9-2,96; неспецифической эстеразы 1,1-1,78; щелочной фосфатазы 0,35-0; 48; лизосомальных катионных белков 2,06-2,23 единиц Кэплоу.

Выявленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в нейтрофилах периферической крови в комплексе с эпидемиологическим анамнезом, клиническими признаками, результатами бактериологического исследования, серологических реакций, кожно-аллергической пробы Бюрне позволяют диагностировать у больного первично-хроническую форму бруцеллеза.

Пример 5. Больной Б. , 34 лет. Поступил в стационар 02.11.94 г. Жалоб нет. Выявлен при плановом обследовании.

Объективно: эписклерит, микрополиаденит, гипергидроз ладоней.

Обследование: общий анализ крови - нормограмма. СОЭ -2 мм/час. Общий анализ мочи - норма. Бактериологический посев крови - отрицательный. Реакция Райта 1: 50 - отрицательная. Реакция Хеддльсона - положительная-положительная. РПГА - отрицательная - отрицательная. Проба Бюрне 1,5x1,5 см - отек.

Клинические, бактериологические, серологические, кожно-аллергические показатели у больной определяли признаки как, латентного, так и первично-хронического бруцеллеза.

При цитохимическом исследовании больного выявлено, что активность пероксидазы составляла 2,16-2,24; неспецифической эстеразы 1,94-2,61; щелочной фосфатазы 0,73-0,79; лизосомальных катионных белков 1,68-1,99 единиц Кэплоу.

Выявленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в комплексе с клиническими признаками, результатами кожно-аллергической пробы Бюрне, серологических реакций, бактериологического исследования позволяют диагноцировать латентную форму бруцеллеза.

Пример 6. больной К., 38 лет. Поступил в стационар 20.09.94 г. Жалобы: боли во всех крупных и мелких суставах, головная боль, слабость, потливость, раздражительность.

Анамнез болезни: болен в течение 1 года 6 месяцев, когда появились вышеуказанные жалобы. Положительные реакции выявлены в августе 1994 г. при плановом обследовании.

Эпидемиологический анамнез: работает чабаном в течение 4 лет на ферме неблагополучной по бруцеллезу у крупного рогатого скота. До этого по роду работы с животными связан не был.

Объективно: эписклерит, общий гипергидроз, явление периартритов плечевых суставов. Признаки генерализованного остеохондроза с полирадикулярным синдромом.

Обследование: общий анализ крови: L=5,8•10⁹/л; Л=46%; СОЭ=10 мм/час. Общий анализ мочи - норма. Бактериологический посев крови = отрицательный. Реакция Райта - 1:50 - отрицательная. Реакция Хеддльсона - положительная-положительная. РПГА - отрицательная - 1:50. Проба Бюрне через 48 часов - отек 4x3,5 см.

Клинические, бактериологические, серо-аллергические показатели у больного определяли признаки как первично-хронического, так и латентного бруцеллеза.

При цитохимическом исследовании больного выявлено, что активность пероксидазы в нейтрофилах крови составила 2,89-2,96; неспецифической эстеразы 1,12-1,76; щелочной фосфатазы 0,36-0,48; лизосомальных катионных белков 2,06-2,23 единиц Кэплоу.

Выявленная степень активности пероксидазы, неспецифической эстеразы, щелочной фосфатазы, лизосомальных катионных белков в нейтрофилах периферической крови в комплексе с эпидемиологическим анамнезом, клиническим признаками, результатами кожно-аллергической пробы. Бюрне, серологической реакций, бактериологической исследования позволит диагноцировать у больного К. первично-клиническую форму бруцеллеза.

Таким образом, изобретение реально осуществимо, его использование в медицинской практике позволит повысить точность диагностики различных форм бруцеллеза и эффективность лечения.

Изобретение относится к медицине, а, именно, к диагностике бруцеллеза цитохимическими методами.

С целью повышения достоверности диагностики различных форм бруцеллеза предлагается проводить диагностику между формами бруцеллеза хронической и резидуальной, хронической и первично-хронической, первично-хронической и латентной, при этом хроническую форму диагностировать при показателях активности ферментов в единицу Кеплоу по миелопероксидазе 2,48-2,94; неспецифической эстеразе 2,54-2,94; щелочной фосфатазе 0,6-1,0; катионному белку 2,1-2,42; резидуальную - при 1,82-2,06; 1,3-1,69; 0,37-0,89; 2,03-2,23; первично-хроническую - при 2,88-2,98; 1,0-1,8; 0,34-0,5; 2,05-2,25; латентную - при 2,15-2,25; 1,93-2,63; 0,71-0,81; 1,6-2,0, соответственно.

Способ дифференциальной диагностики клинических форм бруцеллеза у людей, включающий определение цитохимических показателей ферментативных реакций в нейтрофилах периферической крови, отличающийся тем, что диагностику проводят между формами бруцеллеза хронической и резидуальной, хронической и первично-хронической, первично-хронической и латентной, при этом хроническую форму диагностируют при показателях активности ферментов в единицах Кеплоу по миелопероксидазе 2,48 2,94, неспецифической эстеразе 2,54 2,94, щелочной фосфатазе 0,6 1,0, катионному белку 2,1 2,42, резидуальную при 1,82 - 2,06, 1,3 1,69, 0,37 0,89, 2,03 2,23, первично-хроническую при 2,88 - 2,98, 1,0 1,8, 0,34 0,5, 2,05 2,25, латентную при 2,15 2,25, 1,93 - 2,63, 0,71 0,81, 1,6 2,0, соответственно.