Регенеративный материал соединительных тканей, способ получения регенеративного материала, применение регенеративного материала, имплантат Российский патент 2023 года по МПК A61L27/44 A61L27/20 A61L27/24 A61L27/26 A61L27/56 A61C8/00 A61F2/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области регенерации регенеративного материала в соединительных тканях (таких как кость, дентин или пульпа). Более точно, настоящее изобретение относится к безводному регенеративному материалу соединительных тканей, предпочтительно, регенеративному материалу кости, дентина или пульпы, содержащему пористую полимерный матрикс и частицы кальция силиката. Настоящее изобретение относится также к способу получения такого регенеративного материала. Настоящее изобретение также касается применения таких регенеративных материалов, например, в области стоматологии; в особенности, для обеспечения регенеративных материалов с улучшенными биомеханическими и остеоиндуктивными свойствами (т.е. обеспечивающих хорошую миграцию, адгезию и пролиферацию клеток; с усиленными механическими свойствами; и оптимальной и контролируемой биоразлагаемостью).

Предпосылки создания изобретения

Потеря ткани или недостаточность жизненно-важных органов (по причине патологии или травмы) является колоссальной проблемой для общественного здравоохранения. В особенности, в области стоматологии, дефекты зубной кости, вызванные тяжелыми заболеваниями пародонта, экстракцией зуба или резекцией опухоли, при отсутствии лечения приводят к резорбции альвеолярной кости. Такая резорбция кости вызывает, с одной стороны, функциональные, фонетические и анестетические проблемы и, с другой стороны, приводит к тому, что объем кости оказывается недостаточным для имплантации.

В большинстве случаев единственное терапевтическое решение потери ткани ли недостаточности жизненно важных органов связано с трансплантатом.

Во-первых, трансплантация аутогенной кости (т.е. кости, полученной у самого пациента) остается оптимальным материалом благодаря ее остеокондуктивным, остеоиндуктивным и остеогенным свойствам. Однако регенерация небольшой полученной кости, риски резорбции трансплантата и болезненный послеоперационный уход по-прежнему являются основными недостатками этого терапевтического решение.

Другое терапевтическое решение касается трансплантации кости, полученной у донора. Однако ограниченное число доноров, риск отторжения трансплантата по иммунологическим причинам, риск передачи патогенов и обязанность пациента получать специфическое медикаментозное лечение стало причиной поиска исследовательским сообществом альтернативного лечения.

В течение многих лет общепризнанным подходом являлось использование синтетических восстановительных материалов. Принадлежащие к этому классу материалы используются для реконструкции ткани посредством придания прочности структуре ткани либо заполнения пространства, в котором утрачено вещество. В число таких материалов входят несколько разработанных заменителей костной ткани, таких как биоматериалы, содержащие керамические частицы. Например, в европейском патенте 0555807 и патенте США 6214048 описан материал-заменитель кости, который получают в результате смешивания костной муки животного происхождения и апатита.

До настоящего времени восстановительные процедуры, включающие использование замещающих кость материалов ограничиваются заменой поврежденных тканей синтетическими материалами и не предлагают решения для регенерации этих поврежденных тканей. Эти недостатки наряду с агрессивной и инфицированной средой в ротовой полости часто приводят к неудаче лечения.

В этой ситуации возникла тканевая инженерия, которая становится одним из наиболее перспективных подходов в регенеративной медицине и стоматологии. В этой области цель заключается в том, чтобы заместить, поддержать или улучшить функцию человеческих тканей посредством заменителей ткани, включающих биологические элементы. Таким образом, альтернативные замещающие материалы разработаны, чтобы вызвать или стимулировать остеоиндуктивные свойства таких материалов, имплантируемых в организм. Однако в большинстве случаев для терапевтических решений требуется, чтобы медицинский костный имплант содержал остеоиндуктивные факторы (WO 00/45871 и WO 2008/076671).

С учетом имеющихся предпосылок создания изобретения, по-прежнему существует потребность в усовершенствованных восстановительных материалах, 1) которые непосредственно взаимодействуют с биологической средой, например, с тканями; и 2) обладают улучшенными биомеханическими и остеостимулирующими свойствами, в особенности, без необходимости использовать дополнительные традиционные остеондуктивные факторы (такие как биологические остеоиндуктивные факторы). В особенности, существует потребность в обеспечении биосовместимых и рассасывающихся в биологической среде регенеративных материалов, подвергающихся одновременной прогрессивно резорбции во время индуцированного роста кости при сохранении хорошей структурной стабильности in vivo. В отношении материалов, замещающих соединительные ткани, такие как дентин или пульпа, необходимо преодолеть такие же недостатки, которые были описаны в отношении современных материалов заменителей кости. Таким образом, по-прежнему существует потребность в обеспечении регенеративного материала соединительных тканей (таких как кость, дентин или пульпа).

Кроме того, существует также потребность в обеспечении регенеративного материала с кинетикой резорбции, сопоставимой с кинетикой регенеарции замещаемых тканей.

Заявитель неожиданно показал, что трехмерный безводный матрикс биополимера (например, такого как хитозан), содержащий негидратированные частицы кальция силиката, позволяет преодолеть описанные выше недостатки.

Добавление негидратированных частиц кальция силиката позволяет успешно улучшить биологические свойства регенеративного материала соединительных тканей (таких как кость, дентин или пульпа). Преимуществом регенеративного материала соединительных тканей (таких как кость, дентин или пульпа) является диаметр пор, превышающий диаметр клеток, вследствие чего регенеративный материал указанных костных соединительных тканей, таких как дентин или пульпа, улучшает миграцию клеток. Преимуществом регенеративного материала соединительных тканей, таких как кость, дентин или пульпа, является достаточная шероховатость, улучшающая и способствующая клеточной адгезии и пролиферации. Преимуществом материалов по изобретению являются также эластические свойства, соответствующие структуре твердой ткани, вследствие чего указанные материалы сохраняют физическую целостность при использовании.

Краткое изложение сущности изобретения

Таким образом, настоящее изобретение относится к регенеративному материалу соединительной ткани, предпочтительно регенеративному материалу кости, дентина или пульпы, содержащему:

- пористый полимерный матрикс с сообщающимися порами; и

- частицы кальция силиката;

причем:

указанный полимерный матрикс безводный;

указанные частицы кальция силиката негидратированные;

указанные негидратированные частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅o составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикса; и

указанные негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренней поверхности матрикса, образованной порами.

Согласно одному варианту осуществления изобретения пористый полимерный матрикс состоит из или содержит по меньшей мере полимер, выбранный из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров; указанный полимер предпочтительно выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков; более предпочтительно, из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимеров.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимером является хитозан или смесь хитозана и альгината.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани, регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит, по меньшей мере, одну добавку; предпочтительно выбранную из волокон, таких как альгинатные волокна; и рентгеноконтрастные вещества, такие как висмута оксид, стронция карбонат, бария сульфат, тантала оксид, церия оксид, олова оксид, циркония оксид; и пигментов, таких как желтый, красный и коричневый оксид железа.

Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс структурирован и представлен слоями.

Согласно одному варианту осуществления изобретения расстояние между слоями составляет от 50 до 150 мкм.

Согласно одному варианту осуществления изобретения частицы кальция силиката выбирают из частиц дикальция силиката, трикальция силиката или любых смесей этих веществ; предпочтительно частицы кальция силиката представляют собой трикальция силикат.

Согласно одному варианту осуществления изобретения средний диаметр пор превышает 50 мкм; предпочтительно средний диаметр пор составляет от 75 мкм до 900 мкм; более предпочтительно диаметр пор составляет от 100 мкм до 300 мкм.

Изобретение относится также к способу получения регенеративного материала соединительной ткани по изобретению, включающего стадию приведения безводного пористого полимерного матрикса в контакт с суспензией негидратированных частиц кальция силиката в безводном полярном растворителе.

Согласно одному варианту осуществления изобретения способ согласно изобретению дополнительно содержит предварительную стадию получения безводного пористого полимерного матрикса, включающую:

(i) получение водного раствора, содержащего:

- по меньшей мере, один полимер, предпочтительно биоразлагаемый и/или биосовместимый полимер; который предпочтительно выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков; более предпочтительно, из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимеров; и

- необязательно кислоту;

(ii) заливку раствора в форму;

(iii) удаление воды.

Согласно одному варианту осуществления изобретения приспособления для удаления воды выбирают из лиофилизатора, термоиспарителя и вакум-испарителя.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, если полимером является хитозан или хитин, то водный раствор содержит кислоту, предпочтительно, органическую кислоту, более предпочтительно уксусную кислоту.

Согласно одному варианту осуществления изобретения, полярный растворитель выбирают из ацетонитрила, дихлорметана, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетона, метанола, смеси этанола, изопропилового спирта и уксусной кислоты, предпочтительным полярным растворителем является ацетонитрил.

Настоящее изобретение относится также к регенеративному материалу соединительной ткани по изобретению для применения в лечении утраты соединительной ткани у нуждающегося в таком лечении пациента.

Настоящее изобретение относится также к имплантату, содержащему регенеративный материал соединительной ткани по изобретению. Определения

В настоящем изобретении перечисленные ниже термины имеют следующие значения:

- Термин «около», «приблизительно» перед числовым значением означает плюс или минус 10% от указанного значения;

- Термин «ацетонитрил» относится к соединению с формулой CH₃CN;

- Термин «кислота» относится к любому органическому или минеральному соединению, способному акцептировать дублет электронов и передать ион гидрония (Н+);

- Термин «альгинат» относится к солям альгиновой кислоты. Альгиновая кислота, которую выделяют из морской водоросли, представляет собой полуроновую кислоту, состоящую из двух уроновых кислот: D-маннуроновой кислоты L-гулуроновой кислоты. Альгиновая кислота, по существу, нерастворима в воде. Она образует водорастворимые соли с щелочными металлами, такими как натрий, калий и литий; с магнием, аммонием; и с замещенными катионами аммония, образовавшимися из низших аминов, таких как метиламин, этаноламин, диэтаноламин и триэтаноламин. Соли растворимы в водных средах с кислотностью выше рН 4, но превращаются в альгиновую кислоту, когда рН снизится ниже приблизительно рН 4. В присутствии гель-образующих ионов, например, кальция, бария, стронция, цинка, меди, алюминия и их смесей в соответствующих концентрациях образуется не растворимый в воде термонеобратимый гель. Альгинатные гели могут быть солюбилизированы посредством замачивания в растворе растворимых катионов или хелатирующих агентов для гель-образующих ионов, например, ЭДТА, цитрата и т.п.;

- Термин «безводный» или «негидратированный» относится к любому соединению или материалу, не содержащему воду. В особенности, термин «негидратированный» дополнительно означает, что такое соединение или материал не контактировали с молекулами воды;

- Термин «биосовместимый» относится к любому материалу, не вызывающему или вызывающему лишь слабый иммунный ответ у данного организма, либо способному к интеграции с клетками или тканью определенного типа;

- Термин «биоразлагаемый» относится к материалам, которые являются саморассасывающимися, и/или разлагаются и/или разрушаются посредством механического разложения при взаимодействии с физиологической средой на компоненты, которые подвергаются метаболизму или экскреции;

- Термин «биополимер» относится к любому полимеру, встречающемуся у живых организмов;

- Термин «кость» относится к ригидным органам, которые составляют часть эндоскелета позвоночных животных. Например, термин «кость» включает кость, кость, нижнечелюстную кость, губчатую кость и эндесмальную кость;

- Термин «утрата соединительной ткани» относится к любому состоянию, при котором утрачивается плотность соединительных тканей, например, кости, дентина или пульпы. Например, утрата плотности может произойти в результате резорбции, хирургического вмешательства, экстракции зуба, инфекций, травмы, заболеваний и/или старения, такого как старение суставов;

- Термин «регенеративный материал соединительных тканей» относится к любому материалу, используемому для облицовывания утрачиваемых соединительных тканей (таких как кость, дентин или пульпа), для того чтобы вызвать in vivo образование новой самоподдерживающейся ткани;

- Термин «частицы кальция силиката» относится к агрегату, содержащему одно или несколько соединений кальция силиката. Термины «частица кальция силиката» включает также агрегаты, представленные одним или несколькими соединениями кальция силиката;

- Термин «хитозан» относится к продукту, полученному в результате деацетилирования хитина. Хитозан отличается от хитина степенью ацетилирования: при степени ацетилирования выше 50% полимер является хитином, при степени ацетилирования ниже 50% полимер является хитозаном;

- Термин «хитин» относится к полисахариду N-ацетилглюкозамину и глюкозамину;

- Термин «покрытие» относится к частичному или полному нанесению вещества на поверхность;

- Термин «коллаген» относится к белку, содержащему правовращающий пучок из трех параллельных левовращающих спиралей полипролина II типа;

- Термин «соединительная ткань» относится к любой ткани, которая поддерживает и соединяет другие ткани и части тела. Соединительная ткань плотная, содержит большое количество клеток и большое количество межклеточного материала. Межклеточный материал состоит из волокон в матриксе основного вещества, которое может быть жидким, гелеобразным или минерализованным, таким как в кости и хряще. Соединительнотканные волокна могут быть коллагеноподобными или эластичными. Матрикс или окружающие основной материал волокна и клетки представляют собой функциональное вещество, подверженное особым заболеваниям. Термины «соединительные ткани» включают костную ткань, хрящевую ткань, плотную соединительную ткань и волокнистую ткань. Термины «соединительные ткани» включают мягкую соединительную ткань и/или минерализованные соединительные ткани. В одном варианте осуществления изобретения соединительной тканью является кость, дентин и/или пульпа;

- Термин «d₅₀ гранулометрия» в настоящем изобретении относится к значению d₅₀, характеризующему распределение частиц кальция силиката по размеру. Значение d₅₀ означает, что 50% частиц кальция силиката имеют диаметр менее указанного значения. В настоящем изобретении гранулометрические измерения выполнены на аппарате-анализаторе размера частиц Beckman-Coulter LS230 с модулем SVM. Согласно одному варианту осуществления изобретения гранулометрические измерения выполнены с помощью лазерного анализатора.

- Термин «степень деацетилирования» относится к отношению между числом удаленных ацетильных функциональных групп (СН₃СО-) к числу ацетильных функциональных групп, изначально присутствовавших в химическом соединении. Например, хитозан получают в результате деацетилирования хитина, и его степень деацетилирования может составлять от более чем 50% до 100%;

- Термин «дикальция силикат» относится к химическому соединению по формуле Ca₂SiO₄;

- Термин «замораживание» относится к процессу обеспечения замороженного продукта;

- Термин «желатин» относится к неоднородной смеси белков с высокой молекулярной массой, полученной из коллагена и экстрагированной из сырьевых материалов животного происхождения (таких как, например, кожа, сухожилия, связки, кости);

- Термин «гиалуроновая кислота» относится к полисахариду из гликозаминогликанов, содержащему две повторяющиеся субъединицы: β-(1,3)-D-глюкуроновую кислоту и β-(1,4)-N-ацетил-D-глюкозаминовую кислоту. Такой полисахарид встречается, главным образом, в теле человека, в особенности, в соединительной ткани, эпителии и нервной системе;

- Термин «имплантат» относится к любому инородному телу, преднамеренно введенному в тело;

- Термин «расстояние между слоями» относится к самому короткому расстоянию между двумя слоями полимерного матрикса;

- Термин «сообщающиеся поры» или «открытые поры» относится к сети пор;

- Термин «лиофилизация» относится к процессу сушки замороженного продукта посредством сублимации. Сублимированным растворителем может быть вода или спирт;

- Термин «матрикс», «матрица» относится к любой сети материала. В настоящем изобретении этот термин относится к любой полимерной сети;

- Термин «форма» относится к полому контейнеру, используемому для придания формы материалу;

- Термин «монослой» относится к любому компактному двухмерному образованию, состоящему из атомов или молекул. В особенности, в настоящем изобретении термин монослой, предпочтительно, относится к слою, состоящему из соединений кальция силиката. Предпочтительно, толщина слоя соответствует приблизительно значению d₅₀, характеризующему размер частиц соединений кальция силиката;

- Термин «органическая кислота» относится к любому органическому соединению, имеющему в составе по меньшей мере одну карбоксильную группу (-СООН) или сульфонильную группу (-SO₃H);

- Термин «пациент» относится к относится к любому теплокровному животному, предпочтительно, человеку, который ожидает получения или получает медицинскую помощь и являлся/является/будет являться объектом при проведении медицинской процедуры;

- Термин «полярный растворитель» относится к любому растворителю, электрические заряды которого распределены неравномерно, в результате чего дипольный момент молекулы растворителя не равен нулю;

- Термин «поли(капролактон)» относится к полимеру, полученному в результате полимеризации капролактона;

- Термин «полиэфир» относится к любому полимеру, содержащему повторяющуюся структурную единицу, несущую, по меньшей мере, одну сложноэфирную функциональную группу. В настоящем изобретении термин «полиэфир» включает любой полимер, образующийся в результате реакции поликонденсации между двухосновной кислотой и двухатомным спиртом, или полимер, образующийся в результате транс-этерификации полиэфира;

- Термин «поли(гликолевая кислота)», «поли(гликолид)» или «ПГК"

относится к любому полимеру, полученному в результате полимеризации гликолевой кислоты или циклического диэфира гликолевой кислоты;

- Термин «поли(молочная кислота», «полилактид» или «ПМК» относится к любому полимеру, полученному в результате полимеризации молочной кислоты или циклического диэфира лактида;

- Термин «полимер» относится к любой цепи или материалу с высокой молекулярной массой, образующемуся в результате многократного повторения повторяющейся структурной единицы (мономера), где указанные мономеры ковалентно связаны между собой;

- Термин «полипептид» относится к линейному полимеру, содержащему не менее 59 аминокислот, соединенных между собой пептидными связями;

- Термин «полисахарид» относится к любой полимерной углеводной молекуле, состоящей из длинных цепей моносахаридных единиц, соединенных гликозидными связями, которая может быть линейной или разветвленной. Примеры включают крахмал, гликоген, целлюлозу и хитин;

- Термин «пористый» относится к соединению, содержащему макропоры (в котором диаметр пор равен или превышает 50 нм). В настоящем изобретении термин «пористый» предпочтительно относится к соединению, содержащему макропоры с диаметром пор более 50 мкм; предпочтительно, средний диаметр пор составляет от 75 мкм до 900 мкм; предпочтительно от 75 мкм до 750 мкм; более предпочтительно от 100 мкм до 300 мкм; более предпочтительно от 100 мкм до 200 мкм. В настоящем изобретении для измерения диаметра пор используются приемы, хорошо известные специалисту в данной области техники, например, метод Брунауэра-Эммета-Теллера (БЭТ), микротомография, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ);

- Термин «пульпа» относится к соединительной ткани, образующей внутреннюю структуру зуба, включая клетки, внеклеточный матрикс, нервы и кровеносные сосуды;

- Термин «белок» относится к функциональному объекту, образованному из одного или нескольких пептидов или полипептидов;

- Термин «восстановительный» относится к любому остеокондуктивному материалу, предназначенному для имплантации в организм человека, цель которого реконструировать ткань посредством укрепления структуры ткани или заполнения пространства, в котором утрачено вещество;

- Термин «регенеративный материал» относится к материалу, способному вызывать in vivo образование новой самоподдерживающейся ткани;

- Термин «слой» относится к любому крупному, широкому количеству плоского элемента в материале;

- Термин «суспензия» относится к любой жидкости, в которой диспергированы твердые частицы;

- Термин «лечение» относится к терапевтическому лечению, цель которого излечить или замедлить (уменьшить) целевое состояние или нарушение. Субъект или млекопитающее успешно «пролечен» по поводу целевого состояния или нарушения, если после получения регенеративного материала соединительных тканей (таких как кость, дентин или пульпа) по настоящему изобретению у пациента отмечено наблюдаемое и/или измеримое уменьшение одного или нескольких симптомов конкретного заболевания или состояния; и улучшение показателей качества жизни. Вышеперечисленные параметры для оценки успешного лечения и улучшения заболевания или состояния могут быть легко измерены с помощью известных врачу стандартных процедур;

- Термин «трикальция силикат» относится к химическому соединению по формуле Ca₃SiO₉.

Подробное описание изобретения

Регенеративный материал

Как отмечено выше, настоящее изобретение относится к регенеративному материалу. В одном варианте осуществления изобретения регенеративный материал по изобретению обеспечивает минерализованную ткань. В одном варианте осуществления изобретения материал представляет собой регенеративный материал соединительной ткани. В одном варианте осуществления изобретения материалом является регенеративный материал кости, дентина или пульпы.

Согласно одному варианту осуществления изобретения настоящее изобретение относится к регенеративному материалу соединительной ткани (такой как кость, дентин или пульпа), состоящему из или содержащему:

- пористый полимерный матрикс с сообщающимися порами; и

- негидратированные частицы кальция силиката; причем:

указанный полимерный матрикс безводный;

указанные негидратированные частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикса, предпочтительно от 0,05 мкм до 50 мкм; и

указанные негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренней поверхности матрикса, образованной порами.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани (такой как кость, дентин или пульпа) состоит из или содержит:

- пористый хитозан-альгинатный матрикс с сообщающимися порами; и

- негидратированные частицы трикальция силиката; причем:

указанный хитозан-альгиинатный матрикс безводный;

указанные частицы характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикса, предпочтительно от 0,05 мкм до 50 мкм; и

указанные негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренней поверхности матрикса, образованной порами.

Согласно одному варианту осуществления изобретения настоящее изобретение относится к регенеративному материалу соединительной ткани, предпочтительно регенеративному материалу кости, дентина или пульпы, содержащему:

- пористый полимерный матрикс с сообщающимися порами; и

- частицы кальция силиката; причем:

указанный полимерный матрикс безводный и выбран из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров, где указанный полимер осаждается в водном растворе при рН выше 6,5, предпочтительно выше 7;

указанные частицы кальция силиката негидратированные;

указанные негидратированные частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикса;

указанные негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренних стенках пор матрикса; и

при условии, что частицы кальция силиката не являются монокальция силикатом (CaSiO₃).

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не является коллагеновый матриксом, содержащим гидроксиапатит. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит гидроксиапатит. Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не является желатин-хитозановым матриксом, содержащим кальция нитрат. Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не содержит соединения кремния. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс представляет собой трехмерный материал. Согласно первому варианту осуществления изобретения, матрикс не является жидкостью. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не является цементирующим веществом. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не является гелем. В настоящем изобретении термин «гель» относится к любой трехмерной сети твердого вещества, диспергированного в жидкости. В одном варианте осуществления изобретения матрикс не является гидрогелем (т.е. гелем, содержащим молекулы воды). Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не является сшитым полимером. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит сшитый полимер. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не является стентом. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит диоксида кремния или его производных. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит биокерамических соединений. Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не содержит металл. Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не является многослойным материалом. В одном варианте осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани не содержит фактора роста клеток.

Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один полимер, выбранный из биоразлагаемого и/или биосовместимого полимера. В одном варианте осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один полимер, который может подвергаться гидролитическому или ферментативному расщеплению; предпочтительно указанный полимер выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков; более предпочтительно, из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимеров. В одном варианте осуществления изобретения полимерный матрикс представлен хитозаном или смесью хитозана и алгината. В одном варианте осуществления изобретения полимерный материке представлен хитозаном или сополимером хитозана и альгината. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимерным матриксом является коммерческий полимерный матрикс, предпочтительно, коммерческая гемостатическая губка, более предпочтительно выбранная из губок Hemocollagene®, HemCom® и Gel Spon®. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один полимер, выбранный из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров, которые осаждаются в водном растворе при рН выше 6,5, предпочтительно выше 7. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один полимер, выбранный из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров, который осаждается в водном расторе, содержащем от 0,5 до 3% по массе кислоты, такой как уксусная кислота, при рН выше 6,5, предпочтительно выше 7.

Согласно одному варианту осуществления изобретения при имплантации материала по изобретению частицы кальция силиката, такого как C3S и/или C2S, гидратируются и матрикс по изобретению стабилизирует рН среды во время реакции гидратации.

В одном варианте осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один биополимер, т.е. полимер полученный из биомассы; предпочтительно, биополимер является полисахаридом; более предпочтительно полисахарид выбирают из фруктанов, таких как инулин, граминан, леван и нео-инулин; глюканов, таких как декстран, флоридный крахмал, гликоген, пуллулан, крахмал, целлюлоза, кризоламинарин, курдлан, ламинарии, лентинан, лихенин, бета-глюкан овса, плеуран и зимозан; галактанов, таких как агар и галактоолигосахариды; и хитина.

В одном варианте осуществления изобретения биополимером является гликозаминогликан, который предпочтительно выбирают из группы, включающей гепарин, гепарина сульфат, хондроитин, дерматана сульфат, кератана сульфат и гиалуроновую кислоту или сополимеры этих веществ.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимером является поливиниловый спирт (ПВС). В одном варианте осуществления изобретения полимер представляет собой гомополимер или сополимер с виниловым спиртом (ПВС).

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не является полимером на основе крахмала. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не является полимером на основе кукурузного крахмала. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не является смесью, содержащей полимер на основе крахмала. Согласно одному варианту осуществления изобретения не выбирают из смеси полимера на основе крахмала с этиленвиниловым спиртом, ацетатом целлюлозы и/или поликарболактоном. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не выбирают из смеси кукурузного крахмала с этиленвиниловым спиртом, ацетатом целлюлозы и/или поликарболактоном. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не является сополимером, таким как сополимер поли(молочной-гликолевой кислоты). Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не выбирают из полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, поликапролактона, сложных полигидроксиэфиров жирных кислот и их сополимеров.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер не выбирают из полимеров на основе крахмала, таких как полимер на основе кукурузного крахмала, сополимер поли(молочной-гликолевой кислоты), полимолочной кислоты, полигликолевой кислоты, поликапролактона, полигидроксиэфиров жирных кислот и их сополимеров, или любой смеси, содержащей полимеры на основе крахмала и этиленвиниловый спирт, ацетат целлюлозы и/или поликапролактон.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер имеет форму порошка или волокон. Согласно одному варианту осуществления изобретения волокна, предпочтительно полимерные волокна, более предпочтительно, альгинатные волокна, придают прочность матриксу. Согласно одному варианту осуществления изобретения количество волокон в матриксе позволяет модулировать механические свойства материала по изобретению.

Согласно одному варианту осуществления изобретения в качестве волокон используют арамидные волокна, предпочтительно, арамидные волокна Textil-Werke®.

Согласно одному варианту осуществления изобретения волокна представляют собой волокна поли(винилового спирта) (ПВС), предпочтительно ПВС-волокна Textil-Werke®.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер является гомополимером или сополимером. В одном варианте осуществления изобретения полимер выбирают из линейного, разветвленного или сшитого полимера; предпочтителен линейный полимер. В одном варианте осуществления изобретения полимер выбирают из сополимера с регулярной структурой, блок-сополимера, статистического сополимера или привитого сополимера. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер выбирают из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров, которые осаждаются в водном растворе при рН выше 6,5, предпочтительно выше 7. Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер выбирают из биоразлагаемых и/или биосовместимых полимеров, которые осаждаются в водных растворах, содержащих от 0,5 до 3% по массе кислоты, такой как уксусная кислота, при рН выше 6,5, предпочтительно выше 7.

Согласно одному варианту осуществления изобретения средневесовая молярная масса полимера составляет от 5000 до 1000000 г/моль; предпочтительно от 7000 до 800000 г/моль, предпочтительно от 10000 до 700000 г/моль, более предпочтительно от 20000 до 600000 г/моль, более предпочтительно от 30000 до 500000 г/моль, более предпочтительно от 100000 до 500, 000 г/моль, более предпочтительно от 150000 до 300000 г/моль.

Согласно одному варианту осуществления изобретения хитозан имеет степень деацетилирования от 50% до 100%; предпочтительно от 50% до 95%, предпочтительно от 60% до 90%, предпочтительно от 70% до 85%,. более предпочтительно от 75% до 85%. В одном варианте осуществления изобретения хитозан имеет степень деацетилирования выше 95%. В одном варианте осуществления изобретения хитозан имеет степень деацетилирования от 95% до 100%, предпочтительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.

Согласно одному варианту осуществления изобретения полимер является синтетическим, полусинтетическим или имеющим биологическое происхождение (биополимер) полимером; предпочтительно, имеющим биологическое происхождение. В одном варианте осуществления изобретения биополимер может иметь животное или растительное или животное происхождение. В одном варианте осуществления изобретения полимер является хитином, имеющим биологическое происхождение из грибов, из краба и/или креветки. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения биополимером является хитин, полученный из грибов.

Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс представляет собой ригидную структуру.

В одном варианте осуществления изобретения в матриксе имеются сообщающиеся поры; предпочтительно, сообщающиеся макропоры.

В одном варианте осуществления изобретения средний диаметр пор матрикса превышает 50 мкм; предпочтительно составляет от 75 мкм до 900 мкм; предпочтительно составляет от 75 мкм до 750 мкм; более предпочтительно - от 100 мкм до 400 мкм; более предпочтительно - от 100 мкм до 300 мкм; и частицы кальция силиката характеризуются распределением по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0.1 мкм до 50 мкм; предпочтительно, от 5 мкм до 40 мкм; предпочтительно, от 10 мкм до 25 мкм; более предпочтительно, приблизительно 10 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката характеризуются распределением по размеру, при котором d₅₀ составляет от 1 мкм до 30 мкм.

Согласно одному варианту осуществления изобретения поры матрикса имеют средний диаметр более 50 мкм; предпочтительно - от 75 мкм до 900 мкм; предпочтительно от 75 мкм до 750 мкм; более предпочтительно - от 100 мкм до 400 мкм; более предпочтительно - от 100 мкм до 300 мкм; и частицы кальция силиката характеризуются распределением по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,5 мкм до 25 мкм; предпочтительно - от 1 мкм до 10 мкм; более предпочтительно - от 1 мкм до 5.5 мкм; более предпочтительно - от 2 to 4 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката характеризуются распределением по размеру, при котором d₅₀ составляет от 3 мкм до 4 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката представляют собой микронизированные частицы.

Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс является высокоупорядоченным; предпочтительно матрикс структурирован и представлен слоями. В одном варианте осуществления изобретения матрикс представлен параллельными слоями. В одном варианте осуществления изобретения расстояние между слоями составляет от 10 to 300 мкм; предпочтительно от 50 до 150 мкм. В одном варианте осуществления изобретения толщина слоя составляет от более чем 0 до 300 мкм; предпочтительно от 0.1 мкм до 150 мкм, предпочтительно от 0.1 мкм до 50 мкм, предпочтительно от 0.1 мкм до 5 мкм; более предпочтительно, толщина составляет приблизительно 1 мкм. В одном варианте осуществления изобретения на расстояние между слоями влияет выбор полимера, образующего полимерный матрикс.

Согласно одному варианту осуществления изобретения модуль объемного сжатия матрикса и/или регенеративного материала по изобретению составляет от более чем 0 до 1000 кПа, предпочтительно от 0.1 кПа до 900 кПа, более предпочтительно - от 200 кПа до 700 кПа. Согласно одному варианту осуществления изобретения модуль объемного сжатия матрикса и/или регенеративного материала по изобретению составляет от 1 до 1000 кПа, предпочтительно от 100 до 1000 кПа, от 200 до 1000 кПа, от 300 до 1000 кПа, от 400 до 1000 кПа, от 500 до 1000 кПа, от 600 до 1000 кПа, от 700 до 1000 кПа, от 800 до 1000 кПа. В одном варианте осуществления изобретения модуль объемного сжатия составляет приблизительно 240 кПа, 410 кПа, 520 кПа или 600 кПа. Согласно одному варианту осуществления изобретения для испытания на сопротивление сжатию используют реометр Anton Paar MCR102 с мобилем С-РР25.

Согласно одному варианту осуществления изобретения прочность при сжатии матрикса и/или регенеративного материала по изобретению составляет от более 0 до 100 МПа, предпочтительно от 0.1 МПа до 50 МПа, более предпочтительно - от 0,5 до 5 МПа. Согласно одному варианту осуществления изобретения прочность при сжатии матрикса и/или регенеративного материала по изобретению составляет от 0,5 до 2 МПа; от 0.6 до 2 МПа, от 0.7 до 2 МПа; от 0.8 до 2 МПа; от 0.9 до 2 МПа; от 1.0 до 2 МПа; от 1.1 до 2 МПа; от 1.2 до 2 МПа; от 1.3 до 2 МПа; от 1.4 до 2 МПа; от 1.5 до 2 МПа; от 1.6 до 2 МПа; от 1.7 до 2 МПа; от 1.8 до 2 МПа. Согласно одному варианту осуществления изобретения прочность при сжатии до загрузки C3S составляет 0,5; 0,8 или 0,9 МПа. Согласно одному варианту осуществления изобретения прочность при сжатии после загрузки C3S составляет 1,3 или 1,5 МПа.

Согласно одному варианту осуществления изобретения негидратированные частицы кальция силиката выбирают из частиц дикальция силиката, частиц трикальция силиката (C3S) или любых смесей этих веществ; предпочтительно, частицы кальция силиката представляют собой трикальция силикат. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не содержат фосфат. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не содержат кальция фосфат. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не содержат биокерамических соединений. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не содержат металл. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не содержат гидроксиапатит. Согласно одному варианту осуществления изобретения негидратированные частицы кальция силиката не являются монокальция силикатом (CaSiO₃ или волластонитом).

Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит натрия силиката. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит кальция хлорида (CaCl₂). Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит лекарственных веществ и/или факторов роста. Согласно одному варианту осуществления изобретения матрикс не содержит изониазид, рифампицин, гентамицин, костный морфогенетический белок 1 (ВМР-1), костный морфогенетический белок 2 (ВМР-2), костный морфогенетический белок 7 (ВМР-7), костный морфогенетический белок 14 (BMP-14), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β).

В одном варианте осуществления изобретения порошкообразная смесь содержит негидратированные частицы кальция силиката по изобретению. Например, порошковая смесь представляет собой частицы Минерального триоксидного агрегата (МТА) или портлендский цемент, такой как материал для восстановления канала Pro Root МТА® (производитель компания Dentsply).

В одном варианте осуществления изобретения частицы МТА содержат трикальция силикат, дикальция силикат и необязательно висмута оксид. В одном варианте осуществления изобретения частицы МТА содержат приблизительно 22% висмута оксида по массе от общей массы частиц МТА.

Согласно одному варианту осуществления изобретения частицы кальция силиката не имеют структуры ядро-оболочка. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката не имеют пор.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани содержит от более чем 0% до менее 100%; предпочтительно от 1% до 99%, предпочтительно от 5% до 95%, предпочтительно от 5% до 90%, предпочтительно от 10% до 90%, предпочтительно от 20% до 80%, предпочтительно от 30% до 80%, предпочтительно от 40% до 80%, предпочтительно от 50% до 80%, более предпочтительно от 60% до 70% по массе частиц кальция силиката от общей массы указанного регенеративного материала соединительной ткани.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани содержит от более чем 0% до 300%, предпочтительно от 10% до 280%, более предпочтительно - от 20% до 250% по массе частиц кальция силиката от общей массы полимерного матрикса.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани по изобретению имеет структуру параллельных слоев, покрытых частицами кальция силиката. В одном варианте осуществления изобретения покрытие слоя матрикса частицами кальция силиката имеет равномерное распределение. В одном варианте осуществления изобретения покрытие частицами кальция силиката представляет собой монослой.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит по меньшей мере одну добавку; которую предпочтительно выбирают из рентгеноконтрастных веществ, минеральных добавок и пигментов; более предпочтительно - из рентгеноконтрастных веществ и пигментов.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит волокна.

В одном варианте осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит по меньшей мере одно рентгеноконтрастное вещество, которое предпочтительно выбирают из висмута оксида, стронция карбоната, стронция фосфата, бария сульфата, тантала оксида, церия оксида, олова оксида, циркония оксида; более предпочтительно, из циркония оксида в комбинации с иттрием и рентгеноконтрастными стеклами, содержащими тантал, барий и стронций и образованные ими смеси; предпочтительно рентгеноконтрастным веществом является производное висмута, такое как, например, висмута оксиды или висмута карбонаты или их смесь, или производное циркония, в особенности циркония оксид отдельно или в комбинации с иттрием; или смесь производных висмута и производных иттрия; предпочтительно рентгеноконтрастное вещество выбирают из циркония оксида и/или висмута оксида. Рентгеноконтрастные вещества повышают рентгеноконтрастность материала по изобретению, и таким образом, позволяют выполнить рентгенографическую проверку выполненного восстановления и/или регенерации спустя время.

В одном варианте осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит по меньшей мере один пигмент; предпочтительно оксид железа. В одном варианте осуществления изобретения указанный оксид железа выбирают из желтого, красного и коричневого оксида железа.

В одном варианте осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани дополнительно содержит по меньшей мере одну минеральную добавку.

Частицы кальция силиката внутри биополимерного матрикса усиливают механические свойства материала для реставрации и способствуют дифференцировки клеток в остеобласты (т.е. клетки, из которых образуется кость) без необходимости добавления каких-либо факторов роста клеток.

В частности, в настоящем изобретении необходимо, чтобы регенеративный материал соединительной ткани был безводным до использования.

В действительности, в процессе получения регенеративного материала с матриксом, представленным биоразлагаемым полимером, требуется солюбилизировать полимер в водном растворе при рН ниже 6,5, чтобы не допустить осаждения указанного полимера.

Однако трикальция силикат (C3S) взаимодействует с водой для получения кальция силиката гидрата (КСГ; CSH):

CSH - продукт с общей формулой mCaO.nSiO₂.pH₂O, отличающийся тем, что пит независимо равны от 1 до 3, и р равен от 3 до 6. В настоящем изобретении CSH - активное соединение, которое улучшает механические свойства регенеративного материала. В настоящем изобретении CSH и Са(ОН)₂ дополнительно обеспечивают свойства минерализации материала при помещении в биологическую среду.

Во время гидратации C3S рН среды все в большей степени смещается в основную область.

Вследствие этого необходимо обеспечить способ, позволяющий загружать частицы кальция силиката в хитозановый матрикс и при этом не допускающий его осаждения во время этого процесса.

Преимущества способа согласно изобретению компенсируют этот недостаток. Преимущество заключается в том, что при помещении в физическую среду гидратация регенеративного материала соединительной ткани по изобретению позволяет:

- модулировать кинетику резорбции материала;

- поддерживать его остеоиндуктивные свойства; и

- улучшать его механические свойства посредством придания твердости имплантированному материалу.

Преимущество способа согласно изобретению заключается в том, что он позволяет загружать частицы C3S в пористый полимерный матрикс, не закупоривая поры матрикса.

Способ получения регенеративного материала соединительной ткани

Изобретение относится также к способу получения описанного выше регенеративного материала соединительной ткани, включающего стадию приведения безводного пористого полимерного матрикса в контакт с суспензией негидратированных частиц кальция силиката в безводном полярном растворителе (называемую стадией (iv)).

Согласно одному варианту осуществления изобретения способ по изобретению включает лишь одну стадию для приведения безводного пористого полимерного матрикса в контакт с суспензией негидратированных частиц кальция силиката в безводном полярном растворителе.

Согласно одному варианту осуществления изобретения способ дополнительно включает предварительную стадию приготовления безводного пористого полимерного матрикса, которая включает:

(i) получение водного раствора, содержащего:

- по меньшей мере один полимер, предпочтительно биоразлагаемый и/или биосовместимый полимер; и

- необязательно кислоту;

(ii) заливку раствора в форму;

(iii) удаление воды из раствора в форме.

Согласно одному варианту осуществления изобретения способ согласно изобретению включает следующие стадии:

- получение водного раствора альгината (2%), хитозана (2%) и уксусной кислоты (1%);

- замораживание и лиофилизацию в форме раствора, полученного на предыдущей стадии, для получения безводного пористого полимерного матрикса; и

- приведение указанного безводного полимерного матрикса в контакт с суспензией негидратированных частиц кальция силиката, предпочтительно негидратированных частиц трикальция силиката, в безводном полярном растворителе таком как ацетонитрил.

Согласно одному варианту осуществления изобретения способ не включает использования соединений кремния. Согласно одному варианту осуществления изобретения способ не включает использования машины для трехмерной печати.

Стадия (i)

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (i) выполняют при температуре от 15°С до 50°С; предпочтительно, от 20°С до 35°С; более предпочтительно, стадию (i) выполняют при температуре приблизительно 20°С.

В одном варианте осуществления изобретения стадию (i) выполняют при атмосферном давлении. В одном варианте осуществления изобретения стадию (i) выполняют при давлении, равном приблизительно 1 бар.

В одном варианте осуществления изобретения стадию (i) выполняют при перемешивании на магнитной мешалке. В одном варианте осуществления изобретения перемешивание на магнитной мешалке во время стадии (i) осуществляется при скорости вращения от 100 об/мин до 500 об/мин, предпочтительно от 200 об/мин до 500 об/мин, предпочтительно от 300 об/мин до 500 об/мин, или предпочтительно от 400 об/мин до 500 об/мин. В одном варианте осуществления изобретения перемешивание на магнитной мешалке во время стадии (i) осуществляется при скорости вращения от 100 об/мин до 500 об/мин, предпочтительно от 300 об/мин до 400 об/мин, от 310 об/мин до 400 об/мин, от 320 об/мин до 400 об/мин, от 310 об/мин до 400 об/мин, от 320 об/мин до 400 об/мин, от 330 об/мин до 400 об/мин, от 340 об/мин до 400 об/мин, от 350 об/мин до 400 об/мин, от 360 об/мин до 400 об/мин, от 370 об/мин до 400 об/мин, от 380 об/мин до 400 об/мин, или от 390 об/мин до 400 об/мин. В одном варианте осуществления изобретения перемешивание на магнитной мешалке во время стадии (i) осуществляется при скорости вращения от 350 об/мин.

Согласно одному варианту осуществления изобретения водный раствор содержит по меньшей мере один полимер, выбранный из биоразлагаемого и/или биосовместимого полимера. В одном варианте осуществления изобретения матрикс содержит по меньшей мере один полимер, который может подвергаться гидролитическому или ферментативному расщеплению; предпочтительно указанный полимер выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков; более предпочтительно, из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимеров. В одном варианте осуществления изобретения полимерный матрикс представлен хитозаном или смесью хитозана и альгината. В настоящем изобретении полимер, в частности, пригоден для имплантации в тело человека или животного. Согласно одному варианту осуществления изобретения водный раствор не содержит галогенированных соединений. Согласно одному варианту осуществления изобретения водный раствор не содержит хлористый метилен.

В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит, по меньшей мере, один биополимер, полимер, полученный из биомассы; предпочтительно, биополимер является полисахаридом; более предпочтительно полисахарид выбирают из фруктанов, таких как инулин, граминан, леван и неоинулин; глюканов, таких как декстран, флоридный крахмал, гликоген, пуллулан, крахмал, целлюлоза, кризоламинарин, курдлан, ламинарии, лентинан, лихенин, бета-глюкан овса, плеуран и зимозан; галактанов, таких как агар и галактоолигосахариды; и хитина. В одном варианте осуществления изобретения выбор полимера влияет на размер пор в полимерном матриксе.

В одном варианте осуществления изобретения биополимером является гликозаминогликан, который предпочтительно выбирают из группы, включающей гепарин, гепарина сульфат, хондроитин, дерматана сульфат, кератана сульфат и гиалуроновую кислоту или сополимеры этих веществ.

В одном варианте осуществления изобретения полимер, описанный на стадии (i), является гомополимером или сополимером. В одном варианте осуществления изобретения полимер выбирают из линейного, разветвленного или сшитого полимера; предпочтителен линейный полимер. В одном варианте осуществления изобретения полимер выбирают из сополимера с регулярной структурой, блок-сополимера, статистического сополимера или привитого сополимера.

В одном варианте осуществления изобретения средневесовая молярная масса полимера, описанного на стадии (i), составляет от 5000 до 1000000 г/моль; предпочтительно от 7000 до 800000 г/моль, предпочтительно от 10000 до 700000 г/моль, более предпочтительно от 20000 до 600000 г/моль, более предпочтительно от 30000 до 500000 г/моль, более предпочтительно от 100000 до 500,000 г/моль, более предпочтительно от 150000 до 300000 г/моль.

В одном варианте осуществления изобретения полимер, описанный на стадии (i), является синтетическим, полусинтетическим или имеющим биологическое происхождение (биополимер) полимером; предпочтительно, имеющим биологическое происхождение. В одном варианте осуществления изобретения полимер, описанный на стадии (i), может иметь животное или растительное или животное происхождение. В одном варианте осуществления изобретения полимер, описанный на стадии (i), является хитином, имеющим биологическое происхождение из грибов, из краба и/или креветки.

В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит по меньшей мере один полимер в количестве от 0,5% до 6%; предпочтительно от 1% до 5%; более предпочтительно - от 2% до 4% по массе от общей массы водного раствора. В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит по меньшей мере один полимер в количестве от 0,5% до 10%, предпочтительно от 1% до 10%, от 2% до 10%, от 3% до 10%, от 4% до 10%, от 5% до 10%, от 6% до 10%, от 7% до 10%, от 8% до 10%, или от 9% до 10% по массе от общей массы водного раствора. В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит водный раствор содержит по меньшей мере один полимер в количестве 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% по массе от общей массы водного раствора.

В одном варианте осуществления изобретения водный раствор дополнительно содержит кислоту (минеральную или органическую кислоту); предпочтительно органическую кислоту; более предпочтительно - уксусную кислоту. В одном варианте осуществления изобретения органическая кислота содержит любую кислоту, несущую карбоксильную группу (-СООН) и/или сульфоновую группу (-SO₃H). В одном варианте осуществления изобретения минеральная кислота, содержит, например, соляную кислоту (HCl), азотную кислоту (HNO₃), фосфорную кислоту (Н₃РО₄), серную кислоту (HSO₄), борную кислоту (Н₃ВО₃), фтороводородную кислоту (HF), бромоводородную кислоту (HBr), перхлорную кислоту (HClO₄) и иодоводородную кислоту (HI). В одном варианте осуществления изобретения кислота не является аминокислотой.

В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит от 0,5 до 2% кислоты, предпочтительно, органической кислоты, по массе от общей массы указанного водного раствора. В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит от 0,5 до 3% кислоты, предпочтительно, органической кислоты, по массе от общей массы указанного водного раствора. В одном варианте осуществления изобретения водный раствор содержит от 0,5 до 3% кислоты, предпочтительно от 0.6 до 3%, от 0.7 до 3% кислоты, от 0.8 до 3%, от 0.9 до 3% кислоты, от 1 до 3% кислоты, от 1.1 до 3% кислоты, от 1.2 до 3%, от 1.3 до 3%, от 1.4 до 3%, от 1.5 до 3%, от 1.6 до 3%, от 1.7 до 3%, от 1.8 до 3%, от 1.9 до 3%, от 2 до 3%, от 2.1 до 3%, от 2.2 до 3%, от 2.3 до 3%, от 2.4 до 3%, от 2.5 до 3%, от 2.6 до 3%, от 2.7 до 3%, от 2.8 до 3%, или от 2.9 до 3% по массе от общей массы указанного водного раствора.

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадия (i) дополнительно включает внесение добавок в определенный выше водный раствор. В одном варианте осуществления изобретения добавку выбирают из рентгеноконтрастных веществ и пигментов.

В одном варианте осуществления изобретения ренгеноконтрастное вещество выбирают из висмута оксида, стронция карбоната, стронция фосфата, бария сульфата, тантала оксида, церия оксида, олова оксида, циркония оксида; более предпочтительно, из циркония оксида в комбинации с иттрием и рентгеноконтрастными стеклами, содержащими тантал, барий и стронций и образованные ими смеси; предпочтительно рентгеноконтрастным веществом является производное висмута, такое как, например, висмута оксиды или висмута карбонаты или их смесь, или производное циркония, в особенности циркония оксид отдельно или в комбинации с иттрием; или смесь производных висмута и производных иттрия; предпочтительно рентгеноконтрастное вещество выбирают из циркония оксида и/или висмута оксида. Рентгеноконтрастные вещества повышают рентгеноконтрастность материала по изобретению, и таким образом, позволяют выполнить рентгенографическую проверку выполненного восстановления и/или регенерации спустя время.

В одном варианте осуществления изобретения добавкой является пигмент; предпочтительно оксид железа. В одном варианте осуществления изобретения указанный оксид железа выбирают из желтого, красного и коричневого оксида железа.

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадия (i) включает:

(i-1) смешивание кислоты, такой как уксусная кислота, с водным раствором;

(i-2) добавление полимера к раствору, полученному на стадии (i-1);

(i-3) необязательное перемешивание смеси, полученной на стадии (i-2).

Стадия (ii)

Согласно одному варианту осуществления изобретения форма представляет собой блистерную упаковку, предпочтительно, блистерную упаковку, содержащую, по меньшей мере, одну лунку, более предпочтительна блистерная упаковка, содержащая, по меньшей мере, одну лунки(?). Согласно одному варианту осуществления изобретения объем лунки в форме составляет от 1 мл до 10 мл, предпочтительно от 2 мл до 5 мл, более предпочтительно - 3 мл.

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадия (ii) дополнительно включает стадию дегезации раствора, полученного на стадии (i).

Стадия (iii)

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (iii) выполняют однократно.

Согласно одному варианту осуществления изобретения приспособления для удаления воды выбирают из лиофилизатора, термоиспарителя и вакуум-испарителя.

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (iii) выполняют посредством замораживания и лиофилизации раствора в форме, полученной на стадии (ii).

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (iii) выполняют посредством испарения раствора при нагревании или под вакуумом в форме, полученной на стадии (ii).

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (iii) выполняют при температуре от -80°С до 5°С; предпочтительно, от -50 до 1°С; предпочтительно от -45°С до -10°С; более предпочтительно, стадию (iii) выполняют при температуре приблизительно -40°С или приблизительно -24°С. В одном варианте осуществления изобретения раствор, полученный на стадии (i), и/или на стадии (ii) замораживают при температуре приблизительно -24°С. В одном варианте осуществления изобретения лиофилизацию выполняют при температуре приблизительно -40°С. В одном варианте осуществления изобретения лиофилизацию выполняют при температуре приблизительно -54°С.

В одном варианте осуществления изобретения стадию (iii) выполняют при давлении от 5 мкбар до 500 мкбар.

В одном варианте осуществления изобретения способ согласно изобретению включает лишь одну стадию замораживания и одну стадию лиофилизации.

В одном варианте осуществления изобретения форма может иметь любую геометрическую форму; предпочтительно, прямоугольную, кубическую, сферическую или цилиндрическую. Стадия (iv)

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадию (iv) выполняют при температуре от 10°С до 50°С; предпочтительно, от 15°С до 35°С; более предпочтительно, стадию (iv) выполняют при температуре приблизительно 20°С.

В одном варианте осуществления изобретения стадию (iv) выполняют при атмосферном давлении. В одном варианте осуществления изобретения стадию (iv) выполняют при давлении приблизительно 1 бар.

В одном варианте осуществления изобретения суспензия содержит частицы кальция силиката в количестве от более чем 0% до 300%, предпочтительно от 5% до 200%, предпочтительно от 10% до 150%, предпочтительно от 20% до 140%, предпочтительно от 30% до 130%, предпочтительно от 40% до 120%, более предпочтительно от 50 до 100% по массе от общей массы указанной супензии.

В одном варианте осуществления изобретения негидратированные частицы кальция силиката выбирают из частиц дикальция силиката, частиц трикальция силиката или смеси этих частиц в любом соотношении; предпочтительно, частицы кальция силиката представляют собой трикальция силикат.

В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0.1 мкм до 50 мкм; предпочтительно, от 5 мкм до 25 мкм; предпочтительно, от 10 мкм до 40 мкм; более предпочтительно, приблизительно 10 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,5 мкм до 25 мкм; предпочтительно, от 1 мкм до 10 мкм; более предпочтительно - от 1 мкм до 5.5 мкм; более предпочтительно - от 2 to 4 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 3 мкм до 4 мкм. В одном варианте осуществления изобретения частицы кальция силиката являются микронизованными частицами. В одном варианте осуществления изобретения значение d₅₀ составляет приблизительно 10 мкм.

В одном варианте осуществления изобретения суспензия содержит безводный полярный растворитель; предпочтительно выбранный из ацетонитрила, дихлорметана, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетона, метанола, смеси этанола, изопропилового спирта и уксусной кислоты. В одном варианте осуществления изобретения растворителем в составе суспензии является ацетонитрил. Согласно одному варианту осуществления изобретения суспенизия не содержит галогенированных соединений. Согласно одному варианту осуществления изобретения суспензия не содержит хлористый метилен.

Согласно одному варианту осуществления изобретения стадия (iv) дополнительно включает операцию лиофилизации.

Материал, полученный при использовании способа

Изобретение относится также к регенеративному материалу соединительной ткани, который может быть получен способом согласно изобретению, как описано выше.

Имплантат

Изобретение относится также к имплантату, содержащему описанный выше регенеративный материал соединительной ткани.

Согласно одному варианту осуществления изобретения регенеративный материал соединительной ткани может непосредственно применяться в качестве имплантата.

Применение

Изобретение относится также к применению регенеративного материала соединительной ткани для лечения при утрате соединительной ткани у нуждающихся в таком лечении пациентов, предпочтительно, для лечения при утрате ротолицевой соединительной ткани.

Согласно одному варианту осуществления изобретения ротолицевые ткани включают соединительные ткани, такие как кость и/или пульпа и/или околозубная ткань, предпочтительно дентин, кость, натуральный цемент и эмаль.

Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению стимулирует экспрессию генов для остеобластной дифференцировки. Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению стимулирует экспрессию генов для остеобластной дифференцировки в ранние сроки и/или сохраняется в течение более длительного времени. Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению стимулирует экспрессию мРНК генов RunX2, Dlx5, Coll1, ЩФ, костного сиалопротеина (КСП; BSP) и/или остеопонтина (SPP1).

Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению стимулирует экспрессию генов для остеобластной дифференцировки после по меньшей мере одного дня, предпочтительно после по меньшей мере 7 дней и более предпочтительно - после 21 дня. Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению стимулирует экспрессию генов для остеобластной дифференцировки после 7 дней, 14 дней или 21 дня.

Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению не является цитотоксичным для остеобластов человека.

Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению повышает активность ЩФ в клетках человека, предпочтительно клетках MSC.

Согласно одному варианту осуществления изобретения цыетные испытания позволяют засвидетельствовать остеодифференцировку клеток при контакте с материалом по изобретению. Цветные реакции хорошо известны специалистам в данной области, и примерами таких реакций является окрашивание ализариновым красителем, цветная реакция определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ), окрашивание по Von Kossa.

Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению со временем разлагается. Согласно одному варианту осуществления изобретения материал по изобретению разлагается после по меньшей мере одной недели, предпочтительно после по меньшей мере двух недель, более предпочтительно - после 12 недель. Согласно одному варианту осуществления изобретения при имплантации in situ потеря массы материала по изобретению составляет от 1% до 100%, предпочтительно от 10% to 50% по массе, более предпочтительно - от 20% до 33% по массе Согласно одному варианту осуществления изобретения при имплантации in situ потеря массы материала по изобретению более благоприятна, когда полимерный матрикс содержит и альгинат и хитозан.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 является фотографией, на которой показан пористый хитозановый биополимерный матрикс.

Фиг. 2 является фотографией, полученной методом СЭМ, на которой показан пористый хитозановый биополимерный матрикс при 100-кратном (Фиг. 2А) или 500-кратном (Фиг. 2В) увеличении.

Фиг. 3 является фотографией, полученной методом СЭМ, на которой показан пористый регенеративный материал, полученный способом согласно изобретению, при 500-кратном (Фиг. 3А) или 1500-кратном (Фиг. 3В) увеличении.

Фиг. 4 представляет собой серию гистограмм, показывающую выраженное в процентах увеличение массы матрикса после загрузки кальция силиката в хитозан-альгинаный матрикс, при использовании для такой загрузки суспензии 0,5 г, 1 г или 2 г частиц C3S в 3 мл ацетонитрила.

Фиг. 5 представляет собой серию гистограмм, показывающую результаты MTS-теста остеобластов, выращенных при использовании материала по изобретению [рецептура 15/C3S] в концентрации 1 или 2 мг/мл; и частицы C3S в концентрации 1 или 2 мг/мл через 24 ч, 48 ч или 72 ч. Данные выражены в процентах от контроля. Статистический анализ проведен с использованием критерия Манна-Уитни *непараметрического); нз (ns): не значимое различие; *р<0,05; **р<0,01; ***р<0,005.

Фиг. 6 - полученные при использовании светлопольного микроскопа фотографии остеобластов отдельно (Фиг. 6А), или выращенных в присутствии материала по изобретению [рецептура 15/C3S] при концентрации частиц C3S 2 мг/мл (Фиг. 6С) или 1 мг/мл (Фиг. 6В) после выращивания в течение 14 дней.

Фиг. 7 представляет собой серию гистограмм, показывающую размер пор в трех полимерных матриксах, полученных при использовании рецептуры 2 (2% хитозан), рецептуры 15 (2% хитозан/2% альгинат) и рецептуры 19 (4% хитозан).

Фиг. 8 представляет собой серию гистограмм, показывающую разложение трех полимерных матриксов в течение 12 недель трех полимерных матриксов, полученных при использовании рецептуры 2 (2% хитозан), рецептуры 15 (2% хитозан/2% альгинат) и рецептуры 19 (4% хитозан).

Фиг. 9 - полученные при использовании светлопольного микроскопа фотографии окрашивания ЩФ остеобластов отдельно (Фиг. 9А), или выращенных в присутствии материала по изобретению [рецептура 15/C3S] при концентрации частиц C3S 2 мг/мл (Фиг. 9В) или 1 мг/мл (Фиг. 9С) после выращивания в течение 7, 14 или 21 дней.

Фиг. 10 - полученные при использовании светлопольного микроскопа фотографии окрашивания по Von Kossa остеобластов отдельно (Фиг. 10А), или выращенных в присутствии материала по изобретению [рецептура 15/C3S] при концентрации частиц C3S 2 мг/мл (Фиг. 10 В) или 1 мг/мл (Фиг. 10С) после выращивания в течение 7, 14 или 21 дней.

Фиг. 11 - полученные при использовании светлопольного микроскопа фотографии окрашенных ализариновым красителем остеобластов отдельно (Фиг. ПА), или выращенных в присутствии материала по изобретению [рецептура 15/C3S] при концентрации частиц C3S 2 мг/мл (Фиг. 11В) или 1 мг/мл (Фиг. 11С) после выращивания в течение 7, 14 или 21 дней.

Фиг. 12 представляет собой серию гистограмм, показывающую уровень мРНК RunX2, Dlx5, Coll1 и ЩФ через 21 день для (а) клеток MSC, находящихся в среде, (b) клеток MSC в присутствии материала по изобретению, находящихся в среде, и (с) среды, содержащей только частицы C3S; материал по изобретению получен при использовании полимерного матрикса по рецептуре 15 с загруженными частицами C3S.

Фиг. 13 представляет собой серию гистограмм, показывающую уровень мРНК BSP и SPP1 через 7, 14 и 21 день для (а) клеток MSC, находящихся в среде,

(b) клеток MSC в присутствии материала по изобретению, находящихся в среде, и

(c) среды, содержащей только частицы C3S; материал по изобретению получен при использовании полимерного матрикса по рецептуре 15 с загруженными частицами C3S.

Примеры

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.

Сокращения

C3S: трикальция силикат;

г: грамм(ы);

ч: час(ы);

мл: миллилитр;

об/мин: оборотов в минуту;

сек: секунда(ы);

СЭМ: сканирующая электронная микроскопия; Е:

единицы активности;

%: процент.

В Примерах обозначение «[рецептура X]» относится к рецептуре, используемой для обеспечения пористого матрикса по изобретению; и обозначение «[рецептура X/Y]» относится к пористому регенеративному материалу по изобретению, который содержит пористый матрикс, полученный из рецептуры X; где в указанный матрикс загружены частицы кальция силиката, обозначенные Y.

Например, обозначение «[рецептура 15]» относится к рецептуре для обеспечения пористого матрикса. В следующем эксперименте «[рецептура 15]» - это рецептура, содержащая 2% хитозана, 2% альгината и 1% уксусной кислоты.

Обозначение регенеративный материал по «"[рецептуре 15/C3S]" относится к пористому матриксу, полученному по рецептуре 15, в который затем загружены частицы C3S.

Материалы и методы

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Образцы предварительно нарезаны на блоки размером 5 мм × 3 мм. Затем блоки подвергают металлизации в камере с рассеиваемой плазмой платины. Использовали аппарат SC7640 Sputter coater; Quorum Technologies, Гвелф, Онтарио, Канада.

Образцы изучали с помощью сканирующего электронного микроскопа (Zeiss SUPRA 40) с эффектом электронной пушки, который ограничивает воздействие зарядов на поверхность образцов.

Спектрофотометрия

Для анализа образцов использовали аппарат TriStar LB941 (Berthold Technologie). Измерения поглощения выполняли при длине волны 490 нм.

Светлопольная микроскопия

Клеточные культуры наблюдали при использовании аппарата для визуализации клеток EVOS® FL Cell Imaging System.

Часть 1: Примеры из области химии

Пример 1: Пористый биополимерный матрикс Для получения пористых матриксов использовали несколько рецептур (см. Таблицу 1). Ниже описан общий протокол.

Общий протокол

Полимерный раствор получают смешиванием порошка полимера (такого как порошка хитозана или хитозана/альгината) в количестве от 1 до 10% по массе с очищенной водой, которая может необязательно содержать от 0,5 до 3% по массе уксусной кислоты. Раствор полимера разливали в блистерные контейнеры вместимостью приблизительно 3 мл и затем замораживали при температуре приблизительно -24°С или -40°С в течение, по меньшей мере, 24 ч. На последнем этапе образцы лиофилизировали в течение 24 ч при давлении 0,05 мбар и температуре приблизительно -54°С.

Пример пористого биополимерного матрикса, полученного способом согласно изобретению, показан на Фиг. 1.

Определение характеристик

Для определения характеристик пористых материалов используют СЭМ. Результаты определения характеристик хитозаного пористого биополимерного матрикса (Фиг. 2А и 2В) показали, что:

матрикс структурирован и представлен параллельными слоями, толщина каждого из которых составляет 1 мкм;

расстояние между слоями является однородным; поры сообщаются между собой, и диаметр каждой поры составляет от 100 до 300 мкм, т.е. превышает диаметр клетки;

пористость составляет приблизительно 90%. В заключение, эти результаты свидетельствуют о том, что пористый матрикс по изобретению представляет собой хорошо организованную пористую структуру. Более того, размер пор указанного матрикса может позволить разместить в нем рекрутированные клетки при имплантации в тело.

Пример 2: Синтез регенеративного материала по изобретению

Общий протокол

Пористый биополимерный матрикс, полученный в соответствии с описанием в Примере 1, погружали на 30 сек в раствор, содержащий частицы кальция силиката, суспендированные в полярном растворителе.

Частицы кальция силиката могут представлять собой негидратированный частицы трикальция силиката (C3S), порошкообразный Биодентин™ порошок Минерального триоксидного агрегата (МТА). В приведенных примерах частицами МТА являлся материал для восстановления каналов Pro Root МТА® (производитель компания Dentsply) с размером частиц от 1 мкм до приблизительно 30 мкм. Частицы МТА содержат трикальция силикат, дикальция силикат и необязательно висмута оксид (приблиительно 22%). В качестве растворителя может применятсья ацетонитрил, этанол или ацетон.

Загруженные образцы затем сушат под вакуумом в течение, по меньшей мере, 1 ч.

Определение характеристик

Для определения характерисик готовых материалов использовали СЭМ. На Фиг. 3А и 3В показаны материалы пористого хитозана, содержащие наночастицы C3S.

Результаты показывают, что:

- стадия импрегнирования не изменяет структуру матрикса. Каждый слой имеет толщину около 2 мкм, и расстояние между слоями составляет от 50 до 150 мкм;

- частицы C3S покрывают слои, обеспечивая тонкий однородный слой на наружной и внутренней поверхности пористого матрикаса; и

- в материале по-прежнему присутствуют поры.

Таким образом, эти эксперименты свидетельствуют о том, что способ согласно изобретению обеспечивает получение пористого материала, равномерно загруженного частицами кальция силиката.

Пример 3: Загрузка пористого матрикса частицами C3S

3.1. Из полимерного матрикса, синтезированного Заявителем

Цель этого эксперимента заключалась в том, чтобы показать, что загрузка наночастиц кальция силиката в пористый полимерный матрикс может быть модулированной.

С этой целью в пористый матрикс (рецептура 15 в Таблице 1: 2% хитозана/2% альгината 2% и 1% уксусной кислоты) загружали раствор, содержащий частицы C3S в количестве 0,5 г, 1 г или 2 г. Протокол описан в Примере 2. В этом протоколе растворителем являлся ацетонитрил.

Результаты (Фиг. 4) показывают, что пористый матрикс по изобретению позволяет загружать частицы C3S независимо от концентрации частиц C3S в загружающем растворе. Результаты также подчеркивают, что загрузка частиц C3S может быть модулирована в зависимости от концентрации загружающего раствора, содержащего C3S.

3.2. Из коммерческих гемостатических губок

Испытания загрузки проводились посредством приведения в контакт раствора C3S (1 мг/мл) с тремя коммерческими гемостатическими губками: Hemocollagene®, HemCom® и GelSpon®. Протокол описан в Примере 2.

Результаты показывают, что при использовании каждой гемостатической губки достигается эффективная загрузка частицами C3S.

Часть 2: Физико-химические испытания

Пример 4: Испытание на сопротивление сжатию

4.1. Из материалов, полученных при использовании рецептуры 15 (смеси хитозана и альгината)

Цель данного эксперимента заключается в том, чтобы показать, что пористые материалы по изобретению обладают подходящими механическими свойствами для использования в качестве импланата.

Выполнено сравнение незагруженного пористого матрикса и пористого матрикса, загруженного силикатом кальция, полученным при использовании рецептуры 15 (2% хитозана/2% альгината 2% и 1% уксусной кислоты):

Испытание на сопротивление сжатию проводилось с использованием реометра Anton Paar MCR102 и мобиля С-РР25. Были использованы следующие параметры:

- скорость снижения мобиля была равной приблизительно 250 мкм/сек;

- расстояние от начала измерения (зазор) был равным приблизительно 16 мм;

- мобиль во время снижения продавливает губку, и аппарат измеряет вертикально направленную силу (Fn), с которой губка воздействует на мобиль (предел безопасности для вертикально направленной силы составляет 45Н).

Результаты показаны в Таблице 3.

Результаты свидетельствуют о том, что добавление соединений кальция силиката, в особенности, содержащих частицы трикальция силиката, в пористый матрикс позволяет значимо улучшить модуль сжатия, т.е. механические свойства материалов. Модуль сжатия можно модулировать, в зависимости от выбора соединения кальция силиката.

4.2. Сравнительные испытания

Изучено сопротивление сжатию материалов, полученных при использовании рецептур 2 и 19 до и после загрузки частицами C3S. Проведено сравнение материалов, полученных при использовании рецептуры 15.

Результаты показаны в Таблице 4.

Результаты показывают, что какая бы рецептура полимерного матрикса не использовалась, загрузка частиц C3S улучшает механические свойства конечных материалов. Испытания на сопротивление сжатию показывают также, что при использовании рецептуры 15, т.е. рецептуры, содержащей смесь хитозана и альгината, достигаются лучшие результаты.

Пример 5: Размер пор полимерного матрикса

Цель этого эксперимента заключалась в том, чтобы изучить размер пор трех полимерных матриксов, полученных при использовании:

- Рецептуры 2: 2% хитозана и 1% уксусной кислоты;

- Рецептуры 15: 2% хитозана/2% альгината 2% и 1% уксусной кислоты; или

- Рецептуры 19: 4% хитозана и 1% уксусной кислоты.

Для достижения этой цели были сделаны микрофотографии каждого матрикса методом СЭМ.

Результаты (Фиг. 7) показывают, что:

- повышение концентрации полимера в способе согласно изобретению приводит к увеличению размера пор в готовом полимерном матриксе;

- когда концентрация полимера составляет 4%, размер пор при использовании смеси 2% хитозана и 2% альгината больше, чем при использовании рецепторы, содержащей 4% хитозана.

В заключение, этот эксперимент показывает, что повышение концентрации полимера в водном растворе способствует увеличению размера пор.

Часть 3: Биологические испытания Пример 6:

Испытание цитосовместимости (MTS)

Цель испытания заключалась в том, чтобы оценить цитосовместимость, достигнутую после приведение клеток-предшественников остеобластов (мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека (MCK; SC) в контакт с:

суспензией частиц C3S в концентрации 1 или 2 мг/мл;

или с регенеративным материалом [рецептура 15/C3S], определенным в предыдущих примерах.

С этой целью были проведены следующие испытания:

- клетки выращивали в среде без добавления материалов (отрицательный контроль);

- клетки выращивали в среде, обогащенной материалом по изобретению [Рецептура 15/C3S] (в концентрации, приблизительно равной 1 или 2 мг/мл); и

- клетки выращивали в среде, обогащенной частицами C3S (в концентрации, приблизительно равной 1 или 2 мг/мл).

Протокол

Испытание проводилось в трех фазах:

(1) После посева клетки выращивали в течение 24 ч;

(2) В пролиферативную среду (DMEM, содержащую 10% фетальной бычьей сыворотки и антибиотики в количестве 50 МЕ/мл) добавляли материал по изобретению [Рецептура 15/C3S] или частицы C3S.

Оценка цитосовместимости проводилась в отношении времени выращивания клеток на обогащенной среде:

- кратковременный контакт (24 ч) для выявления предполагаемого немедленного токсического эффекта;

- контакт промежуточной продолжительности (48 ч);

- более длительный контакт (72 ч) для демонстрации предполагаемого воздействия (подавления или активации) материала на пролиферацию.

(3) Для измерения жизнеспособности клеток через 24 ч, 48 ч или 72 ч использовали спектрофотометр при длине волны 490 нм.

Результаты

Результаты (Фиг. 5) показывают, регенеративный материал по изобретению не явялется цитотоксичным для остеобластов человека.

Следует отметить, что наилучшие результаты были получены с материалом по изобретению, полученным при использовании рецептуры 15 и нагруженным частицами C3S в концентрации приблизительно 2 мг/мл.

При использовании частиц C3S наблюдалось небольшое снижение жизнеспособности клеток. Это феномен может быть обусловлен повышением основности среды вследстие образования гидроксида кальция во время реакции гидратации частиц C3S в биологической среде.

Оказалось неожиданным, что при загрузке частиц C3S в матрикс по изобретению повышается жизнеспособность клеток, из чего следует, что матрикс по изобретению может стабилизировать рН среды во время гидратации частиц C3S.

Пример 7: Остеобластная дифференцировка и минерализация в присутствии материалов по изобретению

7.1. Предварительное испытание

Цель заключалась в том, чтобы оценить способность материала по изобретению [рецептуры 15/C3S] или частиц C3S (1 мг/мл) стимулировать остеобластную дифференцировку.

Этот эксперимент проводился на мезенхимальных стволовых клетках (МСК; MSC) костного мозга человека, которые выращивали на обогащенной минерализирующей среде.

Микрофотографии методом светлопольной микроскопии получали в День 14.

Результаты показали, что клетки, выраженные в прямом контакте с регенеративными материалами по изобретению (Фиг. 6С) или частицами C3S particles (Фиг. 6В) были сопоставимыми с клетками, выращенными в отсутствии этих добавок (Фиг. 6А). В скоплениях клеток наблюдались костеподобные минерализованные узелки, указывая на способность материалов по изобретению эффективно стимулировать остеодифференцировку МСК человека.

7.2. Испытания с окрашиванием

Способность к дифференцировке клеток МСК в остеобласты была изучена в присутствии материалов по изобретению (Рецептура 15). В качестве положительного контроля используют клетки отдельно (без материалов по изобретению). Окрашивание клеточных культур проводилось после выращивания в течение 7 дней, 14 дней и 21 дня. Микрофотографии методом светлопольной микроскопии получали через 7 дней, 14 дней и 21 день.

7.2.1. Окрашивание на ЩФ

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) является одним из маркеров клеточной дифференцировки стволовых клеток.

Для обнаружения активности щелочной фосфатазы проводилось окрашивание на ЩФ. Результаты показаны на Фиг. 9.

Результаты показывают, что при приведении клеток в контакт с материалами по изобретению активность ЩФ повышается.

7.2.2. Окрашивание по Von Kossa

Окрашивание in situ по Von Kossa позволяет обнаружить образование минерализованных узелков, особенно, кристаллов кальция. Результаты показаны на Фиг. 10.

Эти результаты подтверждают результаты, полученные при окрашивании на ЩФ.

7.2.3. Окрашивание ализариновым красителем

Окрашивание ализариновым красителем позволяет обнаружить образование минерализованных узелков. Результаты показаны на Фиг. 11.

При анализе фотографий, полученных методом светлопольной микроскопии, спектроскопия окрашивания в красный цвет (420 нм) позволяет выполнить количественное определение минерализованных продуктов, содержащихся в образцах.

Результаты подтверждают, что дифференцировка клеток МСК происходит быстрее в присутствии материалов по изобретению.

7.3. Общий вывод

Испытания с окрашиванием демонстрируют нетоксичность полимерного матрикса по рецептуре 15, загруженного частицами C3S (в концентрации 1 мг/мл). Ухудшения состояния клеток с течением времени не наблюдалось, и клетки в присутствии материала по изобретению способны самоорганизовываться с формированием трехмерной структуры и синтезировать внеклеточный матрикс. Более того, активность ЩФ и видимые костные минерализованные узелки показывают, что материал по изобретению не нарушает остеобластную дифференцировку клеток.

Пример 8: Испытание разложения (деградации)

Испытания разложения проводились, чтобы оценить резорбционную способность материалов по изобретению.

Данное исследование проводилось в течение 12 недель с использованием материалов, имеющих полимерный матрикс, полученный с использованием рецептур 2, 15 и 19, как описано выше.

Перед загрузкой C3S все материалы подвергали 100% разложению структуры посредством солюбилизации в течение нескольких минут.

Эволюция разложения после загрузки C3S показана на Фиг. 8.

Результаты показывают, что с течением времени все материалы по изобретению подвергаются разложения: через 12 недель материалы утрачивают от 20% до 33% массы. Серия гистограмм демонстрирует, что при содержании и альгината, и хитозана в полимерном матриксе, достигается более эффективное разложение.

Эти результаты демонстрируют, что материалы по изобретению совместимы с кинетикой регенерации клеток. Пример 9: Экспрессия генов

Для того чтобы подтвердить результаты испытаний с окрашиванием был выполнен анализ уровня экспрессии некоторых маркеров остеобластов (факторов транскрипции остеобластов и маркеров костных белков) методом ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) на 7-й, 14-й и/или 21-й день после приведения клеток МСК в контакт с материалом по изобретению, полученным при использовании рецептуры 15 и загруженным C3S. Выполнено сравнение (а) клеток МСК, находящихся в среде, (b) клеток МСК, находящихся в среде, в присутствии материал по изобретению, и (с) среды, содержащей только частицы C3S.

9.1. Ранние факторы дифференцировки

Через 21 день было выполнено количественное определение мРНК следующих факторов дифференцировки:

RunX2: фактора транскрипции, связанного с карликовостью 2;

Dlx5: гомеобокса гена distal-less 5;

Coll1: коллагена 1;

И ЩФ: щелочной фосфатазы.

Результаты были нормализованы по уровню экспрессии генов RS15 (рибосомального белка S15 субчастицы 40 S) и ТВР (связывающего белка ТАТА-бокса).

Результаты (Фиг. 12) показывают достигавшееся через 21 день значимое различие между клетками МСК (а) находившимися в среде без добавок и (b) клетками, находившимися в присутствии материала по изобретению.

9.2. Поздние факторы дифференцировки

На 7-й, 14-й и/или 21-й день проводилось количественное определение мРНК следующих факторов дифференцировки: BSP (КСП): костного сиалопротеина; SPP1: остеопонтина.

Результаты были нормализованы по уровню экспрессии генов RS15 (рибосомального белка S15 субчастицы 40 S) и ТВР (связывающего белка ТАТА-бокса).

Результаты (Фиг. 13) показывают значимое различие между клетками МСК (а) находившимися в среде без добавок и (b) клетками, находившимися в присутствии материала по изобретению, достигавшемуся через 21 день.

Результаты (Фиг. 13) показывают, что различие между клетками МСК (а) находившимися в среде без добавок и (b) находившимися в присутствии материала по изобретению, достигалось уже на 7-й день. Особенно заметное различие наблюдалось через 14 и 21 дней для SPP1, и после 21 дня для КСП. 9.3.

Общий вывод

Анализ экспрессии генов показывает, что материал по изобретению стимулирует экспрессию генов, необходимую для остеобластной дифференцировки. Результаты также свидетельствуют о том, что такая стимуляция осуществляется на ранних стадиях и сохраняется в течение более длительного времени.

Изобретение относится к безводному регенеративному материалу соединительных тканей, предпочтительно регенеративному материалу кости, дентина или пульпы. Регенеративный материал соединительной ткани, содержит пористый полимерный матрикс с сообщающимися порами и частицы кальция силиката, причем полимерный матрикс является безводным и содержит, по крайней мере, один полимер, выбранный из биодеградируемого или биосовместимого полимера, указанные частицы кальция силиката являются негидратированными и характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикс. При этом негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренней поверхности матрикса, образованной порами. Также изобретение относится к способу получения, применению регенеративного материала соединительной ткани для лечения утраты соединительной ткани у пациента и имплантату, содержащему регенеративный материал соединительной ткани. Технический результат заключается в получении регенеративного материала с улучшенными биомеханическими и остеоиндуктивными свойствами, обеспечивающего хорошую миграцию, адгезию и пролиферацию клеток, с усиленными механическими свойствами, оптимальной и контролируемой биоразлагаемостью. 4 н. и 20 з.п. ф-лы, 15 ил., 4 табл., 9 пр.

1. Регенеративный материал соединительной ткани, содержащий:

- пористый полимерный матрикс с сообщающимися порами; и

- частицы кальция силиката; причем:

указанный полимерный матрикс безводный и содержит, по крайней мере, один полимер, выбранный из биодеградируемого или биосовместимого полимера;

указанные частицы кальция силиката негидратированные;

указанные негидратированные частицы кальция силиката характеризуются распределением частиц по размеру, при котором d₅₀ составляет от 0,05 мкм до менее среднего диаметра пор матрикса; и

указанные негидратированные частицы кальция силиката образуют покрытие на внутренней поверхности матрикса, образованной порами.

2. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 1, отличающийся тем, что указанный полимер выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков.

3. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 1, где указанный полимер выбирают из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимеров.

4. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 3, где полимером является хитозан или смесь хитозана и альгината.

5. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-4, дополнительно содержащий, по меньшей мере, одну добавку.

6. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 5, где добавку выбирают из волокон, рентгеноконтрастных веществ и пигментов.

7. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 6, где волокна являются альгинатными волокнами.

8. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 6, где рентгеноконтрастные вещества выбирают из висмута оксида, стронция карбоната, бария сульфата, тантала оксида, церия оксида, олова оксида, циркония оксида.

9. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 6, где пигмент выбирают из желтого, красного и коричневого оксида железа.

10. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что матрикс структурирован и представлен слоями.

11. Регенеративный материал соединительной ткани по п. 10, отличающийся тем, что расстояние между слоями составляет от 50 до 150 мкм.

12. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что частицы кальция силиката выбраны из частиц дикальция силиката, трикальция силиката или любых смесей этих веществ.

13. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что средний диаметр пор превышает 50 мкм.

14. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-13, где регенеративный материал выбирают из материала кости, дентина или пульпы.

15. Регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-14, где указанные негидратированные частицы кальция силиката имеют гранулометрический d₅₀ от 0,05 мкм до 50 мкм.

16. Способ получения регенеративного материала соединительной ткани по любому из пп. 1-15, включающий стадию приведения безводного пористого полимерного матрикса в контакт с суспензией негидратированных частиц кальция силиката в безводном полярном растворителе, где указанный полимерный матрикс содержит, по крайней мере, один полимер, выбранный из биодеградируемого или биосовместимого полимера.

17. Способ по п. 16, дополнительно включающий предварительную стадию получения безводного пористого полимерного матрикса, включающую:

(i) получение водного раствора, содержащего:

- по меньшей мере один полимер, биоразлагаемый и/или биосовместимый полимер; и

- необязательно кислоту;

(ii) заливку раствора в форму;

(iii) удаление воды.

18. Способ по п. 16 или 17, где, по крайней мере, один биодеградируемый и/или биосовместимый полимер выбирают из полиэфиров, полисахаридов, полипептидов и белков.

19. Способ по п. 16 или 17, где, по крайней мере, один биодеградируемый и/или биосовместимый полимер выбирают из группы, включающей хитозан, хитин, альгинат, коллаген, гиалуроновую кислоту, поли(молочную кислоту), поли(гликолевую кислоту), поли(капролактон), желатин или любой из образованных этими соединениями сополимер.

20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что приспособления для удаления воды выбирают из лиофилизатора, термоиспарителя и вакум-испарителя.

21. Способ по любому из пп. 16-17, отличающийся тем, что когда полимером является хитозан или хитин, то водный раствор содержит кислоту.

22. Способ по любому из пп. 16-21, отличающийся тем, что полярный растворитель выбирают из ацетонитрила, дихлорметана, тетрагидрофурана, этилацетата, диметилформамида, диметилсульфоксида, ацетона, метанола, смеси этанола, изопропилового спирта и уксусной кислоты.

23. Применение регенеративного материала соединительной ткани по любому из пп. 1-15 для лечения утраты соединительной ткани у нуждающегося в таком лечении пациента.

24. Имплантат, содержащий регенеративный материал соединительной ткани по любому из пп. 1-15.