ШТАММ VIRUS HEPATITIS C, Д-1, ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 1999 года по МПК C12N7/00 A61K39/29 A61K39/42 G01N33/569 

Изобретение относится к медицинской вирусологии.

Неизвестны аналоги природных штаммов вируса гепатита C, используемые для приготовления диагностических и профилактических препаратов. С целью диагностики гепатита C в настоящее время используют коммерческие иммуноферментные тест-системы, в качестве антигена в которых используют рекомбинантные антигены вируса гепатита C(ВГС). До сих пор неизвестны вакцины против гепатита C на основе рекомбинантых белков.

Многочисленные попытки адаптировать ВГС, циркулирующий в крови инфицированных людей, к культурам клеток различного происхождения (в основном культуры клеток гепатоцеллюлярного и лимфобластоидного происхождения), и после адаптации выделить высокопродуктивный ВГС заканчивались неудачей из-за крайне ограниченной репликации вируса в этих культурах клеток, регистрируемой в течение непродолжительного времени лишь с помощью высоко чувствительного метода - полимеразной цепной реакции.

Целью изобретения является получение высокопродуктивного штамма вируса гепатита C, характеризующегося адаптацией к широкому спектру чувствительных к репродукции вируса культур клеток, высокой антигенной, вируснейтрализующей и протективной активностью, который может быть использован для приготовления диагностических препаратов и тест-систем, для получения высоко иммуногенных иммуноглобулинов человека против гепатита C и для создания культуральной очищенной инактивированной вакцины против гепатита C.

Получение оригинального авторского штамма вируса гепатита C, Д-1.

Штамм Virus hepatitis C выделен из первичных культур клеток головного мозга новорожденных мышей 2-3-дневного возраста, хронически инфицированных РНК ВГС, содержащейся в сыворотке крови больной хроническим гепатитом C, на 220-й день со дня заражения культур с последующим 3-кратным пассированием в культурах клеток фибробластов куриного эмбриона.

При идентификации штамма ВГС с помощью поликлональных антител к нему из сыворотки крови инфицированных людей, а также с использованием моноклональных антител к рекомбинантному нуклеокапсидному белку ВГС в реакции нейтрализации, методом непрямой иммунофлюоресценции, иммуноферментным анализом, а также в РНК вируса в полимеразной цепной реакции, установлена его принадлежность к вирусу гепатита C, циркулирующего в крови больных гепатитом C.

Штамм Д-1 вируса гепатита C хранится в лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Российской академии медицинских наук и в Государственной коллекции вирусов под регистрационным номером ГКВ-963. Штамм характеризуется стабильным проявлением биологических признаков.

Физико-химические признаки.

Индекс инвазивности - 9,5 lg TCD50. Индекс инактивации дезоксихолатом натрия - 5,2. Индекс термоинактивации -5,5 (при прогревании в течение 20 мин при 50^oC). При фильтрации вируссодержащей суспензии через миллипоровые фильтры размером 100 нм снижение инфекционного титра не наблюдали. Это свидетельствует о том, что штамм вируса имеет размеры до 100 нм и содержит в своем составе липопротеидную оболочку. На основании анализа первичной структуры РНК В ГС, морфогенетических и антигенных признаков выделенный штамм вируса отнесен к семейству Flaviviridae.

Культуральные свойства.

Взаимодействие штамма ВГС с культурами клеток различного происхождения (СПЭВ, ВНК-21, Vero, HAK и первичных культур фибробластов куриного эмбриона) происходит в форме острой и хронической инфекции, сопровождается деструкцией клеток, наступающей как правило на 7-й - 8-й дни после заражения с накоплением вируса в культуральной среде в титрах 10,-11,0 lg БОЕ или ТЦД 50/мл. Вирус индуцирует гетерогенные бляшки под агаровым покрытием. В культуральной жидкости инфицированных штаммом ВГС культур клеток накапливается РНК ВГС, выявляемая с помощью праймеров к области генов, кодирующих нуклеокапсидный белок и к 5'- нетранслируемой области. При роллерном культивировании инфицированных штаммом ВГС фибробластов куриного эмбриона в культуральной жидкости на 4-5-е дни после инфекции накапливаются гемагглютинины, агглютинирующие эритроциты гуся в титре до 1:128.

Антигенные свойства.

Антигенные свойства штамма ВГС изучены в реакции биологической нейтрализации, в ELISA, в РТГА, методом непрямой иммунофлюоресценции. В реакциях использовали поликлональные сыворотки больных различными формами гепатита C, моноклональные антитела к рекомбинантному нуклеокапсидному антигену ВГС и мышиные сыворотки к гомологичному штамму ВГС. В РТГА использовали боратно-солевые антигены этих штаммов (8-16 АЕ). Реакцию биологической нейтрализации ставили с разведениями сывороток или моноклонального иммуноглобулина 1:10 и с десятикратными разведениями штамма ВГС. Учет производили по индексу нейтрализации (отношение титров ВГС до и после нейтрализации антителами). По данным серологическим реакциям штамм ВГС имеет близкое антигенное родство с вариантами ВГС, циркулирующими в крови больных гепатитом C.

В табл. 1 представлены антигенные свойства штамма ВГС, выделенного после инфекции культур клеток различного происхождения. Показано, что штамм ВГС активно реагирует как с поликлональными сыворотками крови больных гепатитом C, так и с моноклональными иммуноглобулинами к нуклеокапсиду ВГС в различных серологических реакциях.

Биологические признаки.

Штамм вируса гепатита C является патогенным вариантом для новорожденных мышей линии Ва1в/с 2-3-дневного возраста и безпородных новорожденных мышей. После внутримозгового заражения штаммом ВГС у мышей на 10-12 дни наблюдали отставание в росте, кахексию, слабость, и животные погибали без выраженных симптомов менингоэнцефалита. Инкубационный период сокращался до 3-5 дней после 2-3-кратного пассирования вируса через мозг новорожденных животных. Показано, что в головном мозге инфицированных мышей накапливается вирусспецифическая РНК ВГС, определяемая методом полимеразной цепной реакции.

Иммуногенные свойства.

Высокие антигенные свойства штамма ВГС позволяют использовать его для получения высокоиммуногенных сывороток (кроличьих) или иммунных асцитических жидкостей. Показано, что однократное заражение мышей штаммом ВГС позволяет выявлять на 14-16 дни антитела к ВГС в сыворотке крови, активно реагирующие в РТГА и в ELISA (титры антител (1:40, 1:80 соответственно).

Диагностический препарат - антиген из штамма ВГС получают путем роллерного культивирования вируса в культурах фибробластов куриного эмбриона с последующим осаждением путем ультрацетрифугирования вируса в бляшку на пике проявления его гемагглютинирующей активности (4-5-е дни после заражения). В этом случае гемагглютинирующая активность ВГС из бляшки достигает титра 1: 512. Диагностическую иммунную асцитическую жидкость готовят по методу С.Я. Гайдамович с соавторами.

Профилактический препарат (культуральную инактивированную вакцину) готовят из культуральной жидкости, собранной из инфицированных штаммом вируса гепатита C культур фибробластов куриного эмбриона на 7-8 сутки после заражения при роллерном выращивании урожая вируса. Сбор культуральной жидкости инактивируют формальдегидом в концентрации 1:2000 в течение 60 дней при +4^oC.

Пример 1. Получение вируссодержащей культуральной жидкости, необходимой для производства культуральных профилактических препаратов на основе предлагаемого высокопродуктивного штамма вируса гепатита C. В качестве материала для исследований за отсутствием аналога предлагаем штамм вируса гепатита C, которым заражали монослой фибробластов 9-дневных куриных эмбрионов, выращенный роллерным способом. Для заражения используют 10 БОЕ ВГС на клетку и после часового контакта клетки трижды отмывают от неадсорбированного вируса, после чего вносят ростовую среду (гидролизат бычьего альбумина) и 0,1% альбумина человека и инкубируют на роллерной установке при 37^oC в течение 7 дней, когда в культурах будут отмечены отчетливые явления цитодеструктивного действия вируса. Полученные данные, характеризующие слив культуральной жидкости, пригодной для приготовления культуральной инактивированной вакцины против гепатита C, приведены в табл. 2.

Таким образом, высокопродуктивный штамм ВГС может быть использован для производства профилактических препаратов (культуральной инактивированной вакцины против гепатита C).

Пример 2. Выявление вируснейтрализующих антител и антигемагглютининов в сыворотках больных гепатитом C. Материал для исследований - сыворотки крови больных гепатитом C, полученные из 1-й городской клинической больницы. Сыворотки изучают в реакции биологической нейтрализации и в реакции торможения гемагглютинации по общепринятым методам. Реакции ставят в микромодификации.

Результаты исследований приведены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что использование предлагаемого штамма ВГС позволяет впервые выявлять в крови инфицированных гепатитом C вируснейтрализующие антитела и антигемагглютинины, что имеет важное диагностическое и прогностическое значение.

Полученный оригинальный авторский штамм вируса гепатита C, Д-1, обладает высокой продуктивной активностью и адаптирован к широкому спектру чувствительных к вирусной репродукции культур клеток, характеризуется высокой антигенной, вируснейтрализующей активностью и протективной активностью, и может быть использован для изучения иммунного статуса у больных гепатитом C, для диагностики и идентификации выделенных штаммов вируса гепатита C, для скриннинга противовирусных препаратов, для создания средств лечения и профилактики вирусного гепатита C.

Изобретение предназначено для создания средств лечения и профилактики вирусного гепатита C (ВГС). Высокопродуктивный штамм virus hepatitic C характеризуется адаптацией к широкому спектру чувствительных к репродукции вируса культур клеток, высокой антигенной, вируснейтрализующей и протективной активностью. Штамм вируса гепатита C, Д-1, выделен из первичных культур клеток головного мозга новорожденных мышей 2 - 3-дневного возраста, хронически инфицированных РНК ВГС, содержащейся в сыворотке крови больной хроническим гепатитом C, на 220-й день со дня заражения культур с последующим 3-кратным пассированием в культурах клеток фибробластов куриного эмбриона. Штамм депонирован в Государственной Коллекции вирусов при НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского и имеет регистрационный номер ГКВ-963. Штамм характеризуется стабильным проявлением биологических признаков, высокими продуктивностью, антигенной, вирусонейтрализующей и протективной активностью. Изобретение позволяет получить высоко иммуногенные иммуноглобулины и вакцину против гепатита C, а также чувствительные диагностические препараты и тест-системы. 3 табл.

Штамм virus hepatitic C N ГКВ-963, используемый для приготовления диагностических и профилактических препаратов.