ПРИМЕНЕНИЕ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОДЛОЖКИ БИОЧИПОВ, БИОЧИП НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГИДРОГЕЛЕЙ НА НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛАХ Российский патент 2007 года по МПК C07K17/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии и касается применения полимерных материалов, которые могут использоваться без предварительной химической модификации, для изготовления биочипов с иммобилизованными в геле олигонуклеотидами, белками, нуклеиновыми кислотами или любыми другими биологически активными соединениями. Изобретение также относится к способу изготовления гелевых биочипов, находящих применение в молекулярной биологии при секвенировании и картировании ДНК, детектировании мутаций и целого ряда медицинских приложений.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время для изготовления биочипов используются подложки из стекла (керамики), металлов и полимерных материалов. Стекло, метал и основная часть полимеров перед изготовлением микрочипов химически модифицируются с образованием на поверхности активных групп, способных связывать биологически активные соединения. Наиболее популярными являются поверхности с карбоксильной [1], амино, меркапто [2], альдегидной [3], изоцианатной [4], метакрилатной [5] и др. группами. В ряде случаев удается иммобилизовать биологически активные соединения на нейлоновых мембранах [4] и на полистироле [6] без их дополнительной модификации.

[1] Nathalie Zammatteo, Laurent Jeanmart, Sandrine Hamels, Stephane Courtois, Pierre louette, Laslo Hevesi, Jose Remacle, Analytical Biochemistry, 2000, 280, P.143-150.

[2] Celine Adessi, Gilles Matton, Guidon Ayala, Gerardo Turcatti, Jean-Jacques Mermod, Pascal Mayer, Eric Kawashima, Nucleic Acids Research, 2000, V.28, N 20, e87.

[3] Edward N. Timofeev, Svetlana V. Kochetkova, Andrei D. Mirzabekov, Vladimir L. Florentiev, Nucleic Acids Research, 1996, V.24, N 16, P.3142-3148.

[4] Markus Beier, Jorg D. Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, V.27, N 9 P.1970-1977.

[5] Anil Kumar, Zicai Liang, Nucleic Acids Research, 2001, V.29, N 2, e2.

[6] Farah N.Rehman, Mark Audeh, Ezra S.Abrams, Philip W.Hammond, Mary Kenney, T.Christian Boles, Nucleic Acids Research, 1999, V.27, N 2, P.649-655.

Известны способы изготовления биочипов на основе гидрогелей, в которых технологический цикл состоит из этапов: (1) химической модификации стеклянной подложки, (2) формирования на ней матрицы ячеек геля, (3) нанесения на ячейки растворов биологических макромолекул в соответствии с заранее составленной схемой биочипа, (4) химической активации ячеек с целью иммобилизации молекул-зондов, (5) отмывки и просушки полученных биочипов. Для формирования матрицы ячеек геля известен метод лазерной абляции расположенного под сплошным слоем геля специального светопоглощающего слоя с геометрией, дополнительной по отношению к заданной геометрии массива ячеек [7].

[7] Ershov et al., US Patent №5770721.

Известны также способы приготовления биочипов на основе геля, в котором стадии формирования массива ячеек и иммобилизации молекул-зондов объединены в одну за счет использования техники фото- или химически индуцируемой сополимеризации [8, 9].

[8] Vasiliskov A.V. et al., BioTechniques, 1999, V.27, P.592-606.

[9] RU 2216547 C2.

Суть их состоит в использовании композиций, в состав которых наряду с мономером и сшивающим агентом входят иммобилизуемые макромолекулы, снабженные активной группой, обеспечивающей встраивание этих молекул в полимерную сетку гидрогеля.

Используемые в настоящее время материалы для изготовления подложек биочипов, а также способы изготовления на их основе биочипов имеют ряд существенных недостатков.

К основным недостаткам стеклянной подложки можно отнести следующие.

- Недостаточная химическая однородность поверхности стекла.

Данное свойство стекла при химической модификации приводит к образованию поверхности в виде участков с различной гидрофобностью (гидрофильностью), что сильно влияет на воспроизводимость физических параметров биочипа, в том числе объема и формы ячеек, а также их взаимного расположения.

- Относительная сложность в технологии переработки стекла и изготовлении биочипов с заданной конфигурацией поверхности.

- Недостаточная механическая прочность.

- Сравнительно высокая стоимость подложки с необходимым качеством поверхности.

- Обязательная химическая обработка поверхности стекла для эффективной иммобилизации биологически активных молекул.

К основным недостаткам используемых в настоящее время полимерных материалов для изготовления подложек можно отнести следующие.

- Поверхность полимеров требует предварительной химической модификации.

- Пористая структура используемых в настоящее время нейлоновых фильтров накладывает ограничения на количество элементов биочипа в расчете на единицу поверхности.

- Элементы гелевых биочипов, изготовленных на полистироле без предварительной химической модификации его поверхности, слабо связаны с поверхностью и при проведении отмывок и гибридизаций часто подвергаются деструкции.

Все известные в настоящее время способы изготовления гелевых биочипов основаны на использовании в качестве подложки химически модифицированного стекла, со всеми его недостатками, влияющими на производительность изготовления гелевых биочипов, а также их качество.

Краткое описание изобретения

Первый аспект настоящего изобретения предусматривает применение немодифицированных полимерных материалов, используемых без их предварительной модификации, для изготовления подложки биочипов, которая предназначена для иммобилизации на ее поверхности гидрогелей. Иммобилизация гидрогелей на поверхности подложки осуществляется в момент их формирования методом полимеризации.

Полимерные материалы, которые можно использовать без их предварительной модификации для изготовления подложки биочипов, выбирают из АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3-Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей. Изобретение также предусматривает применение полимерных материалов и/или их смесей в комбинации с наполнителями. В качестве наполнителей можно использовать неорганические наполнители, такие как асбест, стекловолокно и/или тальк.

Второй аспект настоящего изобретения предусматривает биочип, изготовленный на подложке из перечисленных выше немодифицированных полимерных материалов и/или их смесей, с иммобилизованным на поверхности подложки слоем геля. Указанные полимерные материалы и/или их смеси можно также использовать в комбинации с наполнителями. В качестве наполнителей можно использовать неорганические наполнители, включая асбест, стекловолокно и/или тальк. Гель, иммобилизованный на полимерной подложке, также может быть дополнительно разделен пустыми промежутками на ячейки. Указанные ячейки также могут образовывать регулярную одномерную или двумерную структуру (массив).

Гелевые ячейки могут содержать иммобилизованные биологически активные соединения, причем в разных гелевых ячейках могут быть иммобилизованы разные биологически активные соединения. Каждая гелевая ячейка биочипа может дополнительно содержать иммобилизованный флуоресцентный краситель, например Texas Red®гидразид ("Invitrogen", USA) (Texas Red), 4′-(аминометил)флуоресцеина гидрохлорид ("Invitrogen", USA) (Fluorescein), Су5-гидразид ("Amershambiosciences", USA)(Су 5), Су3-гадразид ("Amershambiosciences", USA) (Су 3), 5-(((4-(4,4-дифтор-5-(2-тиенил)-4-бор-3а,4а-диаза-s-индацен-3-ил)фенокси)асетил)амино)пентиламина гидрохлорид ("Invitrogen", USA) (BODIPY). Иммобилизация указанных соединений в геле осуществляется в момент формирования геля при термически, химически и фотохимически инициированной полимеризации.

Третий аспект настоящего изобретения предусматривает способ изготовления гелевых биочипов, включающий иммобилизацию гидрогелей на подложке из перечисленных выше немодифицированных полимерных материалов и/или их смесей. Указанные полимерные материалы и/или их смеси можно также использовать в комбинации с наполнителями. В качестве наполнителей можно использовать неорганические наполнители, включая асбест, стекловолокно и/или тальк.

Для формирования геля может использоваться термически, химически или фотоинициируемая полимеризация. В случае фотоинициируемой полимеризации может использоваться фотоинициируемая полимеризация в ультрафиолетовой или видимой областях.

Для формирования геля можно использовать композиции, включающие мономер, сшивающий агент и растворитель, которые могут дополнительно содержать иммобилизуемое биологически активное соединение и/или флуоресцентный краситель, например Texas Red, Fluorescein, Су 5, Су 3, BODIPY. Указанные композиции также могут дополнительно содержать инициатор или промотор полимеризации.

Для формирования геля также можно использовать композиции, включающие реакционноспособный олигомер и растворитель. Указанные композиции могут дополнительно содержать иммобилизуемое биологически активное соединение и/или флуоресцентный краситель, например Texas Red, Fluorescein, Су 5, Су 3, BODIPY. В одном из вариантов указанный реакционноспособный олигомер также может дополнительно содержать в своей структуре биологически активное соединение. Указанные композиции также могут дополнительно содержать инициатор или промотор полимеризации.

Для переноса указанных композиций на полимерную подложку можно использовать микродиспенсер, например микродиспенсер стержневого (игольчатого), перьевого или струйного типа.

Подложки с перенесенными микрокаплями композиций можно поместить в герметичный контейнер с бескислородной атмосферой. Бескислородную атмосферу можно создать с помощью азота, аргона, углекислого газа.

Иммобилизация биологически активных соединений в геле осуществляется в момент формирования гидрогеля.

Подложки из полимерных материалов перед изготовлением биочипа не подвергаются какой-либо химической модификации.

После полимеризации биочипы можно отмыть в буферных растворах, а затем в дистиллированной воде.

Качество получаемых биочипов можно контролировать по диаметрам элементов биочипа и/или по флуоресцентному сигналу красителя, иммобилизованного в каждой гелевой ячейке биочипа.

Четвертый аспект настоящего изобретения предусматривает способ иммобилизации гидрогелей на подложках из перечисленных выше немодифицированных полимерных материалов и/или их смесей без их предварительной химической модификации. Указанные полимерные материалы и/или их смеси можно также использовать в комбинации с наполнителями. В качестве наполнителей можно использовать неорганические наполнители, включая асбест, стекловолокно и/или тальк.

Для формирования геля может использоваться термически, химически или фотоинициируемая полимеризация. В случае фотоинициируемой полимеризации может использоваться фотоинициируемая полимеризация в ультрафиолетовой или видимой областях.

Подложки из полимерных материалов не подвергаются химической модификации поверхности.

Для формирования геля можно использовать композиции, включающие мономер, сшивающий агент и растворитель, которые могут дополнительно содержать иммобилизуемое биологически активное соединение и/или флуоресцентный краситель, например Texas Red, Fluorescein, Су 5, Су 3, BODIPY. Указанные композиции также могут дополнительно содержать инициатор или промотор полимеризации.

Для формирования геля также можно использовать композиции, включающие реакционноспособный олигомер и растворитель. Указанные композиции могут дополнительно содержать иммобилизуемое биологически активное соединение и/или флуоресцентный краситель, например Texas Red, Fluorescein, Су 5, Су 3, BODIPY. В одном из вариантов указанный реакционноспособный олигомер также может дополнительно содержать в своей структуре биологически активное соединение. Указанные композиции также могут дополнительно содержать инициатор или промотор полимеризации.

Гидрогели можно формировать на полимерных подложках в виде сплошного слоя различной толщины и конфигурации. Гидрогели можно также формировать на полимерных подложках в виде разделенных между собой ячеек.

Полимерную подложку после переноса на нее указанных композиций можно поместить в герметичный контейнер с бескислородной атмосферой. Бескислородную атмосферу можно создать с помощью азота, аргона, углекислого газа.

После полимеризации сформированный гель можно отмыть в буферных растворах, а затем в дистиллированной воде.

Описание чертежей

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами.

На фиг.1 приведены фотографии биочипов, полученных на полиметилметакрилате (ПММА) при термическом (A, D), химическом (В, Е) и фотоинициировании (С, F) полимеризации.

Композиции, приведенные в примере 1, раскапывались на пластину ПММА без его предварительной модификации, затем облучались в УФ-диапазоне (λ=350 нм). Пластины ПММА с иммобилизованными гелевыми элементами отмывались в буферном растворе, воде и высушивались. Для контроля качества элементов биочипа регистрировалось изображение биочипов в проходящем свете (А, В, С) и свете люминесценции (D, Е, F).

На фиг.2 приведены результаты гибридизации олигонуклеотида, меченного флуоресцентным красителем, на олигонуклеотидном биочипе, изготовленном на различных полимерных подложках и стекле.

Олигонуклеотиды 5'-AATTGGCTCAGCTGGCT-OCH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₄-NH₂ (A) и 5'-AATTGGCTCGGCTGGCT-OCH₂CH(CH₂OH)(CH₂)₄-NH₂ (В) иммобилизовались в гидрогеле в соответствии с примером 1-I на подложках из различных полимерных материалов: ПММА (1); ПЭТФ (2); ПА 6 (3); АБС (4); АБС+ПБТ (5); АХС (6); ЦОС (7); МАБС (8); ПЭТГ (9); АБС+ПА (10); ПФА (11); ПВХ (12); АБС+ПММА (13); ПБТ+ПК (14); АБС+ПК (15); АБС+ПВХ (16); ПБТ (17); ПК+ПЭТ (18); ПК+ПММА (19); стекле (20). Полученные биочипы гибридизовались в соответствии с примером 2 с олионуклеотидом, меченным флуоресцентным красителем 3'-TTAACCGAGTCGACCGA-Су5. Наибольший флуоресцентный сигнал после гибридизации наблюдался в тех ячейках биочипа, которые содержат иммобилизованный олигонуклеотид А, полностью комплементарный флуоресцентно меченному.

Подробное описание изобретения

В данном изобретении предлагается использовать ряд хорошо известных коммерчески доступных полимерных материалов для изготовления подложек гелевых биочипов без их предварительной модификации. Полимерные материалы выбираются из АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3-Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей.

Указанные полимерные материалы и/или их смеси можно также использовать в комбинации с наполнителями. В качестве наполнителей можно использовать неорганические наполнители, такие как асбест, стекловолокно и/или тальк.

Полимерные материалы предназначены для изготовления подложки без их предварительной модификации для химической иммобилизации на них гидрогелей в момент их формирования при термически, химически и фотохимически индуцируемой полимеризации. Указанные подложки предназначены для изготовления биочипов с иммобилизованными в геле биологически активными соединениями.

Биочип представляет собой сформированный на полимерной подложке слой геля, разделенный пустыми промежутками на ячейки, причем каждая из ячеек может содержать либо не содержать иммобилизованные биологически активные соединения, а биологически активные соединения, иммобилизованные в разных ячейках, могут различаться по своей природе и свойствам. Ячейки образуют регулярную одномерную или двумерную структуру (массив). Нанесение композиций с биологически активными соединениями на подложку может осуществляться различными приспособлениями, в том числе с помощью автоматического устройства (робота), снабженного одним или несколькими микродиспенсерами струйного или стержневого типа.

Иммобилизация олигонуклеотидов, белков и нуклеиновых кислот или других биологически активных соединений в геле может осуществляться

- в момент формирования геля при термически, химически и фотохимически инициированной полимеризации;

- после формированния геля на полимерной подложке.

Биологически активные соединения могут нести в своей структуре активную для иммобилизации группу, в том числе амино, сульфгидрильную, метакриламидную, акриламидную, акрилатную, метакрилатную, гидразидную и т.д., или использоваться в своем нативном виде, без предварительной модификации.

Каждая гелевая ячейка биочипа кроме иммобилизованного биологически активного соединения может содержать иммобилизованный флуоресцентный краситель, используемый для контроля качества биочипов и интерпретации результатов гибридизации на чипе.

Способ изготовления гелевых биочипов на предлагаемых полимерных подложках включает следующие этапы:

- подготовка композиций для формирования геля;

- перенос композиций на подложку;

- полимеризация композиций в бескислородной атмосфере;

- отмывка биочипа;

- проверка качества элементов биочипа.

При подготовке композиций все компоненты тщательно смешивают до образования гомогенного раствора и дегазируют.

Композиции включают следующие компоненты:

- мономер, составляющий основу формируемого геля, представляющий собой непредельное соединение;

В качестве мономера используются акриламид, метакриламид, N-[трис(гидроксиметил)метил]акриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат, метилметакрилат или другой мономер, содержащий кратные связи, при этом хотя бы одна кратная связь должна быть активна в реакции полимеризации;

- сшивающий агент, представляющий собой непредельное соединение, содержащее две и более кратных связей;

В качестве сшивающего агента могут использоваться N,N'-метиленбисакриламид, N,N'-метиленбисметакриламид, N,N'-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид, полиэтиленгликольдиакрилат по отдельности или в смеси или другой симметричный или несимметричный сшивающий агент, содержащий две и более кратных связей, активных в реакциях полимеризации;

- иммобилизуемое биологически активное соединение (необязательный компонент),

В качестве биологически активного соединения могут использоваться олигонуклеотид, нуклеиновая кислота, белок или другое значимое соединение;

- флуоресцентный краситель (необязательный компонент);

В качестве флуоресцентного красителя может использоваться Texas Red, Fluorescein, Су5, Су3, BODIPY и другие флуоресцентные красители.

- растворитель

В качестве растворителя может использоваться вода, глицерин, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, другие полярные и неполярные растворители, водные буферные растворы, растворы глицерина, растворы сахарозы, растворы полиспиртов, солевые и несолевые растворы полярных и неполярных растворителей;

- инициатор или промотор полимеризации (необязательный компонент)

В качестве инициатора или промотора могут использоваться соединения, способствующие фото или химическому инициированию полимеризации, растворимые в воде или органических средах, а именно персульфат аммония, персульфат калия, пероксид водорода, бензоилпероксид, азоизобутиронитрил (AIBN), соли двухвалентного железа, метиленовый синий, флуоресцеин, N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, 4-(N,N-диметиламино)пиридин, триэтиламин, ацетон или другой инициатор фотохимически или химически индуцируемой полимеризации;

При подготовке композиций вместо мономера и/или сшивающего агента могут использоваться реакционноспособные олигомеры, содержащие или не содержащие в своей структуре биологически активные соединения.

При проведении термически или фотоинициированной полимеризации инициатор или промотор полимеризации могут также отсутствовать.

Для переноса композиций на полимерную подложку используют роботы с микродиспенсерами разных типов, том числе снабженные микродиспенсерами стержневого (игольчатого), перьевого и струйного типов.

Для проведения полимеризации подложки с микрокаплями композиций помещают в герметичный контейнер с бескислородной атмосферой (азотом, аргоном, углекислым газом и т.д.).

Термически инициируемую полимеризацию в микрокаплях раствора осуществляют в бескислородной атмосфере при Т=60-80°С.

Для проведения химически инициированной полимеризации в микрокаплях растворов их выдерживают в бескислородной атмосфере Т=40-80°С в зависимости от выбранного инициатора.

Фотоинициирование процесса полимеризации в микрокаплях осуществляют УФ-облучением λ≥312 нм.

Полученные биочипы отмывают сначала в буферных растворах, а затем в дистиллированной воде и используют.

Качество получаемых биочипов определяется по относительной ошибке в диаметрах элементов биочипа или их объемов. Объем элементов биочипа пропорционален флуоресцентному сигналу красителя, иммобилизованного в каждой гелевой ячейке биочипа.

Способ иммобилизации на полимерных подложках гидрогелей в момент их формирования предполагает образование ковалентных связей между макромолекулами полимерных подложек и гидрогелями, образующимися на поверхности полимерных подложек в момент формирования геля при термически, химически и фотохимически инициируемой полимеризации.

Ковалентные связи между полимерной подложкой и гидрогелем образуются по одному из возможных путей:

a) участие кратных связей, имеющихся в структуре полимерных молекул, в реакции сополимеризации с мономерами, образующими гидрогель в реакции полимеризации;

b) участие фрагментов полимерных молекул подложки в реакциях передачи цепи в момент формирования геля при инициированной полимеризации;

c) модификация поверхности полимера бифункциональными реагентами, несущими в своей структуре непредельный фрагмент и входящими в состав композиций для формирования гидрогеля.

По пути а) могут реагировать полимеры или их композиции, полученные методом полимеризации, а именно: АБС, АБС+ПВХ, ПК+ПММА, АХС, ЦОС, МАБС, ПММА, ПВХ. Такое возможно благодаря природе реакции радикальной полимеризации с помощью которой получаются данные полимеры, а именно на стадии обрыва цепи при межмолекулярном диспропорционировании идет процесс образования концевых кратных связей [10].

[10] А.М.Шур, Высокомолекулярные соединения, М.: Высшая школа, 1981, с.100-104.

По пути а) могут реагировать также полимеры и композиции на их основе, полученные методом поликонденсации, а именно: ПБТ, ПБТ+ПК, ПК+ПЭТ, ПЭТ или ПЭТФ, ПЭТГ. Возникновение концевых кратных связей в макромолекулах данных полимеров обусловлено протеканием процессов внутримолекулярной дегидратации с участием спиртовых групп в условиях получения полимеров [11].

[11] Ю.С.Шабаров, Органическая химия, Т1 М.: Химия, 1996, с.193-203.

По пути b) могут реагировать все приведенные полимерные материалы [12], однако условия протекания реакции сильно зависит от природы полимера и его структуры.

[12] А.М.Шур, Высокомолекулярные соединения, М.: Высшая школа, 1981, с.104-113.

По пути с) могут реагировать поликонденсационные полимеры, содержащие концевые аминогруппы, а именно: АБС+ПА, ПА6, ПА6-3-Т, ПА11, ПА12, ПА46, ПА66, ПА610, ПА612, ПФА. Необходимым условием является наличие в композиции для создания гидрогеля бифункционального производного, активного в реакциях нуклеофильного присоединения или замещения, например N,N-метиленбисакриламида [13] или N-гидроксисукцинимидного эфира 6-метакрилоиламиногексановой кислоты соответственно.

[13] Общая органическая химия, Т.3, Азотсодержащие соединения, под. ред. Н.К.Кочеткова, М: Химия, 1982, с.61-62.

Далее сущность изобретения раскрывается на отдельных примерах, которые не должны рассматриваться экспертом как ограничивающие притязания изобретения.

Как видно из фиг.2, биочипы изготовленные на различных полимерных подложках, функционируют при гибридизации также, как и на стекле, широко используемом для изготовления биочипов, при этом природа поверхности полимерного материала существенно не влияет на результаты гибридизации.

Так как природа поверхности полимерной подложки не влияет на свойства геля, то очевидно, что биологически активных соединения, отличные от олигонуклеотидов, такие как нуклеиновые кислоты, белки, углеводы, липиды и т.д., способные иммобилизоваться в геле, также можно иммобилизовать согласно настоящему изобретению, причем они не утратят своих свойств при иммобилизации геля на полимерной подложке.

Источники и публикации, перечисленные в описании, являются неотъемлемой его частью, как если бы все их содержание было включено в описание.

Приведенные далее примеры являются предпочтительными, предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не должны стать основанием для ограничения объема притязаний заявителя. Специалист в данной области техники без труда найдет возможности иных воплощений изобретения, безусловно, подпадающих под притязания заявителя, отраженные в формуле изобретения, приводимой ниже.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Изготовление биочипа на полимерной подложке с иммобилизованными в геле олигонуклеотидами

I. Фотоинициированная полимеризация

К смеси 2-гидроксиэтилметакрилата (m=0.030 г), N,N'-метиленбисакриламида (m=0.007 г) и 2-акрилоилоксиэтилметакрилата (m=0.003 г) приливают раствор N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамина в деионизованной воде (V=210 μl, 1:1), содержащий краситель - Texas Red (n=40 нмоль), перемешивают до полного растворения компонентов и приливают глицерин (V=650 μл). В полученный раствор добавляют раствор олигонуклеотида в воде (v=100 μл, С=2 нмоль/μл). Смесь тщательно перемешивают. Композицию наносят на полимерную подложку с помощью робота "QArray" ("Genetix", UK). Полученный массив капель облучают УФ-светом (λ=350 нм, 60 мин, Т=55°С) в среде сухого аргона, отмывают в фосфатном буфере (0.1 М, t=15 мин, Т=30°С), затем в воде (t=15 мин, Т=60°С) и высушивают на воздухе (Т=25°С) в безпылевой атмосфере. С помощью специального оборудования, снабженного ПЗС камерой и ЭВМ, получают фотографии биочипов в проходящем видимом свете (С) и свете флуоресценции. Качество элементов биочипа определяют с помощью специального программного обеспечения по относительной ошибке диаметров или флуоресцентных сигналов всех элементов биочипа. На фиг.1 (C, F) представлены фотографии биочипа, полученного по данной методике на полиметилметакрилате (ПММА) в проходящем свете и свете флуоресценции.

II. Термически инициированная полимеризация

К смеси 2-гидроксиэтилметакрилата (m=0.075 г), N,N'-метиленбисакриламида (m=0.0175 г) и 2-акрилоилоксиэтилметакрилата (m=0.0075 г) приливают раствор N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамина в деионизованной воде (V=200 μl, 1:1), содержащий краситель-Texas Red (n=40 нмоль), перемешивают до полного растворения компонентов и приливают глицерин (V=600 μл). В полученный раствор добавляют раствор олигонуклеотида в воде (v=100 μл, С=2 нмоль/μл). Смесь тщательно перемешивают. Композицию наносят на полимерную подложку с помощью робота "QArray" ("Genetix", UK). Полученный массив капель выдерживают при температуре 80°С 60 минут в среде сухого аргона, отмывают в фосфатном буфере (0.1 М, t=15 мин, Т=30°С), затем в воде (t=15 мин, Т=60°С) и высушивают на воздухе (Т=25°С) в безпылевой атмосфере. С помощью специального оборудования, снабженного ПЗС камерой и ЭВМ, получают фотографии биочипов в проходящем видимом свете и свете флуоресценции. Качество элементов биочипа определяют с помощью специального программного обеспечения по относительной ошибке диаметров или флуоресцентных сигналов всех элементов биочипа. На фиг.1 (A, D) представлены фотографии биочипа, полученного по данной методике на полиметилметакрилате (ПММА) в проходящем свете и свете флуоресценции.

III. Химически инициированная полимеризация

К смеси 2-гидроксиэтилметакрилата (m=0.075 г), N,N'-метиленбисакриламида (m=0.0175 г) и 2-акрилоилоксиэтилметакрилата (m=0.0075 г) приливают фосфатный буферный раствор (рН 11.6, С=0.05 М, V=190 μл), содержащий краситель - Texas Red (n=40 нмоль) и персульфат аммония (m=0.010 г), перемешивают до полного растворения компонентов и приливают глицерин (V=600 μл). В полученный раствор добавляют раствор олигонуклеотида в воде (v=100 μл, С=2 нмоль/μл). Смесь тщательно перемешивают. Композицию наносят на полимерную подложку с помощью робота "QArray" ("Genetix", UK). Полученный массив капель помещают в герметичную камеру, насыщенную парами N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамина в атмосфере аргона и выдерживают при температуре 80°С 60 минут, отмывают в фосфатном буфере (0.1 М, t=15 мин, Т=30°С), затем в воде (t=15 мин, Т=60°С) и высушивают на воздухе (Т=25°С) в безпылевой атмосфере. С помощью специального оборудования, снабженного ПЗС камерой и ЭВМ, получают фотографии биочипов в проходящем видимом свете и свете флуоресценции. Качество элементов биочипа определяют с помощью специального программного обеспечения по относительной ошибке диаметров или флуоресцентных сигналов всех элементов биочипа. На фиг.1 (В, Е) представлены фотографии биочипа, полученного по данной методике на полиметилметакрилате (ПММА) в проходящем свете и свете флуоресценции.

Как следует из результатов, приведенных на фиг.1, термически, химически и фотоинициированная полимеризация обеспечивают одинаковую степень иммобилизации гидрогелей на подложке или, другими словами, одинаковое качество биочипов.

Пример 2. Гибридизация на олигонуклеотидных биочипах

Раствор (1 М NaCl, 1 μМ ЭДТА, 1% Tween 20,5 мМ фосфатный буфер, рН 7.0, V=35 μл), содержащий флуоресцентно меченный олигонуклеотид (С=10 mМ), гибридизуют (τ=12 ч, Т=37°С) с олигонуклеотидным биочипом, изготовленным в соответствии с примером 1-I. Биочип отмывают раствором для гибридизации, не содержащим флуоресцентно меченного олигонуклеотида, и высушивают. Флуоресцентный сигнал регистрируют с помощью флуоресцентного микроскопа, снабженного ПЗС камерой и ЭВМ. Результаты гибридизации приведены на фиг.2.

Как следует из результатов, приведенных на фиг.2, наибольший флуоресцентный сигнал после гибридизации наблюдается в тех ячейках биочипа, которые содержат иммобилизованный олигонуклеотид А, полностью комплиментарный флуоресцентно меченному олигонуклеотиду, и не зависит от природы полимерного материала, использованного для изготовления подложки.

Промышленная применимость

Способ изготовления биочипов по настоящему изобретению предназначен для изготовления биочипов.

Биочипы согласно изобретению

- могут использоваться как самостоятельные изделия для проведения научных исследований по изучению различного рода взаимодействий между биологически активными соединениями, в том числе олигонуклеотид-олигонуклеотид, олигонуклеотид-нуклеиновая кислота, белок-белок, белок-нуклеиновая кислота и т.д.;

- могут входить в состав различных медицинских диагностикумов для быстрого обнаружения и идентификации возбудителя и/или заболевания.

Способ иммобилизации гидрогелей на полимерных подложках

- может использоваться для изготовления биочипов различного назначения;

- может использоваться для изготовления полимерных изделий различного назначения, поверхность которых необходимо покрыть слоем гидрогеля, например всевозможные электроды и датчики, рабочая поверхность которых покрыта гидрогелем с иммобилизованным биологически активным соединением.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биоорганической химии. Техническая задача - разработка способа изготовления гелевых биочипов с подложкой из немодифицированных полимерных материалов. Предложено применение ряда немодифицированных полимерных материалов, используемых без их предварительной модификации, для изготовления подложки биочипов, которая предназначена для иммобилизации на ее поверхности гидрогелей. Предложены также биочип, изготовленный на подложке из немодифицированных полимерных материалов, способ изготовления биочипа и способ иммобилизации гидрогелей на подложках из немодифицированных полимерных материалов. 4 н. и 51 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, предназначенной для иммобилизации на ее поверхности гидрогелей, согласно которому полимерные материалы выбирают из: АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3-Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей.2. Применение по п.1, отличающееся тем, что полимерные материалы и/или их смеси используются в комбинации с наполнителями.3. Применение по п.2, отличающееся тем, что наполнители представляют собой неорганические наполнители, включая асбест, стекловолокно и/или тальк.4. Биочип, изготовленный на подложке из предварительно немодифицированных полимерных материалов, которые выбирают из:

АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3-Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей с иммобилизованным на поверхности подложки слоем геля.

АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3 -Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей, причем полимерные материалы используют без предварительной химической модификации.

АБС (сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола), АБС+ПА (смесь АБС и полиамида), АБС+ПБТ (смесь АБС и полибутилентерефталата), АБС+ПК (смесь АБС и поликарбоната), АБС+ПММА (смесь АБС и полиметилметакрилата), АБС+ПВХ (смесь АБС и поливинилхлорида), АХС (сополимер акрилонитрила, хлорированного этилена и стирола), ЦОС (циклоолефиновые сополимеры), МАБС (сополимер метилметакрилата, акрилонитрила, бутадиена и стирола), ПА 6 (полиамид 6), ПА6-3-Т (полиамид 6-3-Т), ПА 11 (полиамид 11), ПА 12 (полиамид 12), ПА 46 (полиамид 46), ПА 66 (полиамид 66), ПА 610 (полиамид 610), ПА 612 (полиамид 612), ПБТ (полибутилентерефталат), ПБТ+ПК (смесь полибутилентерефталата и поликарбоната), ПК+ПЭТ (смесь поликарбоната и полиэтилентерефталата), ПК+ПММА (смесь поликарбоната и полиметилметакрилата), ПЭТ или ПЭТФ (полиэтилентерефталат), ПЭТГ (полиэтилентерефталатгликоль), ПММА (полиметилметакрилат), ПФА (полифталамид, полиамид высокотемпературный), ПВХ (поливинилхлорид) и/или их смесей,

причем полимерные материалы используют без предварительной химической модификации.