Способ получения ферментного препарата @ -галактозидазы Советский патент 1981 года по МПК A61K38/46 C12N9/38 

Изобретение стносится к технологии получения ферментного препарата Л-галактозидазы. Препарат предназначен для лечения лактазной недостаточности. Известен способ получе1а{я фермент ного препарата р-галактозидазы путем фильтрации культуральной жидкости гриба-продуцента Си rvu 1 а г 1 а inaequal i штамм 75, сорбции фермента из полученного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой обычно используют карбоксильный катионит КИТ в высокодисперсной форме, представляющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина, с последующей десорбцией фермента цитратным буфером, ультрафильтрацией раствора через ацетатцеллюлозную мембрану и лиофильной сушкой. Конечный продукт обладает активностью 5000-6000 ед/г Однако- известный способ имеет недостаточно высокую активность целевого продукта. Цель изобретения - повышение активности целевого продукта. Указанная цель достигается способом получения ферментного препарата )Ь-галактозидазы, который заключается в том, что культуральную жидкость гриба-продуцента Curvularia lis штамм 75 подвергают выморажива1нию при (-15) - (-18)с в течение 12-15 ч с последующим оттаиванием, затем ее подвергают фильтрации, полу ченной в результате фильтрации нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильтрации с помощью мембраны РТНК 00005, после чего проводят сорбцию фермента из сконцентрированного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой используют полимер, представляющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина. Предлагаемый способ позволяет увеличить активность целевого продук та в 2 раза. Введение в технологический процес стадии замораживания и оттаивания культуральной жидкости перед фильтра цией увеличивается скорость фильтрации в 1,5-2 раза, за счет увлечения слизистых полисахаридов продуцента разрушенными клетками мицелия. Кроме этого, из разрушенных клеток в раствор переходит эндогенная Jb-галактозидаза. Активность раствора повьш1ает ся в результате этого на 40%. 1 Так как введение стадии вымораживания-оттаивания культуральной жид-, кости позволяет освободить нативный раствор фермента от сопутствующих слизистых осадков полисахаридной природы, то возмолсно проводить, концентрирование активности нативного раствора с помощью ультрафильтрации что позволяет получить продукт более высокого качества. Таким образом, сочетание и указанная последовательность операций при- проведении процесса в строго . определенных условиях (рН, температура, ионная сила растворов, исполь зование иоиита и мембрань заданной струЕстуры) позволяет получить препа рат высокого качества и чистоты, из которого можно приготовить фермент медицинского назначения. Предлагаемый способ получения ферментного препарата р)-галактозида зы состоит из следующих стадий; 1 . Выг-юраживание культуральной жидкости при (-15)-(18)°С 12-15 ч, оттаивание при комнатной температур 2.Фильтрация культуральной жидкости через фильтр с наполнителем (HanpiiMept .перлит, кизельгур, инфузорная земля в количестве 0,5 вес.% к объему) . 3.Концентрирование нативного раствора фермента на ультрафильтрац онной установке Millipore (США) на мембране типа РТНК 00005 при ком натной температуре примерно в 810 раз. .4. Сорбция нативного раствора с рН 3,5 высокодисперсным катионитом КИТ. 5. Промьюка смолы умягченной во, дои с рН 3,5-6,0 для десорбции балластных белков. 6 . 4 6.Десорбция фермента со смолы 0,2 М цитратным буферным раствором с рН 4,84:0,5. 7.Концентрирование элюата в 3 раза на ацет: атцеллкшозной мембране УАМ-300 с радиусом пор 100-150 А и последующими двумя диафильтрациями дистиллированной водой каждая в 10-кратном объеме к исходному. 8. Высушивание высококонцентрированных и обессоленных растворов фермента лиофильно известными способами. Пример 1. Культуральную жидкость по окончании ферментации (активность 1,9 ед/мл, рН 4,9) сливают в емкость и замораживают при (-18)(-20)С на 15ч, оттаивают при комнатной температуре, фильтруют с наполнителем на рамном фильтр-прессе. Выход на стадии фильтрации 80%. Нативный раствор с активностью 2,7 ед/мл в количестве 20 л концент рируют в 10 раз ПО объему на ультрафильтрационной установке фирмы Millipore на мембране типа РТНК 00005. Получают 2 л раствора с активностью 26 ед/мл, выход на стадии 96,3%. Полученный раствор подкисляют 3 н. НС1 при перемешивании до рН 3,5; инактивации не наблюдается. Рг-Галактозидазу из раствора сорбируют высокодисперсной формой смолы КМТ (ТУ-6-09-10-456-75) (40-60 мкм в количестве 100 г) на послойной ионообменной колонне, где смола (по 10 г) расположена 1 см - слоем на 10-и последовательно соединенных кольцах. Смолу готовят путем последовательной обработки: 1 н. НС 1 умягченная вода, 1 н. NaOH в 2 н.-ном растворе NaC1, 1 н.ацетатным буферным раствором с рИ 3,5 с 1 н. NaCI. Скорость фильтрации раствора через смолу 30 мл/ч-см . Выход на стадии сорбции 85%. Затем для десорбции со смолы балластных белков проводят промывку умягченной водой с рН 3,5 и нейтральным рН (по 2л). Десорбцию )-галактозидазы осуществляют 0,2 н. цитратным буферным раствором с рН 4,8 со .скоростью 10 . Собирают 5 фракций по 300 мл, в трех средних содержится 85% сорбированного фермента со средней активностью 39 ед/мл. Эти фракции концентрируют и деминерализуют с помощью ацетатцеллюлозной мембраны УАМ-200 {ТУ-6-05-221-599-77) в ячейки ограниченного объема, получают 250 мл с активностью 135 ед/мл, т.е. выход на стадии 96%. Лиофилизация концентрата проходит с выходом по активности 75%. Получают 2,12 г препарата с активностью 12 ед/мг. Выход конечного продукта от содержания в культуральной жидкости 38%. Пример 2. Культуральную жид кость по окончании ферментации с активностью 2,2 ед/мл, рН 4,4 подвергают замораживанию. Замораживание повышает активность исходного раство ра до 3,0 ед/мл. Полученный после фильтрации культуральной жидкости (выход 80%) на рамном фильтр-прессе с 0,5% перлита нативньш раствор (25 л по объему) концентрируют на ультрафильтрационной установке Mill роге. Выход на стадии 98,5%, т.е. получают 2,5 л с активностью 29,6 ед/мл. 6« Сорбция подкисленного до рН 3,5 концентрированного нативного раствора проходит с выходом 82%. После промывки смолы в колонне подкисленной и нейтральной умягченной водой, проводят десорбцию. Получают 1,2 л элюата со средней активностью 42 ед/мл, выход со$Л1авляет 83%. Элюат деминерализуют и концентрируют ультрафильтрацией до 360 мл, активность полученного концентрата 133 ед/мл, выход на стадии 95%. После лиофилизации концентрата получают, порошок в количестве 3,17 л с активностью П ед/мг. Выход на стадии лиофилизации 73%, общий выход конечного продукта от содержания в культуральной жидкости 37%. В табл. 1 приведены сравнительные данные по очистке -галактозидазы известным и предлагаемым способами, в табл. 2 - характеристика технологического процесса.

О

О

о

о

о

о

Г.

1

гъ

со

CN| СП

1Л го

ONtM

«чfi

- еч

Характеристика технологического процесса

Время проведения отдельных технологический стадий, чВымораживание и оттдивание культуральной жидкости

Фильтрация культуральной

жидкости

Концентрирование нативного раствораСорбция на смоле КМТ

Ультрафильтрация элюата

Конечный продукт Активность, ед/мг

Удельная активность, ед/мг белка

- Формула изобретения

Способ

I Известный I Предлагаемый

12-15

2-3

1

1

14

10-12 13-14

(-15)-(-18)с в течение 12-15 ч, с последующим оттаиванием, а нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильтрации с применением мембраны РТНК 00005.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР №659612, кл. С 12 О 13/10, 1976 (прототип) .