Область техники
Изобретение относится к аналитической химии, точнее к устройству и технологии изготовления биочипов на основе монолитного макропористого полимера, предназначенных для анализа белков (протеинов).
Изобретение может найти применение в аналитической химии, молекулярной биологии, биотехнологии, фармакологии, медицине.
Уровень техники
Биочипы на основе монолитного макропористого полимера для анализа белков (протеинов) неизвестны.
Известны полимеры на основе глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА), полученные авторами предлагаемого изобретения для изготовления макропористых мембран, состоящих целиком из полимера (без подложек), и монолитных хроматографических колонок для ВЭМХ в виде дисков, трубок, стержней (патенты RU 1725457, 1772108, а также Svec F., Frechet J. M.J.Anal. Chem. 1992. №64. Р.820-822). Однако получение с их помощью биочипов не предполагалось и неочевидно.
Известны биочипы на основе полиакриламидного гидрогеля, способные к проведению на них полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в которых в качестве иммобилизованных биологически значимых (макро)молекул используют синтетические олигонуклеотиды (зонды). Известные биочипы разработаны школой проф. А.Д.Мирзабекова и предназначены для секвенирования и картирования ДНК, анализа белков, детектирования мутаций и целого ряда медицинских приложений (RU - 2206575, 2175972, 2157385, 2157377, WO - 03033539).
Наиболее близким к заявляемому изобретению является изобретение, описанное в патенте RU 2206575, МПК 7 С07К 17/08, С07Н 21/00, C08F 220/56, C12Q 1/68, дата приоритета 2001.07.25, дата публикации 2003.06.20, патентообладатель Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (Москва) "Композиция для иммобилизации биологических макромолекул в гидрогелях, способ приготовления композиции, биочип, способ проведения ПЦР на биочипе". Известная композиция для полимеризационной иммобилизации биологически значимых соединений в гидрогелях при формировании биочипов включает:
- мономер для фотоинициируемой сополимеризации, составляющий основу формирующегося геля и представляющий собой производное непредельной карбоновой кислоты (акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат и др. или их смеси);
- сшивающий агент, представляющий собой водорастворимое производное непредельной карбоновой кислоты (например, N,N'метиленбисакриламид).
Общее содержание мономера и сшивающего агента составляет 3-40%, а их соотношение в композиции 97:3-60:40;
- модифицированное биологически значимое соединение (олигонуклеотиды, белки и др.) в количестве от 0,0001 до 10%, содержащее непредельную группу акриламидного типа, обладающую высоким сродством к другим компонентам композиции;
- среду для проведения фотоинициируемой полимеризации (вода:глицерин=60:40, или вода с добавками сахарозы, поливинилового спирта, N,N-диметилформамида, N,N-диметилсульфоксида).
Известным изобретением предлагаются также способы получения модифицированных биологически значимых соединений, суть которых сводится к введению в их молекулы непредельных связей для увеличения сродства этих соединений к мономеру и сшивающему агенту и обеспечения встраивания биологических соединений в полимерную сетку гидрогеля.
Состав предлагаемой композиции позволяет объединить стадии формирования массива ячеек и иммобилизации молекул-зондов (праймеров) в одну при проведении фото- или химически инициируемой сополимеризации. Тем самым удается ввести в гель большее количество зондов, чем при двустадийной технологии (так как иммобилизовать в сформировавшийся гель труднее). Это улучшает качество анализов.
Известное изобретение предлагает биочип, включающий подложку (пористое стекло CPG, препаратное стекло, кварцевое стекло и т.д.), предварительно последовательно очищенную обработкой концентрированными щелочью, кислотой и модифицированную кремнийорганическим соединением (например, 3-триметоксисилилпропилметакрилатом) для ковалентного связывания элементов биочипа с поверхностью, и дискретные гелевые элементы, образующиеся в результате фотоиндуцируемой сополимеризации компонентов заявленной композиции на поверхности подложки.
Известное изобретение также предлагает способ изготовления биочипа, заключающийся в том, что заявленную композицию наносят при помощи робота в виде микрокапель на обработанную предварительно вышеуказанным кремнийорганическим соединением подложку, выдерживают не менее 2 ч и полимеризуют в бескислородной инертной атмосфере под действием УФ-излучения (λ=312 нм), при которой не происходит деструкции биологических молекул, полученный биочип отмывают от непрореагировавших компонентов и сушат при комнатной температуре.
Приготовленные известные композиции хранятся при - 21°С не менее 1 года. Модификация поверхности подложки позволяет получать биочипы, которые можно использовать в интервале рН от 2 до 12 и интервале температур от -10 до +100°С.
Известный биочип используют для проведения ПЦР, для исследования взаимодействия в системах белок-белок, белок-ДНК, ДНК-олигонуклеотид. Возможно осуществление ПЦР внутри дискретных гелевых элементов, разделенных гидрофобной жидкостью (минеральным маслом), так что каждый гелевый элемент выступает в роли микропробирки.
Несмотря на признанные преимущества известного биочипа и автоматизированного способа его получения по сравнению со всеми известными аналогами - биочипами для анализа белков (протеинов) (Cortese J.D.Scientist. 2000. №14. Р.25-28), он обладает рядом объективных недостатков, связанных, в первую очередь, с природой гелевых структур.
Известный биочип включает в качестве рабочего слоя гидрогель. Структура гидрогеля по своей природе неоднородна и трудно воспроизводима. Понятие "пористости" гидрогеля, используемое авторами известного изобретения, условно. При эксплуатации известных биочипов речь идет о диффузии исследуемых веществ в гелевую набухшую структуру (сетку), степень упорядоченности которой и удельную рабочую поверхность контролировать невозможно. По этой причине в формуле известного изобретения отсутствуют характеристики пор: размер пор и общая пористость. Неконтролируемость упорядоченности структуры и удельной рабочей поверхности геля требует для гарантируемого качества анализов на известном биочипе вводить гораздо большее количество однородных молекул-зондов в гель на единицу объема, чем если бы это был монолит. Химическая структура гидрогеля представляет собой акриламидную основу с иммобилизованными биологическими макромолекулами в качестве зондов. При этом для иммобилизации биологические макромолекулы подвергаются предварительной модификации - введению непредельных связей. Как утверждают авторы известного изобретения, это существенным образом усложняет процесс изготовления биочипов. Использование только акриламидных гелей ограничивает спектр получаемых гидрогелей по структуре и "пористости", так как варьирование морфологической структуры геля возможно в очень узких пределах. Для введения зондов потребовалась специальная модификация биологических молекул. Толщина гелевого слоя в известном изобретении не указана. По-видимому, возможности варьирования толщины слоя существенно ограничены растекаемостью геля при превышении определенного объема.
В качестве подложки в известном изобретении использовано активированное стекло, то есть стекло, поверхность которого предварительно обработана кремнийорганическим соединением для ковалентного связывания гелевых ячеек, располагающихся на этой поверхности. Активация стекла - дополнительная операция при получении биочипа. Кроме того, использование только одного вида подложек из всего известного разнообразия сужает возможности биочипов.
Известные биочипы одноразовые.
Указанные выше недостатки известного изобретения свидетельствуют о том, что проблема улучшения качества биочипов остается актуальной.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является создание биочипа для анализа белков (протеинов) с заранее заданным контролируемым и воспроизводимым качеством и пригодного для многоразового использования.
Эта задача решается заявляемой группой из двух изобретений - биочипом для анализа белков (протеинов) и способом его изготовления.
Заявляемое устройство - биочип - характеризуется следующей совокупностью существенных признаков.
1. Биочип включает подложку с нанесенным на нее полимерным рабочим слоем, образованным из сополимера на основе производных метакриловой кислоты с иммобилизованными на нем биологическими макромолекулами - зондами. При этом подложка выполнена из активированного или неактивированного стекла, металла или полимерного материала, а рабочий слой состоит из макропористого монолитного сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата при их массовом соотношении (50:70)-(50:30) с иммобилизованными на нем афинными биологическими зондами, при этом соотношение зонд - сополимер составляет для белка - 2-10 мг/г сополимера, для пептида - 1-20 мг/г сополимера и для олигонуклеотида, нуклеиновой кислоты - 0,5-3 мг/г сополимера, с радиусом пор 0,4-1,5 мкм, имеет толщину 50-700 мкм и выполнен в виде сплошного или дискретного микроячеистого слоя.
2. Подложка указанного биочипа выполнена из алюминиевой фольги или нержавеющей стали.
3. Подложка указанного биочипа выполнена из лавсана, полипропилена, политетрафторэтилена.
4. Микроячейки указанного биочипа одинаковы или различаются по природе зондов и/или толщине рабочего слоя и/или радиусу пор.
5. В случае сплошного рабочего слоя указанный биочип содержит одинаковые или различные по природе зонды.
6. Подложка указанного биочипа связана с рабочим слоем ковалентно или адгезионно.
Получены биочипы с улучшенными качественными характеристиками: с гарантированной заданной структурой монолитного слоя, с хорошей воспроизводимостью характеристик биочипа, с контролируемым количеством зондов, хорошей механической прочностью, химической стойкостью, с расширенными возможностями анализов. Преимущество биочипа на основе монолитного макропористого полимера: морфологическая структура монолитного слоя соответствует классическому понятию пористости. Размер пор, распределение размеров пор, удельная поверхность монолитного слоя однородна, контролируема, воспроизводима, может быть стандартизована. Соотношение растворителей-порогенов и мономеров, выбор инициатора и времени полимеризации при получении монолитного слоя позволяет варьировать морфологию монолитного слоя под определенные задачи последующих операций с помощью биочипа.
Химическая структура заявляемых биочипов совершенно отличается от биочипа-прототипа: монолитные слои представляют собой полученный в результате свободно-радикальной полимеризации с использованием фото- и термического инициирования сополимер глицидилметакрилата и этиленгликольметакрилата. Введение макромолекул белка в качестве афинных зондов осуществлено путем проведения реакций ковалентного связывания с макропористым монолитом. При этом используют нативные эпоксидные группы сополимера, а также предварительную активацию сополимера введением амино-, гидроксильных, альдегидных и ангидридных групп. Введение пептидных зондов осуществляют ковалентной иммобилизацией пептида (аналогично белку) или прямым синтезом пептида на поверхности макропористого монолита.
В заявляемом изобретении толщина монолитного слоя колеблется от 50 до 700 мкм. Толщина монолитного слоя может варьироваться с целью получения оптимальной адсорбционной емкости белка.
В заявляемом изобретении в качестве подложки может быть использовано как активированное стекло, так и алюминиевая фольга, нержавеющая сталь, лавсан, полипропилен, политетрафторэтилен. При этом во всех случаях, кроме активированного стекла, монолитный полимерный слой прикрепляется к инертной поверхности подложки за счет адгезии.
Разнообразие подложек расширяет возможности биочипов. При любом варианте подложки гарантируется механическая прочность монолитного слоя, устойчивость в различных водных и органических средах.
Известные биочипы одноразовые, а заявляемые биочипы многоразовые, их можно регенерировать, помещая в растворы кислот, щелочей или детергентов и использовать повторно многократно. Это позволяет использовать предлагаемые биочипы, в отличие от аналогов, в мониторинговых медицинских исследованиях, где принципиальна калибровка на одном и том же биочипе.
Заявляемые биочипы устойчивы при рН 1-14 и температуре от -20 до +200°С. Их можно стерилизовать. Биочипы можно хранить в течение не менее 2-х лет в обычном холодильнике.
Заявляемые биочипы позволяют проводить более разнообразные анализы и иметь более широкие медицинские приложения, чем известный аналог. Это объясняется прямой иммобилизацией биологического зонда в мягких условиях.
Предлагаемый биочип отличается от известного использованием разнообразных подложек, химическим составом, морфологией, характеристиками пористости и размерами рабочего слоя (пористый твердый монолит, фиксируемый размер пор, определяемая толщина слоя) и контролируемым количеством и способом распределения введенных в него зондов.
Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну устройства - биочипа,
Только совокупность существенных признаков заявляемого биочипа позволяет достичь указанного технического результата. Совершенно неожиданным явился факт, что удастся создать биочип для анализа белков (протеинов) на монолитной основе с регулируемым распределением зондов, причем с контролируемыми характеристиками. Следует подчеркнуть, что до сих пор основным направлением в области разработки биочипов по-прежнему остается совершенствование гелевого рабочего слоя. При этом можно утверждать, что проблема преодоления неоднородности и плохой воспроизводимости свойств гелевого рабочего слоя является в настоящее время критичной для производства биочипов (RU 2206575).
Заявляемый способ изготовления биочипа обладает следующей совокупностью существенных признаков.
1. Способ включает подготовку подложки, формирование рабочего слоя путем сополимеризации мономеров на основе производных метакриловой кислоты, иммобилизации на образующемся сополимере биологических макромолекул - зондов, отмывку, сушку полученного биочипа. При этом для формирования рабочего слоя проводят радикальную сополимеризацию глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата при массовом соотношении мономеров (50:70)-(50:30) с использованием фото- или термического инициирования в среде порогенного растворителя, при соотношении суммы объемов мономеров к объему растворителя 6:9, при концентрации инициатора в реакционной среде 0,2-1,0 мас.%, указанную реакционную смесь наносят на подложку сплошным слоем или дискретно, при этом в результате сополимеризации на подложке образуется макропористый монолитный сплошной или дискретный микроячеистый слой, а затем проводят в порах указанного слоя ковалентную иммобилизацию биологических макромолекул или их прямой синтез на образующемся сополимере с использованием его нативных или предварительно модифицированных эпоксидных групп с получением биологического афинного зонда, при этом зонд вводят в сополимер в количестве: для белка - 2-10 мг/г сополимера, для пептида - 1-20 мг/г сополимера и для олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты - 0,5-3 мг/г сополимера.
2. В качестве порогенного растворителя используют циклогексанол или смесь циклогексанола и додеканола в соотношении (9:1)-(7:3).
3. Реакционную смесь для сополимеризации наносят на подложку при помощи автоматического устройства, снабженного одним или несколькими микродиспенсерами, или с помощью шаблона.
4. При формировании дискретного микроячеистого рабочего слоя в разных ячейках получают макропористый монолитный слой одинаковой или разной толщины и/или пористости и иммобилизуют одинаковые или различные по природе зонды.
5. В качестве фотоинициатора используют бензофенон или 2-гидрокси-2-метилпропиофенон.
6. Фотоинициирование осуществляют с помощью ртутной лампы.
7. Термическое инициирование проводят при температуре 55-70°С.
8. В качестве термоинициатора используют 2,2'-азо-бис-изобутиронитрил.
9. Реакционную смесь при фотоинициировании облучают через «маску» и последующую иммобилизацию биологических макромолекул осуществляют с использованием этой же «маски».
10. Для осуществления прямого синтеза биологических макромолекул на образующемся сополимере проводят предварительную модифицикацию его эпоксидных групп с преобразованием их в аминные, или гидроксильные, или альдегидные, или ангидридные группы.
11. Ковалентную иммобилизацию биологических макромолекул проводят при рН 5-10 и при концентрации указанных макромолекул 1-10 мг/мл. Совокупность существенных признаков заявляемого способа позволяет достичь следующего технического результата: упрощения и удешевления способа, обеспечения контроля над операциями и морфологией конечного продукта, получения биочипа лучшего качества, чем у аналогов.
Технология синтеза оригинальной химической структуры заявляемого биочипа значительно проще, чем у известного аналога, и в то же время позволяет получить воспроизводимые результаты и большее количество вариаций пористости рабочего слоя. Предсказуемость процесса иммобилизации белка обеспечивает качество биочипа и меньший расход дорогостоящего биологического материала, так называемую "адресную иммобилизацию" на поверхности пор, а не в массе геля. Наличие разнообразных функциональных групп в сополимере позволяет существенно разнообразить набор иммобилизованных зондов по сравнению с известным аналогом.
Предлагаемый способ изготовления биочипа отличается от известного использованием разнообразных подложек, химическим составом реакционной смеси и условиями приготовления рабочего слоя и прямой иммобилизацией зондов, концентрацией зондов.
Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну способа.
Только совокупность существенных признаков заявляемого способа изготовления биочипа для анализа белков (протеинов) позволяет достичь указанного технического результата. Как было указано выше, совершенно неочевидным явилась сама возможность получения монолитного биочипа, к тому же с регулируемой и контролируемой технологией, которую проще автоматизировать, чем в случае с гелевым рабочим слоем.
В целом, группа заявляемых изобретений позволяет производить биочипы для анализа белков (протеинов) с заранее заданным контролируемым и воспроизводимым качеством и многоразового использования.
Далее приведены примеры осуществления изобретения.
Примеры
Реактивы:
Глицидилметакрилат (Fluka Chemie AG, Switzerland), этиленгликольдиметакрилат (Sigma-Aldrich Gmbh, Germany), циклогексанол (Sigma-Aldrich Gmbh, Germany), додеканол (Реахим, Россия), 2-гидрокси 2-диметилпропиофенон (Merck-Schuchard, Germany), бензофенон (Реахим, Россия), 2,2'-азо-бис-изобутиронитрил (Merck-Schuchard, Germany), краситель метиленовый синий (Sigma-Aldrich Gmbh, Germany), плавиковая кислота (Реахим, Россия), натрия гидроксид (Реахим, Россия), 3-(триметоксисилил)пропилметакрилат (Sigma-Aldrich Gmbh, Germany).
Методы определения характеристик биочипа
Для определения кривых распределения пор по размерам, а также средних радиусов пор использован метод интрузионной ртутной порозиметрии (порозиметр PASCAL 440, Thermoquest Italia, Rodano, Italy).
Гомогенность структуры монолитов исследована методом сканирующей электронной микроскопии, для чего использован прибор JSM-35CF с катодным напылением золота толщиной 50-100 А.
Толщину полимерного слоя определяли с помощью микрометра МК 0-25 мм (USSR ГОСТ 6507-60).
Источником УФ-излучения являлась ртутная лампа мощностью 125 Вт с широким спектром излучения и постоянной интенсивностью.
Подложки размером (25×75 мм), использованные для получения тонких монолитных макропористых слоев:
Стекло предметное с заточенным краем толщиной 1,16 мм; алюминиевая фольга толщиной 0,09 мм; лавсановые пластины толщиной 0,1 мм; полипропиленовые пластины толщиной 1,0-1,2 мм; политетрафторэтиленовые пластины толщиной 1,5 мм; пластины из нержавеющей стали толщиной 1,0-1,2 мм.
Методы подготовки подложек
1. Стекло
Метод (а): Предметные стекла кипятили в водном растворе ПАВ в течение 40 мин, затем тщательно промывали водой, высушивали при 120°С.
Метод (б): «Травление» плавиковой кислотой открытых поверхностей стекла, предварительно обработанного парафином. Варьируя время травления получали ячейки различной глубины (0,1-0,9 мм). После травления стекла промывали горячей водой, после высушивания - петролейным эфиром. Затем стекла кипятили в течение 1 ч в водном растворе гидроксида натрия (0,1 М), тщательно промывали водой и высушивали при 120°С.
Метод (в): «Травление» плавиковой кислотой открытых поверхностей стекла, предварительно обработанного парафином. Варьируя время травления получали ячейки различной глубины (0,2-0,9 мм). После травления стекла промывали горячей водой, после высушивания - петролейным эфиром. Затем стекла кипятили в течение 1 ч в водном растворе гидроксида натрия (0,1 М), тщательно промывали водой и высушивали при 120°С.
Модификация поверхности ячейки для введения акрилатных функциональных групп путем силанизации 3-(триметоксисилил)-пропилметакрилатом:
Кипячение предварительно подготовленных стекол в растворе 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата в толуольном (0,5 г на 60 мл абсолютного толуола) в течение 3 ч. Затем стекла промывали последовательно абсолютным толуолом, ацетоном, этиловым спиртом и высушивали при 60°С.
В полученные на стекле ячейки наносили раствор 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата в абсолютном толуоле (5%, 10%, 15% 50%), выдерживали в темноте в течение 24 ч. Затем стекла промывали последовательно абсолютным толуолом, ацетоном, этиловым спиртом и высушивали при 40°С.
2. Алюминиевая фольга
Из алюминиевой фольги толщиной 0,01 мм, предварительно обработанной с одной стороны в кислой среде, формировали путем штамповки ячейки различного диаметра (2-5 мм) и глубины (0,1-1 мм). Обработанная сторона на внутренней поверхности ячейки. Полученные формочки промывали этиловым спиртом и высушивали при 120°С.
3. Полимерные подложки не требуют специальной подготовки кроме обеспыливания.
Дизайн
1. Стеклянные ячейки
Путем предварительной обработки стекла были получены ячейки различного дизайна: квадратные (а), круглые (б), а также стеклянные подложки с несколькими круглыми ячейками (в):
2. Алюминиевые ячейки подходящего размера получали путем формования.
Получение тонких монолитных слоев путем сополимеризации глицидил-метакрилата и этиленгликольдиметакрилата
Для приготовления тонких макропористых монолитов методом фотоинициируемой полимеризации использовали в качестве мономеров глицидилметакрилат (ГМА) и этиленгликольдиметакрилат (ЭДМА), циклогексанол и додеканол - в качестве порогенных растворителей, а 2,2'-азо-бис-изобутиронитрил (АИБН), бензофенон (БФ) и 2-гидрокси-2-метилпропиофенон (Darocur-1173) - в качестве инициаторов.
Условия проведения сополимеризации
В модельных экспериментах использовалась смесь реагентов, состоящая из глицидилметакрилата (ГМА), этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА), при их массовом соотношении (50:70)-(50:30), циклогексанола или смеси порогенных растворителей циклогексанола и додеканола (количественное соотношение порогенов в данной доле органической фазы варьировалось) и инициатора. Соотношения используемых реагентов представлены ниже (см. Полимеризационные смеси).
Перед началом реакции смесь тщательно продували азотом для удаления кислорода, ингибирующего реакцию. Фотополимеризацию проводили при комнатной температуре (≈20°С). Инициаторы: БФ и Darocur-1173. Источником УФ излучения являлась ртутная лампа мощностью 125 Вт с широким спектром излучения и постоянной интенсивностью. После окончания полимеризации полимер промывали несколькими порциями этанола и высушивали при комнатной температуре до постоянной массы.
В случае термоинициирования использовался инициатор АИБН, температура - 55-70°С.
Полимеризационные смеси в модельных экспериментах:
1. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), Darocur - 1173 (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur - 1173.
2. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), Darocur - 1173 (0.8%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,050 г Darocur - 1173.
3. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), Darocur - 1173 (0.6%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,038 г Darocur - 1173.
4. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), Darocur - 1173 (0.4%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,025 г Darocur - 1173.
5. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), Darocur - 1173 (0.2%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,0125 г Darocur - 1173.
6. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), АИБН (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г АИБН
7. Порогены - циклогексанол: додеканол (10:0), БФ (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г БФ.
8. Порогены - циклогексанол: додеканол (9:1), БФ (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 8,1 мл циклогексанола, 0,9 мл додеканола 0,063 г БФ.
9. Порогены - циклогексанол: додеканол (7:3), БФ (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 6,3 мл циклогексанола, 2,7 мл додеканола, 0,063 г БФ.
10. Порогены - циклогексанол: додеканол (9:1), Darocur - 1173 (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 8,1 мл циклогексанола, 0,9 мл додеканола, 0,063 г Darocur-1173.
11. Порогены - циклогексанол: додеканол (7:3), Darocur - 1173 (1%). 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 6,3 мл циклогексанола, 2,7 мл додеканола, 0,063 г Darocur -1173.
Иммобилизация лигандов (протеинов, пептидов)
Введение макромолекул белка в качестве афинных зондов осуществлено путем проведения реакций ковалентного связывания с макропористым монолитом. При этом используют нативные эпоксидные группы сополимера, а также предварительную активацию сополимера введением амино-, гидроксильных, альдегидных и ангидридных групп. Введение пептидных зондов осуществлено ковалентной иммобилизацией пептида (аналогично белку) или прямым синтезом пептида на поверхности макропористого монолита.
Концентрация лиганда: 1-5 мг/мл; среда: рН 8,5-10 (0,1 М Na-боратный или Na-карбонатный буфер); время: 12-24 ч; объем нанесения (доза): 2-10 мкл/на ячейку.
Примеры изготовления конкретных биочипов
Пример 1. Изготовление биочипа с полимерным рабочим дискретным слоем толщиной 50 мкм на стеклянной подложке, с иммобилизованным белковым зондом.
Использована стеклянная подложка с круглыми ячейками.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, при массовом соотношении (60:40), 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173 (1 мас.%). В каждую стеклянную ячейку автоматически вносится 100 мкл полимеризационной смеси. Реакция полимеризации с помощью фотоинициирования проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, ковалентно связанный со стеклянной подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация аффинного белкового зонда: 2 мкл раствора белка с концентрацией 5 мг/мл (0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 8,5) внесены в каждую ячейку. Реакция проходит при температуре 20-35°С (термостат) в течение 20 ч. Удаление несвязанного белка осуществляется последовательным промыванием биочипа буферным раствором, дистиллированной водой и физиологическим раствором. Готовый биочип высушивается и может быть использован для анализов. Концентрация зонда составляла 3 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Контроль качества и применение биочипа см. ниже после описания примеров 1-23.
Пример 2. Изготовление биочипа с полимерным рабочим дискретным слоем толщиной 200 мкм на стеклянной подложке, с иммобилизованным пептидным зондом.
Использована стеклянная подложка с круглыми ячейками.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. В каждую предварительно подготовленную стеклянную ячейку вносится 100 мкл полимеризационной смеси. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, ковалентно связанный со стеклянной подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация аффинного пептидного зонда: 10 мкл раствора пептида с концентрацией 2 мг/мл (0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 8,5) внесены в каждую ячейку. Реакция проходит при температуре 20-35°С (термостат) в течение 12 ч. Удаление несвязанного пептида осуществляется последовательным промыванием биочипа буферным раствором, дистиллированной водой и физиологическим раствором. Готовый биочип высушивается и может быть использован для анализов. Концентрация зонда составляла 1 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 200 мкм.
Пример 3. Изготовление биочипа с монолитным полимерным рабочим дискретным слоем толщиной 700 мкм на стеклянной подложке, с иммобилизованным олигонуклеотидным зондом.
Использована стеклянная подложка с круглыми ячейками.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. В каждую предварительно подготовленную стеклянную ячейку вносится 100 мкл полимеризационной смеси. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, ковалентно связанный со стеклянной подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация олигонуклеотидного зонда: 5 мкл раствора олигонуклеотида с концентрацией 10 мг/мл (0,1 М Na-карбонатный буфер, рН 8,5) внесены в каждую ячейку. Реакция проходит при температуре 20-35°С (термостат) в течение 15 ч. Удаление несвязанного олигонуклеотида осуществляется последовательным промыванием биочипа буферным раствором, дистиллированной водой и физиологическим раствором. Готовый биочип высушивается и может быть использован для анализов. Концентрация зонда составляла 3 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 700 мкм.
Пример 4. Изготовление биочипа с монолитным полимерным рабочим дискретным слоем толщиной 200 мкм на алюминиевой подложке и с белковым зондом.
Подложка - алюминиевая фольга с ячейками.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. В каждую предварительно подготовленную ячейку на алюминиевой подложке наносится 100 мкл полимеризационной смеси. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, адгезионно связанный с алюминиевой подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация белкового зонда проводится аналогично примеру 1. Толщина рабочего слоя составляет 200 мкм.
Пример 5. Изготовление биочипа с монолитным полимерным рабочим сплошным слоем толщиной 200 мкм на лавсановой подложке и с белковым зондом.
Подложка из лавсана.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. На лавсановую подложку наносится полимеризационная смесь. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин либо всей поверхности, либо через «маску». Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, связанный адгезионно с лавсановой подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация аффинного белкового зонда проводится аналогично примеру 1, раствор белка вносится либо на всю поверхность монолитного слоя, либо в зоны, определенные «маской».
Толщина рабочего слоя: 200 мкм.
Пример 6. Изготовление биочипа с монолитным полимерным рабочим сплошным слоем толщиной 200 мкм на подложке из ПТФЭ и с белковым зондом.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. На подложку из ПТФЭ наносится полимеризационная смесь. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин через «маску». Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, связанный адгезионно с подложкой из ПТФЭ. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация белкового зонда проводится аналогично примеру 1, раствор белка вносится в зоны, определенные "маской". Толщина рабочего слоя: 200 мкм.
Пример 7. Изготовление биочипа с монолитным полимерным рабочим сплошным слоем толщиной 200 мкм на стальной подложке и с белковым зондом.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г Darocur-1173. На обезжиренную стальную подложку наносится полимеризационная смесь. Реакция полимеризации проводится при облучении ртутной лампой при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем полученный образец промывается спиртом и высушивается. Получен макропористый полимер, адгезионно связанный со стальной подложкой. Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Иммобилизация белкового зонда проводится аналогично примеру 1, раствор белка вносится в зоны, определенные маской. Толщина рабочего слоя: 200 мкм.
Пример 8. Проведен в условиях примера 1; в разные ячейки введены разные белковые зонды.
Пример 9. Введение зонда путем пептидного синтеза.
Проведен аналогично примеру 1.
Полимеризационная смесь: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 8,1 мл циклогексанола и 0,9 мл додеканола (соотношение 9:1), 0,063 г БФ.
Радиус пор в образованном монолитном полимерном слое: 0,4-1,5 мкм.
Твердофазный синтез пептидных лигандов (гексапептид) проводили последовательным присоединением Fmoc-защищенных аминокислот к модифицированным эпоксигруппам сополимера (например, к аминогруппам или гидроксильным группам). Концентрация зондов составляла 1 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 10. Проведен в условиях примера 1. Концентрация зонда составляла 2 мг/г сополимера.
Пример 11. Проведен в условиях примера 1. Концентрация зонда составляла 10 мг/г сополимера.
Пример 12. Проведен в условиях примера 2. Концентрация зонда составляла 20 мг/г сополимера.
Пример 13. Проведен в условиях примера 1. Концентрация зонда составляла 10 мг/г сополимера.
Пример 14. Проведен в условиях примера 1. Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Пример 15. Проведен в условиях примера 1, за исключением инициирования. Вместо фотоинициирования использовано термоинициирование при температуре 55°С. Состав реагентов, инициатора и растворителя: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г АИБН.
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 16. Проведен в условиях примера 15. Использовано термоинициирование при температуре 70°С. Состав реагентов, инициатора и растворителя: 3,6 мл ГМА, 2,4 мл ЭДМА, 9 мл циклогексанола, 0,063 г АИБН.
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 17. Проведен в условиях примера 1. Состав реагентов, инициатора и растворителя: 3 мл ГМА, 3 мл ЭДМА, при массовом соотношении (50:50), 7,2 мл циклогексанола, 0,048 г Darocur-1173.
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 18. Проведен в условиях примера 1. Состав реагентов, инициатора и растворителя: 4,2 мл ГМА, 1,8 мл ЭДМА, при массовом соотношении (70:30), 10,8 мл циклогексанола, 0,072 г Darocur-1173.
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 19. Проведен в условиях примера 1, облучение проводили через «маску».
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 20. Проведен в условиях примера 1, концентрация инициатора составляла 0,6 мас.% (0,038 г).
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 21. Проведен в условиях примера 1, концентрация инициатора составляла 0,2 мас.% (0,0125 г).
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 0,5 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 22. Проведен в условиях примера 9, использована смесь 8,1 мл циклогексанола и 0,9 мл додеканола (соотношение 7:3).
Радиус пор: 0,4-1,5 мкм.
Концентрация зонда составляла 1 мг/г сополимера.
Толщина рабочего слоя: 50 мкм.
Пример 23. Проведен в условиях примера 3, произведена иммобилизация зонда нуклеиновой кислоты.
Концентрация зонда составляла 3 мг/г сополимера. Толщина рабочего слоя: 700 мкм.
Контроль качества биочипов, полученных согласно примерам 1-23.
Контроль однородности структуры монолитного полимерного рабочего слоя в примерах 1-23 осуществляли с помощью электронной микроскопии и качественного чернильного теста, которые показали высокую степень однородности полимерных слоев, распределения зондов в слое, соответствие рассчитанной (теоретической) и полученной концентрации зондов.
Биочипы, изготовленные согласно примерам 1-23, были многократно воспроизведены с теми же качественными характеристиками, что связано с возможностями контроля за воспроизведением количественных параметров заявляемого способа и структуры монолитного слоя.
Применение биочипов, полученных согласно примерам 1-23.
Заявляемый биочип, изготовленный согласно примеру 1, был использован для проведения микроанализа белка в моче пациентов, потенциально страдающих сахарным диабетом (микродиагностика альбуминурии). На одном биочипе проводилась одновременно серия анализов для разных пациентов.
При этом один и тот же биочип был использован многократно после последовательного промывания 0,01 н соляной кислотой, водой и физиологическим раствором. Это, во-первых, существенно снижает стоимость клинического анализа. Во-вторых, эта особенность заявляемых биочипов позволяет проводить мониторинг состояния пациента.
Результаты анализа, проведенные на 10-15 биочипах, полученных согласно примеру 1, совпали. Это свидетельствует о высокой воспроизводимости качества заявляемых биочипов.
Время проведения анализа на одном биочипе составляет от 2 до 10 мин.
Высокая чувствительность определяется качеством монолитного материала. Аналогичные серии испытаний были проведены для биочипов, полученных согласно примерам 4-8,10,11,13-21. Полученные результаты аналогичны приведенным для биочипа, полученного по примеру 1.
Заявляемый биочип, изготовленный согласно примеру 2, был использован для количественного определения тканевого активатора пламиногена в крови пациентов, страдающих кардиологическими патологиями. Биочип показал хорошую воспроизводимость.
Аналогичные испытания были проведены для биочипов, полученных согласно примерам 9, 22. Биочипы показал хорошую воспроизводимость.
Заявляемый биочип, изготовленный согласно примеру 3, был использован для проведения исследования генетических нарушений. Биочип показал хорошую воспроизводимость.
Аналогичные серии испытаний были проведены для биочипа, полученного согласно примеру 23. Биочип показал хорошую воспроизводимость.
После хранения в холодильнике в течение 2-х лет заявляемые биочипы сохраняют свои качественные характеристики.
Реализация заявляемого изобретения не исчерпывается приведенными выше примерами.
Результаты, приведенные в примерах 1-23, свидетельствуют о том, что реализация заявляемого изобретения приводит по сравнению с известным прототипом к изготовлению биочипа с заранее заданным контролируемым и воспроизводимым качеством и многоразового использования.
Выход за рамки заявленных интервальных параметров снижает производительность процесса и приводит к невозможности реализации заявляемого изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЧИПА | 2010 |
|
RU2456314C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОПОРИСТОГО ПОЛИМЕРНОГО МАТЕРИАЛА МОНОЛИТНОГО ТИПА | 2009 |
|
RU2401693C1 |
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ В ГИДРОГЕЛЯХ, СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, БИОЧИП, СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР НА БИОЧИПЕ | 2001 |
|
RU2206575C2 |
| СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И БИОЧИП, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ПРИ ИХ РЕГИСТРАЦИИ | 2004 |
|
RU2283496C2 |
| ПРИМЕНЕНИЕ НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОДЛОЖКИ БИОЧИПОВ, БИОЧИП НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ, СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГИДРОГЕЛЕЙ НА НЕМОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛАХ | 2006 |
|
RU2309959C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОГЕЛЯ С ТЕРМООТЩЕПЛЯЕМЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ | 2022 |
|
RU2826936C2 |
| СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ | 2006 |
|
RU2338199C2 |
| НАНОДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТОВ | 2004 |
|
RU2315999C2 |
| НАНОБИОЧИП, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ БЕЛКОВ И БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗОНДОВОЙ МИКРОСКОПИИ | 2007 |
|
RU2362169C2 |
| Способ хроматографического разделения ионов | 1984 |
|
SU1237231A1 |
Группа изобретений относится к аналитической химии, точнее к устройству и технологии изготовления биочипов на основе монолитного макропористого полимера, предназначенных для анализа белков (протеинов). Изобретение может найти применение в аналитической химии, молекулярной биологии, биотехнологии, фармакологии, медицине. Биочип включает подложку с нанесенным на нее полимерным рабочим слоем, образованным из сополимера на основе производных метакриловой кислоты с иммобилизованными на нем биологическими макромолекулами - зондами, причем подложка выполнена из активированного или неактивированного стекла, металла или полимерного материала, а рабочий слой состоит из макропористого монолитного сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата при их массовом соотношении (50:70)-(50:30) с иммобилизованными на нем афинными биологическими зондами, при этом соотношение зонд - сополимер составляет для белка - 2-10 мг/г сополимера, для пептида - 1-20 мг/г сополимера и для олигонуклеотида, нуклеиновой кислоты - 0.5-3 мг/г сополимера, с радиусом пор 0,4-1,5 мкм, имеет толщину 50-700 мкм и выполнен в виде сплошного или дискретного микроячеистого слоя. Способ изготовления биочипа включает подготовку подложки, формирование рабочего слоя путем сополимеризации мономеров на основе производных метакриловой кислоты, иммобилизации на образующемся сополимере биологических макромолекул - зондов, отмывку, сушку полученного биочипа, причем для формирования рабочего слоя проводят радикальную сополимеризацию глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата при массовом соотношении мономеров (50:70)-(50:30) с использованием фото- или термического инициирования в среде порогенного растворителя, при соотношении суммы объемов мономеров к объему растворителя 6:9, при концентрации инициатора в реакционной среде 0,2-1,0 мас.%, указанную реакционную смесь наносят на подложку сплошным слоем или дискретно, при этом в результате сополимеризации на подложке образуется макропористый монолитный сплошной или дискретный микроячеистый слой, а затем проводят в порах указанного слоя ковалентную иммобилизацию биологических макромолекул или их прямой синтез на образующемся сополимере с использованием его нативных или модифицированных эпоксидных групп с получением биологического афинного зонда, при этом зонд вводят в сополимер в количестве: для белка - 2-10 мг/г сополимера, для пептида - 1-20 мг/г сополимера и для олигонуклеотида или нуклеиновой кислоты - 0,5-3 мг/г сополимера. Достигается возможность изготовления биочипа с заранее заданным контролируемым и воспроизводимым качеством и многоразового использования. 2 н. и 15 з.п. ф-лы.
