Биокомпозитный сфероид для восстановления костей и способ его получения Российский патент 2021 года по МПК C12N5/77 A61F2/28 A61L27/38 

Область техники

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.

Уровень техники

Одной из актуальных проблем медицины является костная регенерация, особый практический интерес представляют дефекты костей превышающие критические размеры - это тот объем утраченной ткани, который организм человека не способен самостоятельно регенерировать. Трансплантация костной ткани или костнопластических материалов стоит на втором месте после переливания крови. Регенерация по трансплантату или костнопластическому материалу является длительным процессом, растягивающимся на многие месяцы и годы, требующим длительной и болезненной стабилизации костных отломков, часто иммобилизации конечности, для восстановления функций поврежденной части опорно-двигательного аппарата требуется много времени и далеко не всегда удается добиться полной реабилитации и избежать инвалидизации пациента.

Одной из стратегий клеточной терапии является использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга или собственных стромальных клеток костного мозга. Человеческие клетки относительно легко получить из аспирата костного мозга, сама аспирация костного мозга - малотравматичное вмешательство, которое может производиться без разрезов и под местной анестезией. Эти клетки относительно легко размножаются в культуре в условиях, при которых они сохраняют возможность к дифференцировке в клеточные линии, состоящие из остеобластов, адипоцитов, хондробластов. Одним из важнейших условий экспансии этих клеток является быстрая пролиферация с максимальным сохранением своей мультипотентности - пассирование распластанных на дне флакона клеток в малой плотности монослоя. Известно, что несмотря на большой пролиферативный потенциал, клетки стромы костного мозга при культивировании в стандартных условиях, при использовании ксеногенных, в том числе фетальных сывороток, постепенно утрачивают свои пролиферативные способности и способности к дифференцировке прежде всего в адипоциты и хондроциты.

Клеточная терапия при костной патологии предлагает персонифицированное лечение для устранения дефектов скелетных тканей, возникающих в результате травм, неэффективного заживления повреждений или врожденных дефектов. Тем не менее, большинство методов клеточной терапии достигли ограниченного успеха на сегодняшний день. Обычно вводимые в растворе в виде монодисперсных клеток (суспензии), трансплантированные клетки быстро гибнут или недостаточно долго задерживаются в месте трансплантации, иногда мигрируя в окружающие мягкие ткани, поэтому их предполагаемые эффекты ограничиваются несколькими днями.

Для систем открытой трансплантации стромальных клеток костного мозга (СККМ) необходимым компонентом успешного остеогенеза является использование трансплантационного носителя и его определенные характеристики. Точно установлено, что остеогенез не происходит при инъецировании суспензии костного мозга подкожно и внутримышечно и при имплантации ММСК КМ (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга) в виде агрегатов клеток без носителя (Goshima J, Goldberg VM, Caplan Al (1991). The osteogenic potential of culture expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop 262:298-311. Yoshikawa T, Ohgushi H, Tamai S (1996). Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite. I Biomed Mater Res 32:481-492).

Крайне важно, для образования кости трансплантированным СККМ требуется наличие организованного субстрата, с которым они могут взаимодействовать - прикрепляться и пролиферировать в течение достаточно длительного периода для обеспечения дифференцировки и остеогенеза. Подчеркнем, что для успешного формирования кости из культивированных стромальных клеток костного мозга, необходимо обеспечить контакт с носителем - деминерализованным костным матриксом или кристаллами гидроксиаппатита не менее нескольких недель, чтобы обеспечить адекватное распространение и дифференциацию необходимую для начала остеогенеза. Из используемых на сегодня носителей для трансплантации СККМ наиболее успешными оказались конструкции на основе гидроксиапатита (Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Robey BP, Robey PG Bone Marrow Stromal Cells: Characterization and Clinical Application // Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. - 1999. - V. 10, N. 2. - p. 165-181).

Функции мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, изучаются в сформированных из них сфероидах (C.S. Ong, X. Zhou, J. Han, C.Y. Huang, A. Nashed, S. Khatri, G. Mattson, T. Fukunishi, H. Zhang, N. Hibino, In vivo therapeutic applications of cell spheroids, Biotechnol Adv 36(2) (2018) 494-505).

Эти клетки обычно культивируют в остеогенных или хондрогенных средах, когда желательно нарастить массу остеобластов или хондроцитов для восстановления костной или хрящевой тканей. Есть мнение, что культивирование в условиях гипоксии увеличивает выживаемость и приживление сфероидов при пересадке реципиенту, что приводит к более эффективному остеогенезу (S.S. Ho, B.P. Hung, N. Heyrani, M.A. Lee, J.K. Leach, Hypoxic preconditioning of mesenchymal stem cells with subsequent spheroid formation accelerates repair of segmental bone defects, Stem Cells 36(9) (2018) 1393-1403).

После агрегации клеток в сфероиды часто используются добавки в питательные среды для 3D культур - различные цитокины или индукторы дифференцировки в течение продолжительного периода времени культивирования для получения и последующей трансплантации сфероидов, состоящих из дифференцированных клеток. Клетки внутри сфероидов демонстрируют больший остеогенный потенциал, по сравнению с индукцией органотипических признаков у клеток 2D однослойных культуры и только с последующим образованием из них сфероидов (S.S. Ho, A.T. Keown, B. Addison, J.K. Leach, Cell migration and bone formation from mesenchymal stem cell spheroids in alginate hydrogels are regulated by adhesive ligand density, Biomacromolecules 18(12) (2017) 4331-4340.]. В этом примере сфероиды выращивались следующим способом. МСК индуцировали остеогенно либо в монослое, либо в виде сфероидов. Для индукции монослоя, МСК были высеяны в количестве 5000 клеток/см² в колбах с культурой и поддерживались в остеогенных средах (среды роста, содержащие стандартные остеогенные добавки 10 мМ бета-глицерофосфат, 50 мкм г/мл аскорбат-2-фосфат, и 100 нМа дексаметазон) в течение 12 дней. Затем МСК были трипсинизированы и сформированы в сфероиды из 15000 МСК в остеогенной среде с использованием метода принудительной агрегации. Планшеты выдерживали в неподвижном состоянии в стандартном инкубаторе в течение 48 часов, чтобы обеспечить агрегацию клеток в сфероиды. Для индукции костных признаков МСК сначала формировали в сфероиды в остеогенной среде и переносили в 6-луночные планшеты, содержащие 2 мл 1,5% агарозы, для предотвращения адгезии к пластику для тканевых культур. Сфероиды культивировали в остеогенной среде в течение дополнительных 12 дней, в результате чего общий период остеоиндукции составлял 14 дней для обоих состояний. Однако, у описанного метода биофабрикации сфероидов есть целый ряд недостатков. Во-первых, более крупные растворимые молекулы, такие как факторы роста, не проникают равномерно через весь сфероид из-за радиальных различий в клеточном фенотипе и накоплении внеклеточного матрикса, что приводит к неравномерной дифференцировке клеток в составе сфероида. Во-вторых, после того, как сфероиды удалены из питательных сред, в составе которых эти цитокины, костный фенотип теряется в течение нескольких дней.

Для устранения этих недостатков в состав сфероидов включали микрочастицы, нагруженные факторами роста, которые постепенно выделяются в межклеточную среду. Чтобы решить эту проблему, была разработана система доставки факторов роста на основе микрочастиц для обеспечения эндохондрального окостенения в агрегатах мезенхимальных стволовых клеток (hMSC), полученных из костного мозга человека. Постепенное высвобождение растворимых трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1) и костного морфогенетического белка-2 (BMP-2) из микрочастиц при различных определенных временных параметрах приводил к различным степеням выраженности хондрогенеза и остеогенеза, что доказывалось изменением содержания специфическим для хряща гликозаминогликаном и кальция - для костной ткани. Время, в течение которого лучше всего индуцировалась эндохондральная оссификация, использовалось для разработки системы контролируемой доставки на основе микрочастиц для TGF-β1 и BMP-2. Желатиновые микрочастицы, способные к относительно быстрому высвобождению TGF-β1, и микрочастицы гидроксиапатита с минеральным покрытием, обеспечивающие более длительное высвобождение BMP-2, затем включали в агрегаты человеческих МСК и культивировали в течение 5 недель после заранее определенного временного курса для последовательного действия этих цитокинов. По сравнению с клетками в 2D культуре, сфероидами, обработанные экзогенными факторами роста, сфероиды с включенными в них микрочастицами, нагруженными TGF-β1 и BMP-2, демонстрировали усиление хондрогенеза и активность щелочной фосфатазы на второй неделе и большую степень минерализации к пятой неделе. Для подтверждения признаков костной и хрящевой ткани осуществляли окрашивание для коллагена типов I и II, остеопонтин и остеокальцин доказали наличие хряща и кости. Эта система, включенная в микрочастицы, имеет потенциал в качестве легко имплантируемой терапии для заживления дефектов кости без необходимости длительного хондрогенного праймирования in vitro (Dang PN, Dwivedi N, Phillips LM, Yu X, Herberg S, Bowerman C, Solorio LD, Murphy WL, Alsberg E. Controlled Dual Growth Factor Delivery From Microparticles Incorporated Within Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Aggregates for Enhanced Bone Tissue Engineering via Endochondral Ossification. Stem Cells Translational Medicine, 23 Dec 2015, 5(2):206-217).

Чтобы продлить остеогенную дифференцировку, адсорбировали рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) на наночастицах гидроксиапатита (HAp) и включили их в сфероиды. В этих условиях сфероиды проявляли более пространственно однородную остеогенную дифференцировку по всему сфероиду и сохраняли их дифференцировку после удаления растворимых сигналов [J. Whitehead, A. Kothambawala, J. Kent Leach, Morphogen delivery by osteoconductive nanoparticles instructs stromal cell spheroid phenotype, Advanced Biosystems 0(0) (2019) 1900141].

Известно также, что загружали биоминерализованные полимерные микрочастицы адсорбированным BMP-2, чтобы стимулировать остеогенную дифференцировку, или микрочастицы, нагружали TGF-1, чтобы способствовать формированию хрящевого фенотипа. Включение биоматериалов в сфероиды является перспективным методом для равномерного и постоянного действия дифференцирующих факторов на клетки в составе сфероидов (P.N. Dang, N. Dwivedi, L.M. Phillips, X.H. Yu, S. Herberg, C. Bowerman, L.D. Solorio, W.L. Murphy, E. Alsberg, Controlled dual growth factor delivery from microparticles incorporated within human bone marrow-derived mesenchymal stem cell aggregates for enhanced bone tissue engineering via endochondral ossification, Stem Cell Transl Med 5(2) (2016) 206-217).

Еще одной важной тенденцией в последнее десятилетие стало фокусирование внимания иммуномодуляции взаимодействий биоматериал-хозяин, что имеет решающее значение для повышения эффективности костнопластических материалов. Если оставить немодулированные воспалительные реакции, определяющие свойства межклеточной среды хозяина (локальная среда регенерации), обычно инициируется каскад клеточных и тканевых реакций, приводящих к местным реакциям на инородное тело, которые проявляются как воспаление, образование гигантских клеток, фиброз и, в, конечном итоге, подвергаются полному рассасыванию костнопластических материалов раньше, чем они успеют проявить свои остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства, иногда наблюдается и повреждение окружающих тканей хозяина.

Текущие ограничения для клинического использования сфероидов включают выбор источника клеток, есть две широкие категории: аллогенные или аутологичные. Аллогенные клетки являются предпочтительными, когда необходимо большое количество клеток, и предполагается воздействие на иммунный ответ организма реципиента. Использование аллогенных клеток является наиболее подходящим, если технология подготовки клеточного материала включает значительные манипуляции с клетками ex vivo, что позволяет тратить много времени на подготовку конструкции. Подобно анализу донорской крови в банках крови, коллекции аллогенных клеток могут быть хорошо охарактеризованы, дифференцированы и отсортированы по назначенным клиническим применениям на основании их способности к дифференцировке и регенерации. Тем не менее, вероятность отторжения тканеинженерной конструкции, даже при тщательном подборе совместимого донора, довольно высока, и объем финансовых затрат, связанных с длительной подготовкой трансплантата ex vivo, потенциально является чрезмерно дорогостоящим в крупном масштабе. С другой стороны, источники аутологичных клеток сталкиваются со многими из тех же ограничений, что и современные методы клеточной терапии, такие как ограниченный объем забора собственного материала (ограниченные собственные донорские ресурсы аутологичных тканей), боль и болезненность в донорских местах, а также увеличение времени и затрат, связанных с подготовкой клеточного материала или конструктов в тканеинженерных лабораториях ex vivo. Тем не менее, улучшения технологий забора клеток, их экспансии и формирования сфероидов плюс применение технологий искусственного изменения локальной среды регенерации in situ могут иметь решающее значение, позволяя более эффективно использовать аутологичные клетки для сборки достаточного количества сфероидов, пригодных для клинического использования.

Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления костей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, связанных с производством и трансплантацией сфероидов, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового трансплантата на основе клеточных сфероидов для эффективного восстановления костей и способа получения указанного трансплантата.

Техническим результатом данного изобретения является разработка и получение трансплантата для эффективного восстановления костей на основе клеточных сфероидов, обладающих выраженным регенеративным потенциалом и характеризующихся наличием костного матрикса с остеиндукционными свойствами. При этом получение сфероидов в неадгезивных агарозных лунках осуществляют из смеси измельченной деминерализованной кости и суспензии культуры клеток (аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга), в результате частица деминирализованной кости упаковывается внутрь образованного сфероида. В агарозной лунке (лунка 800 мкм диаметром, глубиной 2000 мкм в микроформованном агарозном геле) суспензия клеток устойчиво формирует «оболочку» из клеток и синтезированного ими внеклеточного матрикса, которая как бы упаковывает внутри кусочек деминерализованного костного матрикса. Вне агарозной лунки такого размера сформировать такой конструкт невозможно.

Технический результат настоящего изобретения заключается также в том, что способ по изобретению исключает необходимость использования любых дифференцирующих сред, замедляющих наращивание клеточной биомассы. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает снижение травматичности субъекта, забор костного мозга субъекта проводится путем пункции и аспирации костного мозга в амбулаторных условиях под местной анестезией.

Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из мультипотентных стромальных клеток костного мозга достаточно быстро. При образовании сфероида большая часть его центра представлена частицей костного матрикса (измельченной деминерализованной кости человека). Клетки костного мозга согласно способу по изобретению за 3-7 суток не только окружают частицу кости, но и образуют собственный матрикс, образующий кокон из волокон, удерживающий клетки на фрагменте деминерализованного аллогенного костного матрикса. Репаративная регенерация кости у реципиента происходит за счет внесенных источников регенерации, остеоиндуктивных материалов с большой удельной поверхностью (измельченная кость), защищенных от реакций на инородное тело. Такой трансплантат стимулирует также еще один способ регенерации кости - трансплантационную регенерацию кости. Собственные ткани реципиента активируются и более интенсивно врастают в трансплантат, включая сосуды и нервные волокна.

Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановления кости субъекта на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости, включающий следующие этапы:

а) выделение клеток из собственного костного мозга субъекта;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки;

в) получение частично деминерализованных частиц аллогенной кости;

г) перенесение клеток, полученных на стадии б), и частиц частично деминерализованной кости, полученной на стадии в), в лунки агарозного планшета;

д) агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биокомпозитсодержащие клеточные сфероиды.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии г) осуществляется из расчета 8 000-12000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.

В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения диаметр частиц частично деминерализованной аллогенной кости составляет от 50 до 250 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения культуральная питательная среда представляет собой среду на основе ксеногенных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, бессывороточную среду и/или синтетическую среду, дополнительна среда может включать добавки для выращивания клеток.

В частных вариантах воплощения изобретения агрегация клеток в клеточные сфероиды вокруг фрагмента деминерализованной кости осуществляется в агарозных лунках, где клетки в виде клеточных агрегатов пребывают до 8 дня.

В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %.

Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления кости субъекта, включающему клеточные сфероиды на основе культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы измельченной аллогенной деминерализованной кости, и полученных способом по изобретению.

В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %, более конкретно 10 - 30 %.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды с размером 250 до 600 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды, содержащие частицы аллогенной деминерализованной кости с диаметром от 50 до 250 мкм.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает дополнительный компонент, в частности, альгинатный гель с индукторами остеогенеза.

Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет применения аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга и кусочков измельченной аллогенной деминерализованной кости субъекта для получения трансплантата в виде биокомпозитных клеточных сфероидов.

Краткое описание чертежей.

Фигура 1. Микрофотография гистологического среза биокомпозитного сфероида по изобретению (окраска по Маллори). В центре фрагмент деминерализованной аллокости, вокруг микроткань, сформированная ММСК КМ.

Определение и термины

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.

Адгезивная культура - клеточная культура, состоящая из пластик-адгезивных клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга - мультипотентные клетки мезодермального происхождения в костном мозге взрослого организма, способные дифференцироваться в несколько типов клеток соединительной ткани - остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты и адипоциты.

Используемый в данном документе термин «дефект» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы.

Термин «среда» относится к питательной культуральной среде, предназначенной для культивирования сфероидов по изобретению, к примеру среда может быть выбрана из сред на основе ксеногенных сывороток животных, аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, различных бессывороточных коммерческих сред.

Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» - это процесс пересадки указанных сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта кости.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение - часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межклеточные взаимодействия.

Трансплантат по изобретению включает сфероиды из аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, полученные согласно способу по изобретения, наряду с этим трансплантат опционально включает, по меньшей мере, один дополнительны компонент. Так, в частности, таким компонентом может быть альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты (указанный гель может быть получен, в частности, способом описанным в Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al/ In vivo engineering of organs: The bone bioreactor/ PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl₂ в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл. В частных вариантах, гель на основе ГК, HA (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГА получают смешиванием равных объемов 2% (мас./об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) включают в количестве (0,4 моль/литр) во время гелеобразования. Кроме того, трансплантат, может содержать физиологически приемлемый носитель, который, в частности, представляет собой Ham's F12 культуральная среда, базовая, CLS. В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат может содержать комплекс NCTF® (компания LABORATOIRES FILORGA).

«Композиты» - это материалы-конструкции, они конструируются из двух, трех или более материалов, обладающих различными свойствами и достаточно надежно соединенных друг с другом, чтобы обеспечить работу полученной системы как единого целого. Биокомпозиты - это конструкции, созданные природой.

«Кость» - орган опорно-двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Кость с позиции материаловедения - это биокомпозит или полимерный композит. Исследованиями их свойств интенсивно занимаются специалисты в области композитов. Известно, что костная ткань содержит три основных компонента - минеральное вещество гидроксилапатит (~70 %), органическое вещество на основе белка коллагена (~20 %) и воду (~10 %).

Частицы деминерализованной кости по изобретению, в частности, представляют собой костнопластический материал Перфоост.

Добавка к питательной среде - это продукт, который используется для оптимизации базовых рецептур сред, а именно для поддержания роста и дифференцировки различных стволовых клеток и клеток-предшественников, а также первичных клеток, или для дифференцировки клеток в определенном направлении.

Синтетическая среда - культуральная питательная среда, которую готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.

Подробное раскрытие изобретение

Сфероиды, которые представляют собой плотные трехмерные клеточные агрегаты, усиливают известные полезные эффекты клеточной терапии, при этом увеличивая и продлевая время передачи сигналов от клетки к клетке и клеточному матриксу. Сфероиды из мультипотентных стромальных клеток костного мозга не только демонстрируют свою повышенную выживаемость, даже в центре многоклеточных агрегатов, но и важно, что при этом сохраняют остеогенные потенции, а также продуцируют обширный набор секретируемых белков, которые способствуют ангиогенезу, снижают воспаление, активируют и привлекают собственные - эндогенные клетки реципиента для участия в костной регенерации.

Важно отметить, что сохранение внеклеточного матрикса в тканевых сфероидах является критическим условием для успешной и пролонгируемой выживаемости клеток в суровых условиях посттрансплантационного приживления в организме реципиента, клетки в сфероиде более длительно сохраняют способность к секреции трофических факторов, по сравнению с диссоциированными клетками. Благодаря наличию собственного внеклеточного матрикса, а также частице деминерализованной аллогенной кости внутри сфероида и улучшенным межклеточным взаимодействиям, сфероиды при трансплантации создают локальное микроокружение, благоприятное для органотипической регенерации кости.

В качестве источника остеогенных клеток для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используется костный мозг самого пациента, который является источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При этом, в настоящем изобретении биоматериал, то есть частицы деминерализованной кости субъекта, заключены в оболочку из собственных клеток, то есть мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. С одной стороны клетки биокомпозитного сфероида взаимодействую с индуктором их дифференцировки, с другой защищают биокомпозит - аллогенную кость от быстрого лизиса, реакции организма на инородное тело.

Суспензия частиц измельченной аллогенной деминерализованной кости получали путем измельчения готовых деминерализованных костных блоков, подготовленных для клинического применения в виде костных блоков - костнопластического материала.

Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) осуществляют следующим образом. ММСК КМ были выделены из заднего подвздошного гребня здоровых мужчин-доноров (43 ± 5 лет) путем пункции аспирационной иглы и аспирации 25 мл костного мозга в шприц-контейнер. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10⁵ клеток на см².в среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО₂. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10³ клеток на см² и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).

После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.

Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) в условиях 3D культивирования внутри агарозных лунок диаметром 800 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром от 250 до 600 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром от 50 до 250 мкм.

В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса. Клетки и матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к механическим воздействиям. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.

Следует отметить, что при таком способе культивирования внутри лунок происходит увеличение биомассы сфероидов за счет как клеточной пролиферации, так и синтеза нового внеклеточного матрикса. Поэтому более уместно говорить не о клеточном, а о тканевом сфероиде в этом случае, хотя часто клеточный и тканевой сфероид употребляются как синоним. Обычно в центральной части сфероида наблюдаются дистрофия, а иногда и апоптоз клеток. Измельченная кость замещает эту неблагоприятную зону, и является естественным остеоиндуктором.

Благодаря дополнительному объему измельченных фрагментов аллогенной кости удается быстрее получить желаемые объемы пересаживаемого биоматериала и массы сфероидов - строительных блоков, которые могут быть использованы в виде биочернил для биопечати, либо, как трансплантат, несущий костнопластический материал для восстановления костных дефектов, проявления остеоиндукции, стимуляции репаративного остеогенеза и эффективного наращивания объема костной ткани при трансплантации in vivo.

Масса таких сфероидов может инициировать регенерацию собственных тканей и органов реципиента по типу трансплантационной регенерации, формируя живой каркас для ускоренной регенерации сосудов, нервов и собственных регенерирующих тканей реципиента.

Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 8 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.

Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм². Трансплантация может производиться эндоскопически.

Примеры осуществление изобретения

Пример 1.

У пациента из гребня подвздошной кости под местной анестезией путем прокола аспирационной иглой кортикальной пластики кости из губчатового вещества было аспирировано 25 мл костного мозга. Забранный материал в стерильном шприце передавался в клеточную лабораторию. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10⁵ клеток на см².в среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО₂. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10³ клеток на см² и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).

После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90-100 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости (костного аллоимплантанта) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.

Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) человека в условиях 3D культивирования внутри лунок в Микроформованном агарозном геле диаметром 800 мкм и глубиной 2000 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром 500 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром 250 мкм (Фигура 1).

В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса - измельченного в шаровой мельнице костного аллоимплантанта «Перфоост». Клетки и вновь образованный клетками матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к внешним механическим воздействиям - микроткань образованную в 3D-культуре ММСК КМ с кусочком измельченного костного аллоимплантанта в центре. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине. Предложены способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов и трансплантат для восстановления кости субъекта, полученный указанным способом. Способ включает выделение клеток из костного мозга субъекта, их культивирование в адгезивной культуре с последующим переносом в агарозные лунки одновременно с полученными частично деминерализованными частицами аллогенной кости, где происходит агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биокомпозитсодержащие клеточные сфероиды. Изобретения обеспечивают получения трансплантата в виде тканевых сфероидов из аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга субъекта с фрагментом измельченной частично деминерализованной аллогенной кости в центре этой тканеинженерной конструкции, обладающих выраженным регенерационным потенциалом и остеиндуктивными свойствами для восстановления кости. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 пр.

1. Способ получения трансплантата на основе клеточных сфероидов на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости для восстановления кости субъекта, включающий следующие этапы:

а) выделение клеток из собственного костного мозга субъекта;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки;

в) получение частично деминерализованных частиц аллогенной кости;

г) перенесение клеток, полученных на стадии б), и частиц частично деминерализованной кости, полученной на стадии в), в лунки агарозного планшета;

д) агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биокомпозитсодержащие клеточные сфероиды.

2. Способ по п.1, в котором субъект представляет собой человека.

3. Способ по п.1, в котором культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней.

4. Способ по п.1, в котором перенесение клеток на стадии г) осуществляется из расчета 8 000-12000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.

5. Способ по п.1, в котором размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.

6. Способ по п.1, в котором диаметр частиц частично деминерализованной аллогенной кости составляет от 50 до 250 мкм.

7. Способ по п.1, в котором культуральная питательная среда представляет собой среду на основе ксеногенных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, бессывороточную среду и/или синтетическую среду.

8. Способ по п.1, в котором агрегация клеток в сфероиды вокруг фрагмента деминерализованной кости осуществляется в агарозных лунках, где клетки в виде клеточных агрегатов пребывают до 8 дней.

9. Способ по п.1, в котором степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30%.

10. Трансплантат для восстановления кости субъекта, включающий сфероиды, размер которых составляет 250 до 600 мкм на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы частично деминерализованной аллогенной кости, и полученный способом по п.1, причем диаметр частиц аллогенной деминерализованной кости составляет от 50 до 250 мкм, степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %.

11. Трансплантат по п.10, в котором субъект представляет собой человека.

12. Трансплантат по п.10, который дополнительно включает альгинатный гель с индукторами остеогенеза.