КАРКАСЫ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБЫ ИХ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2007 года по МПК A61L27/42 A61L27/44 A61L27/56 A61P19/00 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к каркасам, изготовленным из композиционных материалов, для инженерии костной ткани человека, в частности к каркасам, изготовленным из новых медицинских композиционных материалов из микрочастиц, обладающих функцией стимулирования регенерации костной ткани человека, способам их изготовления и их применению для инженерии костной ткани человека.

Предпосылки к созданию изобретения

Инженерия костной ткани человека имеет дело с процессом использования абсорбируемых биологических материалов, таких как каркасы, для стимулирования регенерации собственной костной ткани. Физико-химические свойства и трехмерная структура указанных каркасов являются ключевыми факторами, напрямую влияющими на регенерацию костной ткани. Основанные на критерии молекулярного соответствия биологических материалов материалы трансплантационных устройств для тела человека или каркасов для инженерии тканей должны быть безопасными и обладать биологической активностью для стимулирования регенерации соответствующих тканей человека и восстановления ассоциированных физиологических функций на клеточном и молекулярном уровне (Chou, et al. J. Cell Sci., 1995, 108: 1563-1573; Chou, et al. J. Biomed. Mater. Res., 1996, 31:209-217; Chou, et al., J. Biomed. Mater. Res., 1998, 39:437-445).

В предшествующем уровне техники комбинацию материалов для каркасов главным образом выбирают из природного коллагена, фосфата кальция или органических полимеров. Природный коллаген имеет возможные недостатки, такие как высокая стоимость, худшие физиологические качества, более легкое распространение заболеваний и индукция гиперчувствительности в организме человека (Pachence and Kohn, Biodegradable polymers for tissue engineering in Principles in tissue engineering, 1997, pp.273-293). Фосфат кальция (Kukubo, et al. J. Mater. Science, 1985, 20:2001-2004; Feinberg, et al. Shanghai Journal of Stomatology, 2000, 9:34-38 and 88-93) имеет такой недостаток, как плохая способность сокращаться, и проявляет биологическую активность, стимулирующую регенерацию костной ткани человека (Chou, et al. Biomaterials, 1999,20:977-985). Органические полимеры, как, например, поли(молочная кислота) (ПМК) поли(гликолевая кислота) (ПГК) или смесь ПМК И ПГК (ПМГК), также имеют некоторые недостатки: кислотные продукты деградации, высвобождаемые при деструкции указанного полимера, могут вызывать воспалительную реакцию и чужеродную реакцию в тканях организма человека и, следовательно, влиять на регенерацию костной ткани. Более того, эти полимеры не обладают биологической активностью, которая стимулирует регенерацию костной ткани человека (Hubel, Bio/Technology, 1995, 13(6):565-576; Thomson, et al. Polymer scaffolds processingin principles inTissueEngineering, 1997, pp.273-293; Cao, et al. Plast Reconstr. Surg. 1997, 100:297-304; Minuth, et al. Cell Tissue Research, 1998, 291(1): 1-11; Wong Yulai, et al. Shanghai Journal of Stomatology, June 2000, 9(2):94-96). В предшествующем уровне техники имеют место попытки трансплантировать некоторые биологически активные белки, такие как клеточный связывающий белок (cell binding protein) или костный индуцирующий белок (bone inducing protein), на неактивных полимерных каркасах (Barrea, et al, Macromolecules 1995, 28:425-432; Ugo and Reddi, Tissue engineering, morphogenesis, and regeneration of the periodontal tissue by bone morphogenetic proteins, 1997). Но эти способы вряд ли могут быть осуществлены в клинических условиях ввиду высокой стоимости, нестабильности и неоднородности трансплантируемых белков и трудностей стерилизации каркасов. Патент США 5977204 описывает каркасы, изготовленные из композиционного материала, содержащего органический полимер и биостекло (биокерамику). Указанное биостекло было впервые описано в Патенте США 4103002. Там использовали комбинацию кремния, кальция и фосфора для улучшения биосовместимости между указанным материалом и костной тканью человека, но не для стимулирования регенерации костной ткани. Фактически и Патент США 5977204, и Патент США 4103002 не описывают с полной определенностью активность кремния в отношении стимулирования регенерации костной ткани и не упоминают о синергическом стимулирующем действии кальция и фосфора. Кроме того, материалы, раскрытые в обоих патентах, включают в себя натрий. Однако натрий не обладает стимулирующей активностью в отношении регенерации костной ткани. Следовательно, в соответствии с принципами молекулярной совместимости биоматериалов, каркасы, как заявлено в Патенте США 5977204, не обладают значительной биологической активностью в отношении стимулирования регенерации костной ткани. Кроме того, в процессе, описанном в указанном патенте, при изготовлении каркасов из указанного композиционного материала используют органические растворители, которые в результате могут приводить к цитотоксичности в организме человека. Патент США 6051247 раскрывает композиционный материал, содержащий биостекло из Патента США 4103002 и полисахарид (такой, как декстран), пригодный для репарации костных дефектов. Но указанный композиционный материал используют только для создания пасты или замазки, которые не подходят для изготовления каркасов, обладающих точной трехмерной структурой и определенной устойчивостью к давлению для тканевой инженерии. Кроме того, комбинация биостекла указанного композиционного материала является неактивной в отношении стимулирования регенерации костной ткани. Биостекло, используемое в Патентах США 5977204, 4103002 и 6051247, имеет средний размер частиц (диаметр) более чем 70 микрон. Такие большие частицы заметно влияют на физические свойства композиционных материалов, и неорганические элементы не могут равномерно высвобождаться при разложении материалов каркасов. Патенты США 4192021 и 5017627 раскрывают композиционный материал, содержащий органический полимер и фосфат кальция, который может быть использован для изготовления каркасов для репарации костных дефектов. Однако этот композиционный материал является неактивным в отношении стимулирования регенерации костной ткани, и микропористость и диаметр пор, предусмотренные для указанных каркасов, не подходят для имплантации и регенерации костных клеток. Патент США 5552454 раскрывает композиционный материал, в котором фосфат кальция наносят на поверхность органических полимерных частиц. Эта модель не обладает как стимулирующим влиянием на регенерацию костной ткани, так и не может быть использована для достижения точной трехмерной структуры каркасов для тканевой инженерии.

Трехмерная структура каркасов для инженерии костной ткани человека является важной для регенерации и костной ткани, и кровеносных сосудов в новой кости. В предшествующем уровне техники в Патентах США 5977204, 4192021, 5017627 и 5552454 конструкция всех каркасов в виде однородной пористой или непористой модели, где конфигурация поры, размер поры и распределение пор в пористых каркасах равномерные. Однако такие каркасы со сходным и равномерным распределением пор не подходят для регенерации костной ткани. В примерах использования таких каркасов, описанных в предшествующем уровне техники, диаметр пор в каркасах находится в интервале от 150 до 400 микрон. Этот диаметр недостаточно крупный для обеспечения возможности проникновения клеток человека в центральную часть данных каркасов. Таким образом, регенерация костной ткани происходит только на 2-3 мм вокруг этих каркасов. В другом аспекте, относительно большой диаметр пор (более чем 400 микрон) не подходит для регенерации костной ткани. (Cartner and Mhiatt, Textbook of Histology, 1997; Tsuruga et al, J. Biochem., 1997, 121:317-324; Gauthier et al, J Biomed. Mat. Res., 1998, 40:48-56). В соответствии с молекулярной совместимостью биологического материала, регенерация кровеносных сосудов в центральной части каркасов является ключевой для роста новой кости в данных каркасах, с кровеносными сосудами, в основном образованными только в каналах, имеющих диаметр более чем 400 микрон. Следовательно, каркасы предшествующего уровня техники, имеющие однородные поры, не соответствуют различным требованиям одновременных регенерации кости и регенерации кровеносных сосудов, и, таким образом, практическое использование таких каркасов для инженерии костной ткани ограничено.

Следовательно, из предшествующего уровня техники видно, что существует большая потребность в каркасах, пригодных для инженерии тканей человека, которые являются биологически активными для стимуляции пролиферации и дифференцировки остеобластов человека, способствуют формированию и кальцификации новой кости и восстанавливают соответствующие физиологические функции на клеточном и молекулярном уровне.

Объект изобретения

Объектом настоящего изобретения является получение каркасов, свободных от органического растворителя и имеющих трехмерную структуру и внешнее анатомическое строение, которые получают с помощью метода горячего литья без использования органического растворителя на основе принципов молекулярной совместимости биоматериалов, с использованием композиционного материала из микрочастиц, изготовленного из комбинации микрочастиц кремния, кальция и фосфора в качестве биологически активного вещества каркасов, которые могли бы активно стимулировать пролиферацию и дифференцировку остеобластов человека и способствовать формированию и кальцификации новой кости. В комбинации с органическим полимером в определенном соотношении, в качестве носителя, указанный композиционный материал является биологически активным для стимулирования регенерации костной ткани и обладает желаемыми физическими свойствами. Полученные в результате каркасы могут быть использованы в инженерии костной ткани человека безопасно, практично и эффективно для восстановления дефектов костной ткани, вызванных опухолью, воспалением или ранением, или для ортопедической операции на кости человека.

Краткое изложение сущности изобретения

Для решения поставленных задач, в одном аспекте настоящего изобретения предлагаются составные каркасы для инженерии костной ткани человека, имеющие трехмерную структуру как с микропорами, так и с соединительными каналами, содержащие неорганические микрочастицы кремния в качестве основного индуцирующего вещества для регенерации костной ткани, кальций и/или микрочастицы фосфора в качестве синергического стимулирующего вещества и органический полимер в качестве носителя. В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ изготовления каркасов из композиционного материала для инженерии костной ткани человека, включающий в себя метод горячего литья без использования органического растворителя. В следующем аспекте настоящего изобретения предлагается применение каркасов из композиционного материала для инженерии костной ткани человека при репарации дефекта костной ткани, вызванного опухолью, воспалением или ранением, и при ортопедических операциях на кости человека, с помощью in situ имплантации клеток или имплантации остеобластов, предварительно пролиферированных in vitro, в тело человека.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - влияние микрочастиц кремния, кальция и фосфора на пролиферацию остеобластов, биологическую активность щелочной фосфатазы, синтез и секрецию остеокальцина и кальцификацию кости в организме здоровых людей.

Фиг.2 - сравнение характеристик каркасов, изготовленных из композиционного материала, содержащего микрочастицы кремния, кальция и фосфора и органический полимер (ПМГК), и каркасов, изготовленных только из материала ПМГК, при стимуляции пролиферации остеобластов и биологической активности щелочной фосфатазы в организме здорового человека.

Фиг.3 - сферические каркасы, изготовленные из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция и фосфора, и органический полимер (ПМГК).

Фиг.4 - SEM фотографии (выполненные с помощью сканирующего электронного микроскопа) микропор каркасов, изготовленных из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция, фосфора, и органический полимер (ПМГК).

Фиг.5 - Фотографии цилиндрических каркасов, имеющих трехмерную структуру, состоящую из микропор и соединительных каналов, изготовленных из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция, фосфора, и органический полимер (ПМГК), с помощью метода горячего литья.

Фиг.6 - экспериментальная модель реконструкции на животном мыщелкового отростка височно-нижнечелюстного сустава человека, с помощью тканевой инженерии.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на длительном и интенсивном исследовании на предмет поиска элементов в виде микрочастиц, для использования в качестве химических компонентов для изготовления каркасов для инженерии костной ткани человека, указанный элемент в виде микрочастиц является биологически активным стимулятором регенерации костной ткани человека, саморазлагаемым нейтрализующим кислотные или щелочные вещества вокруг каркасов in vivo. Изначально были разработаны каркасы для инженерии костной ткани человека, в которых микрочастицы кремния использованы в качестве основного активного компонента для стимуляции пролиферации и дифференцировки остеобластов человека, формирования кости и кальцификации; микрочастицы кальция используют в качестве активного компонента для синергической стимуляции пролиферации и дифференцировки остеобластов; микрочастицы кальция и фосфора используют в качестве активных компонентов для синергической стимуляции кальцификации регенерированной кости. Эти комбинации элементов биологически нетоксичны, активно стимулируют регенерацию костной ткани, разрушаются in vivo и могут замещаться новой костью. Таким образом удается избежать использования белковых продуктов при инженерии ткани, снизить стоимость производства и повысить безопасность и эффективность каркасов в клинической практике. Биологически активная комбинация каркасов по настоящему изобретению отличается от каркасов из биостекла, раскрытых в Патенте США 5977204, в которых биологически активная комбинация по настоящему изобретению включает в себя только кремний или содержит кремний в качестве основного компонента и определенное соотношение кальция и/или фосфора, но без натрия. Кроме того, диаметры частиц элементов по настоящему изобретению отличаются от таковых у материалов предшествующего уровня техники. Следовательно, настоящее изобретение относится к выбору новых химических веществ и комбинации их соотношений для регенерации костной ткани. В настоящем изобретении использован органический полимер, такой как ПМК, ПГК или ПМГК, в качестве носителя для указанных микрочастиц кремния, кальция, фосфора, который соединяет указанные микрочастицы кремния, кальция и фосфора для формовки, и обеспечивает устойчивость к давлению указанных каркасов. Микрочастицы кремния, кальция и фосфора в композиционном материале применяют в качестве биологически активных компонентов указанных каркасов, и, следовательно, указанные каркасы служат в качестве резервуара для указанных биологически активных компонентов. Указанные биологически активные компоненты медленно, непрерывно и равномерно высвобождаются из каркасов, когда указанный органический полимер разрушается in vivo, для стимуляции формирования кости и нейтрализации кислотных продуктов деструкции указанного органического полимера, обеспечивая подходящую окружающую среду для регенерации костной ткани. Следовательно, настоящее изобретение обращается к разрешению проблем, лежащих в основе предшествующего уровня техники, состоящих в том, что каркасы инженерии костной ткани человека лишены биологической стимуляции и не могут быть использованы для репарации дефектов кости большого размера.

В настоящем изобретении все неорганические элементы представляют собой микрочастицы, отличные от элементов из Патента США 5977704, относящихся к элементам в виде частиц с диаметром более чем 50 микрон. Если не оговорено иного, «микрочастицы» по настоящему изобретению определены как частицы, имеющие диаметр равный или меньший, чем 10 микрон, предпочтительно в виде наночастиц, имеющих диаметр менее чем 1000 нм, более предпочтительно, менее чем 100 нм, наиболее предпочтительно от 5 до 80 нм. В объеме настоящего изобретения микрочастицы кремния, кальция и фосфора, имеющие диаметр более 100 нм или менее 10 микрон, также могут быть использованы для достижения цели настоящего изобретения, поскольку они также обладают биологическим стимулирующим действием. Единственное отличие состоит в том, что такие микрочастицы обладают более слабым стимулирующим действием, поскольку они медленнее распадаются и диффундируют. Диаметр микрочастиц, используемых в настоящем изобретении, явно меньше диаметра микрочастиц, используемых в материалах каркасов предшествующего уровня техники для инженерии костной ткани. Кроме того, данный диаметр микрочастиц, используемых в настоящем изобретении, способствует равномерному распределению химических элементов в каркасах, равномерному высвобождению указанных химических элементов из каркасов и может улучшать устойчивость каркасов к давлению.

В настоящем изобретении, если не оговорено иного, «биологически активное стимулирующее вещество» определено как вещество, которое может активно стимулировать нормальные клетки к пролиферации и специфической дифференцировке, для выполнения характерной для них физиологической функции. Элементы кремния, кальция и фосфора по настоящему изобретению являются биологически активными стимулирующими веществами, которые могут активно стимулировать нормальные остеобласты человека к пролиферации и стимулировать ряд определенных физиологических функций остеобластов (как, например, биологическую активность щелочной фосфатазы, синтез и секрецию остеокальцина и кальцификацию кости). Все комбинации неорганических элементов в каркасах предшествующего уровня техники не обладали биологической стимулирующей активностью подобно той, которой обладает комбинация по настоящему изобретению.

В настоящем изобретении, если не оговорено иного, «каркасы для инженерии костной ткани человека» определены как каркасы, которые имеют характерную трехмерную структуру и конфигурацию, совместимую с анатомической морфологией поврежденной области кости человека, изготовленные из биологического материала, который является и безопасным и биологически активным, и может быть абсорбирован in vivo в течение определенного периода. В тех случаях, когда такие каркасы имплантируют in vivo, они обеспечивают благоприятные окружающие условия для пролиферации и дифференцировки остеобластов и способствуют постепенному образованию новой кости в данных каркасах, тогда как материал рамки указанных каркасов постепенно абсорбируется и, в конце концов, исчезает in vivo, местоположение указанных каркасов замещается новой костью. У всех каркасов предыдущего уровня техники отсутствует специфическая трехмерная структура, сходная со структурой каркасов по настоящему изобретению.

Впервые испытан и использован неорганический элемент «кремний» в качестве основного активного вещества в каркасах, который обладает биологически активным стимулирующим действием при инженерии костной ткани человека. Экспериментальные данные нормальных остеобластов человека, показанные на Фиг.1, подтверждают, что ионы кремния, добавленные в клеточную культуральную среду, обладают значительным индуцирующим и стимулирующим действиями (в 2-4 раза) на ключевые биологические показатели при формировании новой кости, такие как пролиферация остеобластов, биологическая активность щелочной фосфатазы, синтез и секреция остеокальцина и кальцификация кости, и т.д. Данные, касающиеся экспериментальных моделей на животных, показанные на Фиг.3, дополнительно подтверждают, что после того, как частицы неорганического элементарного кремния имплантировали in vivo, частицы неорганического кремния диффундируют в окружающие мягкие ткани и вызывают повышение концентрации иона серы, что характеризует раннюю стадию (две недели) формирования новой кости, а также вызывают повышение концентраций ионов кальция и фосфора, характерное для поздней стадии (8 недель) формирования зрелой и плотной кости. На основании этих данных, настоящее изобретение обеспечивает технический прорыв, т.е. подтверждает специфическое биологическое стимулирующее действие неорганического элементарного кремния, и элементарный кремний может быть использован в каркасах для инженерии костной ткани. Кроме того, данные Фиг.1 показывают, что концентрация кремния прямо пропорциональна его биологическому стимулирующему действию и максимальный стимулирующий эффект кремния появляется при насыщенной концентрации кремния (100 ppm).

Кроме того, экспериментальные данные, показанные на Фиг.1, подтверждают, что комбинация неорганического элементарного кремния и неорганического элементарного кальция и фосфора очевидно обладает синергическим действием на ускорение пролиферации нормальных остеобластов человека и синтез и секрецию остеокальцина и кальцификацию кости. Следовательно, настоящее изобретение использует неорганические элементы кальций и фосфор в качестве синергических веществ для содействия биологической активности ионов кремния.

В настоящем изобретении, если не оговорено иного, во всех комбинациях элементов используют ион кремния в качестве единственного или основного биологического стимулирующего вещества, и кальций и/или фосфор в качестве синергически активных веществ, так, чтобы активно и эффективно стимулировать формирование новой костной ткани. Предпочтительно, проценты содержания атомов в «комбинации элементов, используемой в качестве биологического стимулирующего вещества», составляют 60-100% кремния, 0-30% кальция и 0-20% фосфора, более предпочтительно 60-90% кремния, 0-25% кальция и 0-15% фосфора, и наиболее предпочтительно 60-70% кремния, 20-25% кальция и 10-15% фосфора.

Микрочастицы кремний/кальций/фосфор в указанном биологически активном композиционном материале находятся в виде смеси всевозможных типов отдельных элементарных микрочастиц или получены смешиванием всевозможных типов элементов и сухим размолом обычными физическими или химическими методами. В соответствии с Фиг.1 соответствующее количество атомных элементов в смеси микрочастиц или в микрочастицах сложных элементов не является существенным фактором для достижения цели настоящего изобретения, поскольку различные атомные или массовые соотношения приводят в результате только к различным уровням стимулирующей активности. Следовательно, все комбинации с произвольными атомными или массовыми соотношениями этих трех элементов, где кремний используют в качестве основного биологически активного стимулирующего вещества, а кальций и фосфор используют в качестве синергически биологически активных стимулирующих веществ, могут быть использованы для каркасов по настоящему изобретению.

Неорганические элементы кремний, кальций и фосфор определены как биологически активные элементы, которые обладают способностью стимулировать пролиферацию костной ткани человека, дифференцировку остеобластов и кальцификацию кости. Это также является важным научным достижением в области биоматериалов. В предшествующем уровне техники считалось, что синтезированные или экстрагированные экзогенные остеогенин, ауксин или коннексин и так далее обладают биологическим стимулирующим действием, но эти биологические продукты недостаточно безопасны, имеют низкую биологическую стабильность и высокую стоимость, и, таким образом, вряд ли могут быть использованы в биоинженерии. Помимо вышеизложенного, стимулирующая активность комбинаций неорганических элементов по настоящему изобретению дополнительно подтверждена близким родством между регенерацией кости и распределением высвобожденного иона кремния на поверхность раздела между имплантированным материалом и тканью, как показано в экспериментальной модели на животных Фиг.3, регенерацией кости - стимулирующим действием композиционного материала, содержащего микрочастицы кремний/кальций/фосфор и ПМГК на модели нормальных остеобластов человека, как показано на Фиг.2, а также данными экспериментальной модели на животных, как показано на Фиг.7. По указанным выше причинам показано, что неорганические элементы кремний, кальций и фосфор могут быть использованы для замены биологически активных белков и для достижения значительного биологического стимулирующего действия. Дополнительно, эти неорганические элементы могут быть использованы в качестве биологически активных материалов в каркасах для инженерии костной ткани человека, для получения безопасных и стабильных каркасов, материал которых может быть легко приготовлен с более низкой стоимостью и большей безопасностью и стабильностью, и для расширения практического применения данных каркасов.

В предшествующем уровне техники органические полимеры (ПМК, ПГК и ПМГК) обычно используют в качестве единственного материала для каркасов. Однако эти полимеры не обладают биологической стимулирующей активностью, и кислотные продукты их разложения в организме человека затрудняют регенерацию костной ткани in vivo. В настоящем изобретении органический полимер используют только в качестве носителя для особой комбинации микрочастиц кремния, кальция и фосфора. Согласно результатам испытания каркасов, имеющих отличные от носителя свойства, при содержании неорганических элементов в комбинации более чем 80%, устойчивость каркасов к давлению будет относительно слабее, следовательно, специфическая пространственная структура не может сохраняться в организме животного, а при содержании комбинации неорганических элементов менее 20%, биологическая стимулирующая активность будет недостаточной для ускорения окончательного образования новой кости в течение 8 недель. Для достижения компромисса между устойчивостью к давлению и биологической активностью данных каркасов настоящее изобретение определяет объемное отношение комбинации кремний/кальций/фосфор к органическому полимеру в диапазоне от 80:20 до 20:80, предпочтительно от 70:30 до 30:70, в соответствии с биологическими испытаниями примеров, относящихся к Фиг.2, Фиг.4 и Фиг.6. В этом диапазоне может быть откорректирована растворимость композиционного материала каркасов. При увеличении содержания комбинации кремний/кальций/фосфор возрастает биологическая активность, стимулирующая регенерацию костной ткани. Количества этих двух материалов могут быть установлены в этом интервале для соответствия различным требованиям для восстановления костной ткани человека. В настоящем изобретении использована комбинация биологически активных веществ и органический полимер, формирующий каркасы, которые могут служить в качестве резервуара для таких биологически активных веществ. При растворении органического полимера (ПМК, ПГК, ПМГК) in vivo (от 1 до 8 недель) микрочастицы кремния/кальция/фосфора непрерывно и стабильно высвобождаются, стимулируя пролиферацию и дифференцировку остеобластов и образование и кальцификацию кости во время всего процесса регенерации кости. Кроме того, высвобождение наночастиц кремния/кальция/фосфора может нейтрализовать кислотные продукты разрушения органического полимера, в результате чего локальное окружение вокруг каркаса благоприятно для регенерации костной ткани.

В предшествующем уровне техники любые фосфаты кальция или биостекло для репарации костных дефектов представляют собой крупные частицы, имеющие диаметр больше 50 микрон. При использовании таких крупных частиц в композиционном материале будут затронуты физические свойства указанного композиционного материала. Кроме того, высвобождение крупных частиц встроенных в органический полимер каркасов не является равномерным. Поэтому в настоящем изобретении использованы микрочастицы кремния/кальция/фосфора, имеющие диаметр менее чем или равный 10 микрон, предпочтительно менее чем 1000 нм, более предпочтительно менее чем 100 нм и наиболее предпочтительно в интервале 5-80 нм, так, что указанные микрочастицы равномерно встроены в органический полимер и медленно и равномерно высвобождаются во время разрушения указанного органического полимера. Данные микрочастицы получены путем смешивания микрочастиц каждого из трех элементов в соответствии с атомным содержанием, как определено в настоящем изобретении.

В предшествующем уровне техники трехмерная структура различных каркасов является микропористой с одинаковым диаметром пор и равномерным распределением. Недостаток этих каркасов состоит в том, что относительно мелкие микропоры (имеющие диаметр менее чем 300 микрон) неблагоприятны для прохождения остеобластов и кровеносных сосудов, и относительно крупные микропоры (имеющие диаметр более 400 микрон) неблагоприятны для регенерации костной ткани. Поэтому практическое использование этих каркасов в биоинженерии кости явно ограничено. В настоящем изобретении использованы каркасы, имеющие трехмерную структуру, содержащую как микропоры, так и соединительные каналы, как показано на Фиг.6. Согласно результатам испытаний других диаметров, поры с диаметром менее 100 микрон не подходят для прохождения клеток, а поры с диаметром более 300 микрон не подходят для образования новой кости. Поэтому все каркасы, используемые в Примерах изготовления и биологических испытаниях, как показано на Фиг.4-7 имеют микропоры с диаметром в интервале от 100 до 300 микрон. Микропоры с диаметром, определенным в настоящем изобретении, подходят для пролиферации остеобластов и регенерации новой кости. Занятость микропор по настоящему изобретению составляет от 50% до 90%. Например, занятость микропор каркасов, используемых в Примерах, как показано на Фиг.4, Фиг.6 и Фиг.7, составляет 80%, 50% и 50%, соответственно.

В соответствии с результатами испытаний для другой занятости микропор, физическая устойчивость каркасов к давлению с занятостью микропор более чем 90% явно слабее и недостаточна для сопротивления давлению окружающих тканей, тогда как остеобласты вряд ли могут проникнуть в каркасы для образования новой кости при занятости микропор менее чем 50%. В соответствии с результатами испытаний различных диаметров соединительных каналов, при диаметре большем, чем 500 микрон, устойчивость каркасов к давлению явно слабее, и затруднен неогенез большого объема костной ткани, тогда как проникновение клеток и образование костной ткани затруднены в том случае, когда диаметр менее 350 микрон. Следовательно, диаметр соединительных каналов по настоящему изобретению находится в интервале от 350 до 500 микрон, для обеспечения вхождения клеток в глубину каркасов и снабжения питательными веществами и кислородом новой кости через новые кровеносные сосуды, которые растут вдоль указанных соединительных каналов внутрь каркасов. В соответствии с результатами испытаний расстояний между соединительными каналами, устойчивость каркасов к давлению слабее в тех случаях, когда расстояние составляет менее чем 3 мм, в то время как вхождение клеток во все микропоры каркасов для образования новой кости затруднено в тех случаях, когда расстояние составляет более чем 6 мм, следовательно, оно не подходит для образования новой кости. Поэтому промежуток между соединительными каналами по настоящему изобретению находится, предпочтительно, в интервале от 3 до 6 мм для обеспечения равномерного вхождения клеток внутрь всех микропор через соединительные каналы. Настоящее изобретение использует комбинированные элементы с трехмерной структурой, содержащей как соединительные каналы, так и концентрически расположенные микропоры, которые могут быть повторно сгруппированы (подобно кирпичикам) для формирования разнообразных каркасов более крупного размера для репарации больших костных дефектов. Эта новая трехмерная структура содержит микропоры, полезные для регенерации кости, и соединительные каналы, благоприятные для равномерного распределения клеток, переноса питательных веществ тканям человека и регенерации кровеносных сосудов в новой кости, и, следовательно, может быть использовано для репарации костных дефектов большого размера, которые не могли быть восстановлены в предшествующем уровне техники. В отношении каркасов небольшого размера, имеющих размер менее 5 мм, или различных костных дефектов, имеющих склеротические остатки, в соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы каркасы, имеющие только микропоры и разнообразные формы, такие как сферическая форма, цилиндрическая форма или квадратная форма, как показано на Фиг.4 и Фиг.6.

Анатомическая форма каркасов по настоящему изобретению для инженерии костной ткани человека может быть разделена на две группы, а именно изготовленная предварительно форма и нестандартная, подгоняемая форма, в зависимости от расположения и размера костного дефекта. Изготовленные заранее каркасы могут быть различной формы, такой как сферическая форма, цилиндрическая форма или квадратная форма и т.д. В тех случаях, когда диаметр изготовленных предварительно каркасов менее 5 мм, в каркасах будут только микропоры без соединительных каналов. Эти каркасы небольшого размера могут быть различных диаметров в интервале от 0,5 мм до 5 мм. Изготовленные предварительно каркасы, имеющие размер больше 5 мм, сконструированы в виде совокупности комбинированных элементов, содержащих и микропоры, и соединительные каналы различных размеров и форм, так, чтобы максимально заполнить пространство костного дефекта. Изготовленные предварительно каркасы используют для заполнения поврежденных участков кости различного размера и формы и различных локализаций в теле человека для регенерации костной ткани. В нестандартных, подгоняемых каркасах используют сканограмму кости человека в качестве шаблона для конструирования формы каркасов, соответствующих анатомической морфологии кости человека, и данные каркасы имеют комбинированную структуру, содержащую как микропоры, так и соединительные каналы, которые могут быть использованы для репарации больших костных дефектов, при ортопедических операциях на кости человека и для лечения в случаях отсутствия сохранившейся стенки кости для сохранения формы.

Кроме того, в предшествующем уровне техники для изготовления органических полимерных каркасов для биоинженерии обычно используют органические растворители. Поскольку органические растворители практически не могут быть полностью удалены из каркасов, это вредно для регенерации костной ткани человека. В отличие от способа изготовления каркасов для инженерии костной ткани человека, известного в предшествующем уровне техники, способ по настоящему изобретению использует обычный метод горячего литья для изготовления изготавливаемых предварительно или нестандартных, подгоняемых каркасов для биоинженерии. Способом по настоящему изобретению можно избежать цитотоксичности, вызванной остаточным органическим растворителем в каркасах из предшествующего уровня техники, и можно снизить стоимость серийного производства каркасов.

Клиническое применение каркасов по настоящему изобретению для инженерии костной ткани человека включает в себя in situ имплантацию клеток in vivo или имплантацию клеток, пролиферированных in vitro. In situ имплантация клеток in vivo включает в себя прямую имплантацию изготовленных предварительно каркасов небольшого размера в полость дефекта кости человека во время оперативного вмешательства, напрямую используя недифференцированные интерстициальные клетки, изобилующие в крови, и тканевый эксудат, попавший в полость костного дефекта во время хирургического вмешательства, для инфильтрации в пространство между порами каркасов и стимулирования регенерации кости под действием материала каркасов. Следовательно, такой способ может быть использован для репарации дефекта кости в безударном участке с остаточной наружной стенкой кости. Имплантированные изготовленные предварительно каркасы представляют собой комбинацию каркасов с размером более чем 0,5 мм. Например, сферические и цилиндрические каркасы, как показано на Фиг.4 и Фиг.6, используют в вышеупомянутых способах. Имплантацию клеток, пролиферированных in vitro, используют для репарации костных дефектов в ударном участке или в участке без остаточной наружной стенки кости. Источник нормальных аутогенных остеобластов человека, необходимых в больших количествах для репарации костных дефектов большого размера путем имплантации их внутрь каркасов, всегда представляет собой серьезную проблему в области медицины. Имплантация пролиферированных in vitro аутогенных остеобластов здорового человека, используемых в настоящем изобретении, может решить эту проблему. Настоящее изобретение использует аутогенный поверхностный скелетный фрагмент, полученный от пациента в качестве источника остеобластов. 0,2 см³ поверхностного скелетного фрагмента может пролиферировать in vitro с образованием 6-10 миллионов аутогенных остеобластных клеток, имеющих нормальную активность остеогенеза, как показано на Фиг.7. Более того, это не оставляет шрамов, не оказывает ни функционального, ни физического влияния на участок сбора. 55 миллионов пролиферированных клеток остеобластов достаточно для снабжения каркасов для регенерации 2 см³ нормальной аутогенной кости. В клинической практике, нестандартные подгоняемые каркасы вкладывают в область костного дефекта после того, как размноженные клетки остеобластов имплантированы внутрь указанных каркасов in vitro, и кость зафиксирована лигирующими поддерживающими шинами с помощью обычной операции на кости. При регенерации новой кости в каркасах, поддерживающую силу указанных шин постепенно ослабляют, нагрузку на новую кость постепенно увеличивают, и в итоге восстанавливаются физиологические функции регенерированной кости (см. ниже «Экспериментальная модель на животном реконструкции мыщелкового отростка височно-нижнечелюстного сустава человека с помощью инженерии ткани»).

По сравнению с предшествующим уровнем техники, положительные свойства настоящего изобретения состоят в том, что применение микрочастиц кремний/кальций/фосфор, обладающих стимулирующим действием на регенерацию кости человека, в качестве биологически активного материала обеспечивает биологическую эффективность каркасов по настоящему изобретению значительно выше, чем у тех каркасов, которые известны в предшествующем уровне техники без биологического стимулирующего действия; применение комбинированных элементов, содержащих как микропоры, так и соединительные каналы в данных каркасах, способствует равномерному распределению клеток человека и регенерации кровеносных сосудов в данных каркасах, решая проблему того, что регенерированная кость только ограничена в локальной зоне, окружающей каркасы предшествующего уровня техники. Более того, репарация и регенерация больших дефектов кости человека, недостижимые в предшествующем уровне техники, в настоящее время могут быть достигнуты в настоящем изобретении путем повторной группировки комбинации элементов каркасов с трехмерно подобранной структурой для образования достаточного объема.

Настоящее изобретение далее проиллюстрировано следующими не ограничивающими Примерами в комбинации с чертежами.

Пример 1

Микрочастицы кремния, кальция, фосфора биологически значительно стимулируют пролиферацию остеобластов, биологическую активность щелочной фосфатазы, синтез и секрецию остеокальцина и кальцификацию в организме здорового человека.

Остеобластные клетки человека, используемые в испытании, получали от здоровых доноров в возрасте от 20 до 25 лет. Каждая группа клеток получена с 0,2 см³ поверхностных фрагментов скелета одного донора. Всего в испытании использовали 5 групп клеток. Средние значения и стандартные отклонения данных исследования для 5 групп показаны на Фиг.1. Видно, что 0,2 см³ поверхностного скелетного фрагмента доноров может пролиферировать с образованием 6-10 миллионов аутогенных остеобластных клеток, обладающих остеогенной активностью в лабораторных условиях. В клеточную культуральную среду, используемую в данном испытании, предварительно добавляют частицы кремния, кальция, фосфора с диаметром менее чем 10 микрон в определенных концентрациях или количественных соотношениях, как показано в таблицах Фиг.1, с концентрацией насыщения кремния, составляющей 100 ppm. Во время культивирования культуральную среду с определенными концентрациями частиц заменяют свежей средой, содержащей частицы той же концентрации, каждые 3 дня. На 12-й день и на 20-й день проводят следующие исследования: 1) исследование пролиферации остеобластов: подсчет общего числа клеток, выросших в культуральной среде с различными концентрациями или количественными соотношениями химических добавок с помощью обычного проточного цитометра, и подсчет кратности пролиферации остеобластов, как показано на Фиг.1, на основании количества клеток, прилипших к культуральной чашке в первые 24 часа, показывающий, что неорганический элементарный кремний обладает явным стимулирующим воздействием на пролиферацию остеобластов и стимулирующий эффект прямо пропорционален концентрации кремния. Более того, неорганические элементы кальций и фосфор синергически усиливают биологическое стимулирующее действие кремния; 2) определение биологической активности щелочной фосфатазы. Важной характерной чертой нормальных остеобластов является секреция щелочной фосфатазы с нормальной функциональной активностью. Исследованы клетки, культивированные в условиях, приведенных в таблицах Фиг.1 в течение 12 дней и 20 дней; данные клетки изолированы с помощью plasmase, разрушены обычным ультразвуковым генератором и полученную клеточную суспензию анализируют обычной хроматографией; затем подсчитывают микроэквивалентное количество субстрата, расщепленного под действием щелочной фосфатазы, продуцированной 10 миллионами клеток в час. Данные результаты подтверждают, что неорганический элементарный кремний может усилить биологическую активность и стимулирующие эффекты щелочной фосфатазы пропорционально концентрации кремния; 3) определение синтеза и секреции остеокальцина. Синтез и секреция остеокальцина являются специфическим и важными показателями активности нормальных остеобластов человека. Содержание остеокальцина, секретированного в культуральную среду, определяют обычным гистохимическим методом с использованием моноклонального антитела против остеокальцина человека. Результаты выражены в виде значений в фемтограммах остеокальцина, секретируемого 10 миллионами клеток на 12-й день и на 20-й день. Результаты показали, что неорганический элементарный кремний мог значительно стимулировать увеличение секреции остеокальцина нормальными остеобластами человека. Такой стимулирующий эффект прямо пропорционален концентрации кремния. Более того, неорганические элементы кальций и фосфор действовали синергически, способствуя биологическому стимулирующему действию кремния; 4) исследование кальцификации кости. Отложение кальция в промежутке остеобластов является одним из важных показателей во время финальной стадии образования новой кости. Клетки каждой группы были окрашены на наличие кальция обычными методами на 12-й и 20-й, и интенсивность окрашивания определяли обычным хроматографическим прибором. Результаты показали, что более высокие концентрации кремния, кальция и фосфора существенно и синергически действовали, стимулируя и усиливая кальцификацию нормальных остеобластов человека.

Пример 2

Композиционный материал, содержащий микрочастицы кремния, кальция, фосфора и органический полимер (ПМГК), имеет преимущество по сравнению с только одним ПМГК материалом в стимулировании пролиферации нормальных остеобластов человека и биологической активности щелочной фосфатазы

Это биологическое исследование иллюстрирует стимулирующее действие одной группы миллимикронных композиционных материалов по настоящему изобретению в культуре клеток in vitro и проводит сравнение с только одним органическим полимером ПМГК и обычными полистирольными чашками для клеточной культуры. Содержания атомов неорганических элементов в комбинации элементов композиционного материала составляют 67% кремния, 22% кальция и 11% фосфора и объемное соотношение комбинации неорганических элементов к ПМГК составляет 50:50. Этот композиционный материал и только один органический полимер ПМГК отдельно обрабатывали для получения дисков диаметром 2 см и толщиной 1,5 мм методом горячего литья по шаблону при 200°C в течение 8 часов (подробные стадии см. также в Примере 4). Полученные диски по отдельности помещают в обычные полистирольные чашки для клеточной культуры диаметром 2 см, клетки засевают на различные формованные диски или прямо на обычные полистирольные чашки для клеточной культуры без формованного диска, а затем определяют воздействия различных материалов на культивированные клетки. Три группы тестируемых клеток получены от трех здоровых доноров. Пролиферацию клеток и биологическую активность щелочной фосфатазы определяют методами, представленными на Фиг.1, после этого клетки культивируют в течение 7 дней. Данные, показанные на Фиг.2, представляют собой средние значения и средние отклонения трех групп клеток. Результаты показывают, что диск, изготовленный из композиционного материала по настоящему изобретению, оказывает более сильное биологическое стимулирующее действие, чем диск только из одного ПМНК и чем обычная полистирольная чашка для клеточной культуры.

Пример 3

Распространение (диффузия) и распределение ионов кремния после имплантации кремниевого миллимикронного материала в экспериментальную модель на животном и распределение ионов при стимуляции регенерации новой костной ткани

В настоящем биологическом испытании в качестве экспериментальной животной модели используют белых взрослых кроликов. На малой берцовой кости экспериментального животного с помощью шила делают костную полость диаметром 0,5 см, затем указанную полость заполняют частицами композиционного материала кремний/кальций/фосфор (атомное соотношение Si:Ca:P=67:22:11) с диаметром 50-80 нм, в заключение раненную область ушивают. Испытуемых животных кормят в течение 2 или 8 недель, а затем участок, заполненный композиционным материалом, и окружающие ткани удаляют повторным хирургическим вмешательством, фиксируют 10% формальдегидом, погружают в смолу, разрезают в виде 1 мм слоев по продольному сечению и в заключение определяют распределения ионных концентраций с двух сторон поверхности раздела между участком, заполненным композиционным материалом, и окружающей тканью животного с помощью радиационного ионного анализатора. Данные, показанные в Таблице 1, представляют собой средние значения по 5 группам животных в атомных процентах.

Таблица 1
Распределение концентраций кремния, кальция, фосфора, серы и хлора на поверхности раздела между организмом и имплантированным материаломДве недели+1 мм ← сторона материалаГраница раздела между материалом и телом животногоСторона тела животного → +1 мм → +2 ммКремний14,784,12 8,7913,922,09Кальций28,378,70 9,0114,479,47Фосфор7,317,88 8,4711,6418,51Сера7,8124,26 11,8815,4731,90Хлор24,990 000Восемь недель← сторона материала Сторона тела животного →Кремний12,7221,22 0,410,580,29Кальций56,6437,96 64,6359,9359,44Фосфор17,7634,45 32,4035,9537,96Сера00 000Хлор00 000

Результаты показывают, что ионы кремния высвобождаются из наночастиц кремния и диффундируют в тело животных после имплантации композиционного материала в тело животного в течение 2 недель, в результате чего значительно повышается местная концентрация ионов кремния, а также повышается и концентрация ионов серы, что указывает на активную регенерацию новой кости на ранней стадии. Через 8 недель ионы кремния исчезают в теле животного и значительно возрастает концентрация кальция и фосфора, что указывает на формирование зрелой кости. Эта модель биологического испытания также была протестирована гистологически, и результаты подтверждают, что изображения ткани с двух сторон поверхности раздела соответствуют динамическим изменениям образования новой кости, охарактеризованным вышеизложенными изменениями распределения ионов. Результаты данного биологического испытания подтверждают, что ион кремния оказывает основное биологическое действие на стимуляцию образования новой кости.

Пример 4

Сферические каркасы, изготовленные из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция, фосфора и органического полимера (ПМГК) методом горячего литья

Это пример изготовления сферических каркасов из композиционного материала. Исходными веществами являются диоксид кремния (SiO₂), оксид кальция (CaO) и трифосфат кальция (Ca₅HO₁₃P₃), где содержание атомов составляют 67% кремния, 22% кальция и 11% фосфора соответственно, и массовые соотношения исходных веществ составляют 40% диоксида кремния, 6% оксида кальция и 54% трифосфата кальция соответственно. Данный препаративный процесс включает в себя смешивание вышеуказанных кремний-, кальций- и фосфорсодержащих исходных веществ в соответствии с указанными массовыми соотношениями, измельчение с помощью самовращающейся «Retsch track» мельницы в течение 3 дней до достижения диаметра микрочастиц от 5 до 80 нм. Диаметр микрочастиц подтверждают с помощью электронного сканирующего микроскопа. Органический полимер ПМГК измельчают с помощью электрической дробилки из нержавеющей стали и просеивают через мелкое сито с получением микрочастиц ПМГК диаметром от 25 до 50 микрон. Сферические каркасы, показанные на Фиг.3, изготовлены с комбинацией неорганических элементов и ПМГК в соотношении 70:30. Шаблон готовят из политетрафторэтилена, затем заполняют шаблон частицами исходного кремний-, кальций-, фосфорсодержащего неорганического вещества и органического полимера в вышеуказанном соотношении. После заполнения шаблон агломерируют при 200°C в течение 8 часов в керамической печи, постепенно охлаждают (10°C в минуту) и в заключение снимают форму с получением сферических каркасов, как показано на Фиг.3 (занятость микропор составляет 80% и диаметр микропор составляет от 100 до 300 микрон).

Пример 5

Изображения электронного сканирующего микроскопа показывают микропоры в каркасах, изготовленных из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция, фосфора и органический полимер (ПМГК).

Полученные каркасы, изготовленные из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция, фосфора и органический полимер (ПМГК), разрезают в продольном сечении и их внутренние микропоры изучают с помощью обычного электронного сканирующего микроскопа. Результаты, показанные на Фиг.4, подтверждают, что данные каркасы, изготовленные методом горячего литья, имеют структуру с микропорами, следующими друг за другом (диаметр указанных микропор находится в интервале от 100 до 300 микрон).

Пример 6

Цилиндрические каркасы, изготовленные методом горячего литья из композиционного материала, содержащего наночастицы кремния, кальция и фосфора и органический полимер (ПМГК), имеют трехмерную структуру, содержащую как микропоры, так и соединительные каналы, соединяющие указанные микропоры

Это пример изготовления цилиндрических каркасов из композиционного материала. Исходными веществами являются диоксид кремния (SiO₂), оксид кальция (CaO) и трифосфат кальция (Ca₅HO₁₃P₃), где содержание атомов составляют 67% кремния, 22% кальция и 11% фосфора соответственно, а массовые соотношения исходных веществ составляют 40% диоксида кремния, 6% оксида кальция и 54% трифосфата кальция соответственно. Данный препаративный процесс включает в себя смешивание вышеуказанных кремний-, кальций- и фосфорсодержащих неорганических исходных веществ в указанных массовых соотношениях, измельчение с помощью самовращающейся «Retsch track» мельницы в течение 3 дней до достижения диаметра микрочастиц от 5 до 80 нм. Диаметр микрочастиц подтверждают с помощью электронного сканирующего микроскопа. Органический полимер ПМГК измельчают с помощью электрической дробилки из нержавеющей стали и просеивают через мелкое сито с получением микрочастиц ПМГК с диаметром от 25 до 50 микрон. Стандартные цилиндрические каркасы, показанные на Фиг.6, изготовлены из комбинации неорганических элементов и ПМГК в соотношении 50:50, как изложено ниже. Шаблон готовят из политетрафторэтилена, а затем в указанный шаблон устанавливают несколько проволочек из нержавеющей стали диаметром 350-500 микрон и с интервалом 4 нм в соответствующем направлении. Вышеуказанными исходными веществами заполняют шаблон, агломерируют при 200°C в течение 8 часов в керамической печи, постепенно охлаждают (10°C в минуту) и затем форму удаляют. После снятия цилиндрических каркасов, проволочки из нержавеющей стали извлекают, полученные в результате каркасы показаны на Фиг.5 (занятость микропор составляет 50%; диаметр микропор составляет от 100 до 300 микрон; диаметр соединительных каналов составляет 500 микрон).

Пример 7

Экспериментальная модель на животном реконструкции мыщелкового отростка височно-нижнечелюстного сустава человека с помощью тканевой инженерии

Как показано на Фиг.6a, шаблон из политетрафторэтилена готовят в соответствии с анатомической формой мыщелкового отростка височно-нижнечелюстного сустава человека, и нестандартные, подгоняемые каркасы готовят в соответствии со способом изготовления каркасов, показанным на Фиг.5. Как показано на Фиг.6b, поверхностные скелетные фрагменты получают с поверхностного сегмента пациента посредством следующих стадий: надрезания мягкой ткани в скрытом месте поверхности тела под местной анастезией, экскориации примерно 0,2 см³ поверхностных скелетных фрагментов и культивирования в клеточной культуральной среде. Надрез ушивают. Он заживает от 3 до 5 дней и не влияет на деятельность или вид пациента. Полученный скелетный фрагмент помещают в обычную полистирольную культуральную чашку в камеру для клеточной культуры и культивируют при 37°C. Через 2 недели из 0,2 см³ поверхностных скелетных фрагментов пролиферируют от 6 до 10 миллионов аутогенных остеобластов с нормальной остеогенной активностью, как показано на Фиг.6b. Фиг.6b указывает на позитивные результаты теста отложения кальция с помощью обычного метода «Vancusa» - метода, где коричневые частицы в области скопления костных клеток, окрашенных розовым, являются доказательствами кальцификации кости. По указанным выше причинам эти пролиферированные клетки могут быть использованы в каркасах в лечебной практике. Согласно медицинской практике, для каркасов достаточно 5 миллионов клеток для регенерации и образования 2 см³ нормальной аутогенной кости. Важные стадии включают в себя отделение пролиферированных клеток с помощью plasmase от культуральной чашки, погружение каркасов в клеточный раствор так, чтобы клетки проникали в части каркасов через соединительные каналы и соединительные микропоры каркасов. Каркасы с клетками в них имплантируют в тело животного-модели для исследования (см. Фиг.6c) посредством обычной хирургической операции. В клинической практике каркасы, имплантируемые в тело, фиксируют с помощью лигирующих шин посредством обычной костной хирургии. При регенерации новой кости в каркасах поддерживающую силу фиксирующих шин постепенно ослабляют, нагрузку на новую кость постепенно увеличивают и, в конечном счете, восстанавливаются физиологические функции регенерированной кости. Как показано на Фиг.6d, новые костные ткани формируются в течение 6 недель после имплантации клеток и каркасов в тело. Например, новую кость этого животного-модели изучали путем извлечения имплантированных каркасов хирургическим путем, фиксации 10% раствором формальдегида в течение 24 часов, погружения в твердый парафин, изготовления срезов и окрашивания ткани общепринятым методом. Вновь образованную нормальную кость человека можно наблюдать под обычным оптическим микроскопом, и появление Гарвардовых канальцев (Harvard tubule) подтверждает формирование кости высокой плотности. За среднее время вновь сформированные кровеносные сосуды обнаруживают в месте первоначальных соединительных каналов в каркасах. Эти гистологические данные показывают, что неогенез нормальной костной ткани является достаточным.

Ссылочные документы

1. Barrera DA, Zylstra E, Lansbury PT, Langer R. (1995), Copolymerization and degradation of poly(lactic acid-co-lysine), Macromolecules, 28:425-432.

2. Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, Upto J, Vacanti CA. (1997), Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear, Plast. Reconstr. Surg. 100:297-304.

3. Cartner LP, Hiatt JL. (1997), Textbook of Histology, V.B. Saunders Company, Philadephia.

4. Chou L, Firth JD, Uitto V-J, Brunette DM. (1995), Substratum surface topograph alters cell shape and regulates fibronection, mRNA level, mRNA stability, secretion and assembly in human fibroblasts, J. Cell Sci. 108:1563-1573.

5. Chou L, Firth JD, Nathanson D, Uitto V-J, Brunette DM, (1996) Effects of titanium on transcriptional and post-transcriptional regulation of fibronectin in human fibroblasts. J. Biomed. Mater. Res. 31:209-217.

6. Chou L, Firth JD, Uitto V-J, Brunette DM. (1998a), Effects of titanium substratum and grooved surface topography on metalloproteinase-2 expression in human fibroblasts. J. Biomed. Mater. Res. 39:437-445.

7. Chou L, Marek B, Wagner WR. (1999) Effects of hydroxyapatite coating crystallinity on biosolubility, cell attachment efficiency, and proliferation in vitro. Biomaterials, 20:977-985.

8. Feinberg SE, Holloster SJ, Halloran JW, Chu TMG, Krebsbach PH. (2000) A tissue engineering approach to site-specific reconstruction of skeletal structures of the maxillofacial regions. Shanghai Journal of Stomatology. 9:34-38; 88-93.

9. Gauthier AJ, Ducheyne P. Bettiger D. (1999) Effect of surface reaction stage on fibronectin-mediated adhesion of osteoblast-like cells to bioactive glass. J. Biomed. Mat. Res. 40:48-56.

10. Hubbell JA. (1995) Biomaterials in tissue engineering. Bio/Technology. 13(6):565-576.

11. KuKubo T. ITO S, Shigematsu M, Sakka S, Yamamuro T. (1985) Mechanical properties of a new type of apatite-containing glass ceramics for prosthetic application. J. Mater. Science, 20:2001-2004.

12. Minuth WW, Sittinger M, Kloth S. (1998) Tissue engineering: generation of differentiated artificial tissues for biomedical applications. Cell Tissue Research. 291(1):1-11.

13. Pachence JM, Kohn J. (1997) Biodegradable polymers for tissue engineering, in Principles in Tissue Engineering. By Lanz RP, Langer R, Chick WL. Academic Press, London. P.273-293.

14. Thomson RC, Yaszemski MJ, Mikos AG. (1997) Polymer scaffolds processing. In Principles in Tissue Engineering. By Lanze RP, Langer R, Chick WL. Academic Press, London. P.263-272.

15. Tsuruga E, Hiroko T, Hideaki I, Yuichi W, Yoshinori K. (1997) Pore size of porous hydroxyapatite as the cell-substratum controls BMP-induced osteogenesis. J. Biochem. 121:317-324.

16. Ugo R, Reddi AH. (1997) Tissue engineering, morphogenesis, and regeneration of the periodontal tissue by bone morphogenetic proteins. 8:154-163.

17. Wong Yulai, Cao Yilin, Vacanti, (2000) Experimental studies on condyle of human temporomandibular joint by tissue engineering, Shanghai Journal of Stomatology. Vol.9(2):94-96.

18. Патент США № 4103002, июль 1978.

19. Патент США № 4192021, март 1980.

20. Патент США № 5017627, май 1991.

21. Патент США № 5552454, сентябрь 1996.

22. Патент США № 5977204, ноябрь 1999.

23. Патент США № 6051247, апрель 2000.

Настоящее изобретение относится к каркасам, изготовленным из композиционных материалов, для инженерии костной ткани, в частности к каркасам, изготовленным из новых медицинских композиционных материалов, и их применению в области биомедицинской инженерии, где композиционные материалы содержат биологически активные микрочастицы, которые могли бы стимулировать костную ткань человека к регенерации. В данных каркасах использована комбинация микрочастиц кремния, кальция и фосфора в качестве биологически активного вещества, которая могла бы активно стимулировать остеобласты человека к пролиферации и дифференцировке, способствовать образованию и кальцификации новой кости. Кроме того, в данных каркасах использован органический полимер в качестве носителя, образующий трехмерную структуру и внешнюю анатомическую форму и проявляющий несколько характеристик, сочетаемых с регенерацией костей и неогенезом кровеносных сосудов. Таким образом, данное изобретение может безопасно, экономично и эффективно использоваться для репарации дефекта костной ткани, а также и при ортопедической операции на кости человека. Настоящее изобретение также раскрывает способы изготовления данных каркасов. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 ил.

1. Каркасы для инженерии костной ткани человека, включающие в себя кремнийсодержащие неорганические микрочастицы в качестве основного биологически активного стимулирующего вещества, неорганические частицы кальция и фосфора в качестве вспомогательных веществ для синергетического усиления биологического стимулирующего действия кремния и органический полимер в качестве носителя, причем комбинацию микрочастиц кремний/кальций/фосфор применяют в качестве биологически активного вещества в каркасах для стимулирования регенерации кости, при этом указанные каркасы имеют трехмерную структуру, содержащую как микропоры, так и соединительные каналы, где диаметр микропор составляет от 100 до 300 мкм, а диаметр соединительных каналов составляет от 350 до 500 мкм.2. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где микрочастицы представляют собой смесь микрочастиц кремния, микрочастиц кальция и микрочастиц фосфора, или представляют собой микрочастицы смеси элементов кремния, кальция и фосфора.3. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1 или 2, где диаметр микрочастиц составляет менее или равен 10 мкм.4. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.3, где диаметр микрочастиц составляет менее 1000 нм.5. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.4, где диаметр микрочастиц составляет менее 100 нм.6. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.5, где диаметр микрочастиц составляет от 5 до 80 нм.7. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляют 60-100% кремния, 1-30% кальция и 1-20% фосфора.8. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.7, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляют 60-90% кремния, 1-25% кальция и 1-15% фосфора.9. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.8, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляет 60-70% кремния, 20-25% кальция и 10-15% фосфора.10. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где органический полимер в качестве носителя выбран из группы, состоящей из полимера молочной кислоты (ПМК), полимера гликолевой кислоты (ПГК) или композиционного материала (ПМГК) из ПМК и ПГК.11. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.10, где объемное отношение микрочастиц активных компонентов к органическому полимеру в качестве носителя составляет от 80%:20% до 20%:80%.12. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.11, где объемное отношение микрочастиц активных компонентов к органическому полимеру в качестве носителя составляет от 70%:30% до 30%:70%.13. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где занятость микропор составляет от 50% до 90%.14. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где расстояние между соединительными каналами составляет от 3 до 6 мм.15. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где соединительные каналы и концентрические микропоры образуют объединенные структурные элементы.16. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.1, где формы данных каркасов являются изготовленными предварительно или специально изготовлены подгоняемыми в соответствии с анатомической морфологией.17. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.16, где изготовленные предварительно каркасы имеют форму, выбранную из группы, состоящей из сферической формы, цилиндрической формы и квадратной формы.18. Каркасы для инженерии костной ткани человека по п.16, где нестандартный подгоняемый каркас имеет форму, сконструированную в соответствии с анатомической морфологией дефекта кости человека в виде шаблона, и представляет собой каркас, соединенный со сборными структурными элементами, включающими в себя как соединительные каналы, так и концентрические микропоры.19. Способ изготовления каркасов для инженерии костной ткани человека по любому из пп.1-18, характеризующийся тем, что используют метод горячего литья без применения органического растворителя.20. Применение каркасов для инженерии костной ткани человека по любому из пунктов 1-18 для регенеративной репарации повреждения кости, вызванного опухолью, воспалением или ранением, или для ортопедической операции.21. Применение по п.20, где данное применение достигается путем in situ имплантации клеток в тело человека, или путем имплантации клеток, пролиферированных in vitro.22. Применение по п.21, где in situ имплантация клеток в тело человека включает в себя прямую имплантацию изготовленных предварительно каркасов различных размеров и форм в поврежденную область костного дефекта, содержащих недифференцированные интерстициальные клетки.23. Применение по п.21, где имплантация клеток, пролиферированных in vitro, включает в себя имплантацию указанных пролиферированных in vitro аутогенных остеобластов в большие специально изготовленные подгоняемые каркасы, и последующую имплантацию указанных каркасов в тело человека.24. Применение неорганических микрочастиц, содержащих кремний, кальций и фосфор, для изготовления каркасов для инженерии костной ткани человека для регенеративной репарации костного дефекта и в ортопедических операциях.25. Применение по п.24, где диаметр неорганических микрочастиц меньше или равен 10 мкм.26. Применение по п.25, где диаметр неорганических микрочастиц составляет менее 1000 нм.27. Применение по п.26, где диаметр неорганических микрочастиц составляет менее 100 нм.28. Применение по п.27, где диаметр неорганических микрочастиц составляет от 5 до 80 нм.29. Применение по п.24, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляют 60-100% кремния, 1-30% кальция и 1-20% фосфора.30. Применение по п.29, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляют 60-90% кремния, 1-25% кальция и 1-15% фосфора.31. Применение по п.30, где содержания атомов элементов в неорганических микрочастицах составляют 60-70% кремния, 20-25% кальция и 10-15% фосфора.