ФРАГМЕНТ ДНК PCG 2,6, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ СЕКРЕТИРУЕМОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ PENICILLIUM CANESCENS, И ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM CANESCENS - ПРОДУЦЕНТ СЕКРЕТИРУЕМОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ Российский патент 1999 года по МПК C12N15/56 C12N15/80 C12N1/15 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии и представляет собой фрагмент ДНК мицелиального гриба Penicillium canescens, кодирующий синтез секретируемого фермента бета-галактозидазы и штамм-продуцент Penicillium canescens, сконструированный методами трансформации и генетической инженерии на основе этого фрагмента ДНК.

В качестве продуцентов бета-галактозидазы известны различные виды бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. По оптимуму действия бета-галактозидазы делятся на кислые и нейтральные (т.е. имеющие оптимум действия при соответствующей реакции среды). Секретируемые бета-галактозидазы грибов в основном имеют оптимум действия в кислых (pH 5) средах; бета-галактозидаза Penicillium canescens имеет оптимум действия при pH=4,5. Грибные секретируемые бета-галактозидазы используются в молочной промышленности для гидролиза лактозы в молочной творожной сыворотке.

Молекулярная масса бета-галактозидазы Penicillium canescens порядка 120-126 kD, оптимум действия при pH=4,5 и температурный оптимум при 55^oC (Николаев И. В. и др. 1989 Биохимия, т. 54: 1294-1299). Фермент представлен единой полипептидной цепью из 1011 аминокислотных остатков. Галактозидаза входит в группу нескольких секретируемых ферментов (амилаза, целлобиаза, целлюлаза, протеаза и др.), которые накапливаются в культуральной жидкости при глубинной ферментации. Среди секретируемых ферментов Penicillium canescens бета-галактозидаза преобладает, занимая около 30% всего секретируемого белка (Николаев И.В. и др. 1992 Биохимия, т. 57: 873-879).

Геном гриба Penicillium canescens (ВКПМ F178) содержит одну копию гена секретируемой бета-галактозидазы ( Николаев И.В. и др. Молекулярная биология 1992 т. 26: 869-875). Ген бета-галактозидазы включает в себя нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую бета-галактозидазу (структурная часть гена), 5'- нетранслируемую область ДНК, несущую регуляторную функцию и 3'- нетранслируемую область. Регуляция активности бета-галактозидазы осуществляется путем индукции или репрессии ее синтеза. Индуцирующим началом является наличие в среде арабинозы. Максимальная индукция наблюдается при концентрации арабинозы порядка I mM. При наличии в среде глюкозы, других сахаров, а также избытка арабинозы происходит репрессия синтеза по механизму углерод-катаболитной репрессии (Nikolaev I.V., Vinetski Yu.P., 2nh Europ. Conf. Fung. Genet., abstr. A8, 1994, Lunteren, The Netherlands).

В качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения может быть рассмотрен фрагмент ДНК PCG 12-38, кодирующий синтез бета-галактозидазы Penicillium canescens и сконструированный на его основе штамм-продуцент бета-галактозидазы Penicillium canescens F-715 (заявка на патент РФ N 94042578, Бюллетень изобретений РФ N 23, 1996 г.).

Фрагмент ДНК PCG 12 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую структуру бета-галактозидазы (структурная часть гена, включающая в себя 3368 н. п. ) и 5'-нетранслируемую область размером 1000 н.п. Эта область обеспечивала регуляторную функцию углерод-катаболитной репрессии, но не содержала всех элементов, необходимых для активации гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens F-715 за 96 часов ферментации накапливал до 220 ед/мл бета-галактозидазы (субстрат ОНФГ, 30^oC) на среде с свекловичным жомом и БВК.

Задачей заявляемой группы изобретений является повышение уровня накопления бета-галактозидазы Penicillium canescens в культуральной жидкости. Для решения задачи получают фрагмент ДНК PCG 2,6 размером 6,3 т.п.н., несущий полную структурную часть гена бета-галактозидазы и функционально полную регуляторную область этого гена.

Для решения задачи на основе вышеприведенного фрагмента конструируют штамм Penicillium canescens PCG 2,6-26 (регистрационный номер во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ВКПМ F-725), в геном которого включены 8-10 дополнительных копий гена бета-галактозидазы с полной регуляторной областью.

Штамм Penicillium canescens F-725 способен за 96-108 часов ферментации накапливать в культуральной жидкости 605-620 ед/мл бета-галактозидазы. Конструирование штамма включало в себя несколько этапов.

Этап 1 - выделение фрагмента ДНК PCG 2,6 гриба Penicillium canescens F178, кодирующего ген секретируемой бета-галактозидазы с полной регуляторной областью.

Этап 2 - включение выделенного фрагмента ДНК с геном в состав векторной молекулы pTZ19R.

Этап 3 - трансформация штамма-реципиента Penicillium canescens ВКПМ F-1178 niaD (РСА 10) векторной молекулой с включенным геном бета-галактозидазы.

Этап 4 - отбор наиболее продуктивного трансформанта, его генотипический фенотипический и физиолого-биохимический анализ.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и генотипическими признаками, некоторые из которых отличались от таковых у природного штамма
1. Культурально-морфологические признаки на различных питательных средах после 10 суток роста при 30^oC:
а) Сусло-агар.

Диаметр колоний 6,5 - 7,5 см. Колонии различной степени опушенности, радиальнобороздчатые, с обильным спороношением, дымчато-зеленовато-серые с растущим краем ( 2-4 мм). Обратная сторона оранжево-темно-коричневая. Конидиеносцы 430-450 • 3.0-3.2 мкм, конидии 2.0-2.2 мкм, шаровидные, в молодом возрасте гладкие, в старом шероховатые, образуются в цепочках, соединяются в колонки, со временем распадающиеся.

б) Агаризованная среда Ролена-Тома с сахарозой.

Диаметр колоний 38-48 мм. Колонии войлочные или слабо пушистые в центре, слабовыпуклые, с радиальными бороздками, белого цвета, по краям окрашены в серо-голубоватый тон, края неровные, лопастные, обратная сторона серо-бежевого тона.

в) Агаризованная среда Чапека с глюкозой.

Диаметр колоний 2,8-4,0 см. Колонии серые, складчатые, с ровным краем, конидиеобразование интенсивное, цвет конидий светло-серый. Обратная сторона колоний с радиальными складками слабо кремового тона.

По культурально-морфологическим признакам, перечисленным выше, не отмечено отличий от природного штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178, за исключением характера роста на среде Чапека с глюкозой, где у штамма Penicillium canescens ВКПМ F-725 отмечено более интенсивное спороношение и некоторое изменение формы края колонии.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Мезофил, растет при 25-37^oC, оптимальная температура роста 29^oC. Оптимум роста при значениях pH среды 4,1-5,8. Желатину разжижает слабо. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает моно-, ди- и полисахариды, за исключением арабинозы, которую утилизирует слабо. Хорошо усваивает аммонийный и нитратный азот, пептон, мочевину.

У заявляемого штамма Penicillum canescens ВКПМ F-725 избирательно увеличена активность секретируемой бета-галактозидазы, доля которой составляет 88% от суммарного внеклеточного белка, а другие секретируемые ферменты культуральной жидкости не изменены.

3. Генетическая стабильность.

Штамм ВКПМ F-725 стабилен по признаку продукции бета-галактозидазы после десятикратного пассажа конидиями. С исходного клона после первичного пересева было сделано десять последовательных пересевов конидиями на косяки, каждый из которых инкубировали до образования зрелых конидий и хранился при 4^oC. Затем с 1-го, 2-го, 4-го, 6-го, 8-го и 10-го косяка были взяты конидии для инокулирования проб с жидкой средой (свекловичный жом и соевый шрот). При их одновременной ферментации в динамике определялась активность бета-галактозидазы в культуральной жидкости (таблица).

4. Генотипические признаки.

Основной генотипический признак заявляемого штамма заключается в увеличенном числе генов секретируемой бета-галактозидазы. Определение числа генов в сравнении с исходным штаммом было проведено методом дот-гибридизации ДНК-ДНК. На нейлоновый фильтр для ДНК-гибридизации каплями в ряд наносили ДНК штаммов Penicillium canescens ВКПМ F-178 niaD (РСА10) и заявляемого в равном количестве, соблюдая принцип двукратного разведения между соседними каплями. Четкое отсутствие сигнала гибридизации с меченой ДНК плазмиды, несущей ген бета-галактозидазы у ДНК штамма РСА-10, наблюдаемой на 3 разведения ранее, чем у штамма ВКПМ F-725 доказывало, что в геном последнего включены 8-10 дополнительных копий гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens PCG 2,6-26 дополнительно содержит плазмиду pSTA10 с геном нитратредуктазы Aspergillus niger (Unkles et al., 1989).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение фрагмента ДНК PCG 2,6, кодирующего синтез бета-галактозидазы.

Для получения банка генов ДНК используют штамм Penicillium canescens ВКПМ F-178. ДНК этого штамма обрабатывают рестриктазой Sau3A в условиях неполного расщепления, фракционируют путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы, выделяя фрагменты ДНК размером 20 тыс.пар оснований (п. о. ), и включают путем легирования в ДНК фагового вектора лямба EMBL4. Далее готовят упаковочную смесь (белки фаговых головок и белки хвостов фага лямбда по отдельности), проводят упаковку при оптимальных соотношениях компонентов смеси и полученные фаговые частицы с рекомбинантными ДНК рассевают на чашки Петри с питательной средой и индикаторными бактериями (Т.Маниатис, Э.Фрич, Дж. Самбру. Молекулярное клонирование. М.; Мир, 1984). Полученные негативные колонии (независимые клоны) в количестве 3 • 104 в совокупности представляют собой банк генов пеницилла. Далее из этого банка генов выделяют фрагмент ДНК, кодирующий ген секретируемой бета-галактозидазы с промоторным районом, несущим все сигнальные последовательности для регуляции (индукции и репрессии) ее синтеза.

Для решения этой задачи синтезируют олигонуклеотид (зонд 1) с последовательностью с учетом частоты встречаемости кодонов в мицелиальных грибах. Эта последовательность соответствует N-концевой аминокислотной последовательности бета-галактозидазы (с 4-ой по 11-ую аминокислоту). Полученный олигонуклеотид в количестве 10 нг смешивают с 10 мкг мРНК, выделенной из клеток мицелия гриба Penicillium canescens ВКПМ F-178, нагревают 3 мин при 80^oC, а затем инкубируют 1 ч при 50^oC и определяют нуклеотидную последовательность мРНК гена бета-галактозидазы по Сэнгеру в направлении от праймера (олигонуклеотида-зонда 1) к 5'-концу. На основе секвенированной последовательности РНК синтезируют олигонуклеотид 2 для гибридизационного скрининга фаговой библиотеки генов P. canescens: 5' GATGGTGAAGCCATCCA- ACTTATG 3'.

Этот зонд радиоактивно метят до высокой специфической активности (1 • 10¹⁰ имп. мин/мкг) с помощью терминальной трансферазы в буфере, содержащем 100 мМ какодилата К, pH = 7,0, 1мМ дитиотреитола, 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 нг зонда, 100 мкКи [-32 * P]dATP и 20 ед. фермента в течение 1ч при 37^oC и добавляют в раствор для гибридизации (5х раствор Денхардта, 6xSSC, 0,5%SDS, 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося) до конечной концентрации 106 имп.мин/мкг. Фаговые негативные колонии переносят на нейлоновые фильтры для ДНК-ДНК гибридизации и инкубируют в указанном растворе в течение ночи, плавно снижая температуру с 65^oC до комнатной, после чего отмывают фильтры от неспецифически связавшейся метки в растворе 4xSSC при 37^oC. Фильтры экспонируют с рентгеновской пленкой. При анализе геномной библиотеки гриба Penicillium canescens данным методом из 3х10⁴ рекомбинантных фагов были выделены клоны, из которых детально исследован клон PCG 2,6. Этот клон нес фрагмент ДНК PCG 2,6 с структурной кодирующей частью гена секретируемой бета-галактозидазы, 3'-нетранслируемой частью и 5'-нетранслируемой областью протяженностью 2600 нуклеотидов. Эта область содержит нуклеотидную последовательность ДНК, полностью обеспечивающую регуляторную функцию (специфическую индукцию арабинозой и углеродкатаболитную репрессию) гена секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens ВКПМ F-178. Для определения нуклеотидной последовательности гена бета-галактозидазы фрагмент ДНК, кодирующий полный ген, его 5'-нетранслируемую область и 3'-нетранслируемую область расщепляют рестриктазами и полученные фрагменты в прямой и обратной ориентациях клонируют в векторный фаг М13 для секвенирования ДНК по методу Сенгера. Ниже приведены нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая полный ген секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens, а также нуклеотидные последовательности и 5' и 3'-нетранслируемых областей этого гена.

Далее получают плазмиду pPCG 2,6, несущую фрагмент ДНК PCG 2,6, кодирующий бета-галактозидазу. 2 мкг ДНК фагового клона PCG 2,6, содержащего фрагмент ДНК с геном бета-галактозидазы, обрабатывают рестриктазой BglI в течение 1 ч при 37^oC в количестве 20 ед. в условиях неполного расщепления и затем образовавшиеся фрагменты легируют с 0,1 мкг плазмиды pTZ19R (Pharmacia catalog, 1986), предварительно расщепленную той же эндонуклеазой рестрикции. Легирование проводят в течение ночи при 16^oC, добавляя в пробу 2 ед. ДНК-лигазы фага Т4. Клоны, содержащие фрагмент ДНК с данным геном отбирают путем гибридизации с радиоактивно меченным зондом 2, после чего проверяют ориентацию вставки в полученной плазмиде pPCG 2,6.

Пример 2. Получение штамма Penicillum canescens ВКПМ F-725. Для решения этой задачи требуется система трансформации, позволяющая включать в геном штамма Penicillium canescens дополнительные копии гена бета-галактозидазы. Штамм Penicillium canescens F-178 niaD (РСА10) - реципиент для трансформации был получен селекцией штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 после мутагенеза нитрозогуанидином по признаку устойчивости к хлорату, происходящей вследствие утраты активности фермента нитратредуктазы. ( Aleksenko A.Y. et аl 1995 Curr Genet 28:474-477).

Генетический дефект в полученном штамме затрагивал признак niaD, что было доказано комплементацией этого признака при трансформации штамма РСА10 плазмидой pSTA10, несущей ген niaD Aspergillus niger (Unkles S.et al. 1989 Gene 1989 78: 157).

Штамм-реципиент Penicillium canescens F-178 niaD (PCA 10) выращивают в течение 16 ч при 30^oC на полной питательной среде с NH₄CI в качестве источника азота, переносят мицелий в раствор 1.2 М MgS0₄ и 10 мМ NaH₂P0₄, pH = 5.8 и добавляют лизирующие ферменты Trichoderma reesei до концентрации 3 мг/мл. Протопластирование проводят в течение 1 ч при 30^oC в условиях перемешивания. Протопласты собирают центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сорбитола, промывают 2 раза в стабилизирующем растворе, содержащем 1,2 М сорбитола, 10 мМ Трис, pH = 7,5, 10 мМ CaCl₂ и суспендируют в нем же при концентрации 108 протопластов/мл. Трансформацию проводят следующим образом: к 100 мкл суспензии протопластов добавляют 1 мкг ДНК плазмиды PSTA10, несущей в качестве селективного маркера ген нитрат редуктазы Aspergillius niger, и 10-20 кратный избыток плазмиды pPCG 2,6 с геном бета-галактозидазы Penicillium canescens, инкубируют при комнатной температуре 20 мин, после чего проводят осмотический шок в течение 5 мин в 50% полиэтиленгликоле и высевают протопласты на агаризованную питательную среду с 10 мМ NaNO₃. Через 4-5 суток инкубации при 30^oC проводят скрининг полученных котрансформантов, анализируя уровень бета-галактозидазной активности в культуральной жидкости. Один из котрансформантов, N 26, обнаружил наивысшую способность к продукции секретируемой бета-галактозидазы. Таким образом получен заявляемый штамм Penicillium canescens F-725.

Пример 3. Ферментация штамма Penicillium canescens ВКПМ F-725 и оценка его продуктивности.

Для получения посевного материала культуру штамма PCG 2,6-26 выращивают на агаризованной среде Роулен-Тома при 30^oC в течение 5-7 суток. Водной суспензией конидий (107 конидий/мл) инокулируют 100 мл среды (свекловичный жом -30 г/л: соевый шрот - 50 г/л; KH₂PO₄ - 25 г/л, pH=4,5) и инкубируют в качалочной колбе при 30^oC в течение 120 ч на круговой качалке при 240 об/мин. По окончании ферментации культуральную жидкость отделяют от мицелия и твердых остатков среды центрифугированием (10000g, 15 мин) и в супернатанте определяют активность бета-галактозидазы. Определение активности бета-галактозидазы: Реакционную смесь, содержащую 3 мг. О-нитрофенил-галактопиранозида (ОНФГ) в 1,9 мл 50 мМ Na-ацетатно- го буфера pH - 4,5 и 100 мкл культуральной жидкости соответствующего разведения инкубируют 15 мин при 30^oC, затем добавляют 1 мл 1 М Na₂CO₃ и измеряют оптическую плотность раствора при 420 нм. За единицу активности бета-галактозидазы принимают количество фермента, которое освобождает из субстрата ОНФГ 1 мкмоль О-нитрофенола за 1 мин при данных условиях реакции.

Через 96 ч ферментации штамм Penicillium canescens ВКПМ F-725 накапливает в культуральной жидкости 620 ед/мл бета-галактозидазы. Для бета-галактозидазы среди всех секретируемых белков в культуральной жидкости составляет согласно данным белкового электрофореза 90%.

Пример 4. Ферментация штамма Penicillium canescens F-715. Процесс ферментации и определение активности бета-галактозидазы осуществляют как в примере 3, но в качестве продуцента бета-галактозидазы используют штамм Penicillium canescens F-715. Через 96 ч ферментации штамм-прототип накапливает в культуральной жидкости 202 ед/мл бета-галактозидазы. Доля бета-галактозидазы среди других секретируемых белков в культуральной жидкости составляет по данным белкового электрофореза 55%.

Таким образом, использование заявляемого штамма позволяет значительно (более чем в 3 раза) увеличить количество накапливаемой в культуральной жидкости бета-галактозидазы, а также повысить ее долю среди других секретируемых белков (с 55% до 90%), что существенно упрощает процедуру выделения этого фермента.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и к генетической инженерии и может быть использовано для получения бета-галактозидазы. Фрагмент ДНК PCG 2,6, размером 6,3 т.п.н., несет полную структурную часть гена бета-галактозидазы и функционально полную регуляторную область этого гена. На основе фрагмента конструируют штамм Penicillium canescens ВКПМ-725-продуцент бета-галактозидазы. За 96-108 часов ферментации использование штамма позволяет получить в культуральной жидкости 605-620 ед/мл бетагалактозидазы. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

1. Фрагмент ДНК PCG 2,6, кодирующий синтез секретируемой бета-галактозидазы Penicillium canescens, содержащий регуляторные элементы и структурную часть гена бета-галактозидазы (см.описание). 2. Штамм гриба Penicillium canescens ВКПМ F-725-продуцент секретируемой бета-галактозидазы.