Область применения
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.
Уровень техники
Действие тяжелых металлов на культивируемые клетки растений мало исследовано, отсутствуют исследования по комплексному воздействию тяжелых металлов, а именно кадмия, свинца и цинка.
Известен способ выделения клеточной линии дурмана, устойчивой к хлориду кадмия, устойчивость к кадмию сохранилась у клеток дурмана после 400 генераций в неселективных условиях (Jackson P.J., Roth E.J., McClure P.R., Naranjo C.M. Selection, isolation and characterization of cadmium-resistant Datura innoria suspension culture // Plant Phys., 1984, v.75, P.914-918).
Еще в одном способе были получены клетки, устойчивые к ионам цинка (Gilissen L.J.W., van Staveren M. J. Zinc-resistant cell lines of Haplopapput gracilis// J.plant Physiol. v.125, P.95-103, 1986).
Недостатком данных методов являлось использование в этих работах суспензионных культур и длительной селекции.
Известен способ получения растений, устойчивых к меди, состоящий из получения каллуса из семян, затем культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 100-200 мг/ л меди до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди (Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В., Гладкова О.В. Патент РФ №2260937 «Способ получения толерантных к ионам меди однодольных растений in vitro»).
Недостатком данного метода являлось относительно длительное культивирование.
Задачей нашего метода было разработать способ получения толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, а именно получить устойчивые растения.
Раскрытие изобретения
Данная задача была решена созданием нового способа толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, состоящего из получения каллуса из семян, культивирования, регенерации и укоренения на питательной среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л, затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л.
Сущность изобретения
По мнению авторов, сущность нашего метода заключается в коротком периоде культивирования и использовании нескольких токсикантов на каждом периоде культивирования, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток и приводит к получению устойчивых растений.
Вероятно, адаптация растений к избыткам металлов связана с задержкой тяжелых металлов за пределами метаболически важных органов и со снижением активности избыточных ионов благодаря переводу их в физиологически инертные формы и созданием альтернативных реакций обмена.
Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации на стадии культивирования кадмия более 10 мг/л, цинка более 200 мг/л, свинца более 650 мг/л прирост каллуса незначительный и большая часть каллусов погибает, концентрации кадмия менее 5 мг/л, цинка менее 100 мг/л, свинца менее 325 мг/л не являются эффективными.
При концентрации тяжелых металлов на стадии регенерации и укоренения кадмия выше 18 мг/л кадмия, цинка выше 300 мг/л, свинца выше 1100 мг/л наблюдалась крайне низкая регенерационная способность и незначительное укоренение. Концентрация свинца -1300 мг/л, кадмия - 20 мг/л, цинка - 350 мг/л являлась практически летальной на стадии регенерации и укоренения. Концентрации кадмия менее 10 мг/л, цинка менее 200 мг/л, свинца менее 650 мг/л не являются существенными для городских условий.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблице.
Пример 1.
Первичный каллус получают из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты составляла 3 мг/л. Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 1 пассажа при концентрации кадмия - 5 мг/л, цинка - 100 мг/л, свинца - 325 мг/ л. Первичный каллус массой 20 мг высаживают на селективную среду, содержащую в качестве токсиканта - тяжелые металлы. После культивирования в течение 1 месяца отбирают светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании некоторые каллусные клетки существенно отличаются друг от друга по окраске (часть каллусов приобретал более темную окраску) и по росту (интенсивность роста отдельных клеток различалась в полтора раза). Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л.
Пример 2.
Первичный каллус получают из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты составляла 3 мг/л. Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 1 пассажа при концентрации кадмия - 7 мг/л, цинка - 150 мг/л, свинца - 500 мг/л. При культивировании некоторые каллусные клетки, так же как и у овсяницы, существенно отличаются друг от друга по окраске и по росту. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л.
Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование овсяницы красной проводят при концентрации кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 14 мг/л, цинка - 250 мг/л, свинца - 950 мг/л.
Пример 4. Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование полевицы побегоносной проводят при концентрации кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 18 мг/л, цинка - 300 мг/л, свинца - 1100 мг/л.
Примечание: прирост каллуса в контроле - 5,8 раз, регенерация в контроле составляла - 90%, укоренение - 86%.
Обсуждение результатов
Техническим результатом изобретения является - прирост каллусной ткани составлял от 33,0% до 58,6%; регенерационная способность от 10,0% до 40,0%; укоренение 33,0%-50,0%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить высокий процент регенерации и растения, обладающие комплексной устойчивостью.
Для проверки устойчивости к высоким концентрациям тяжелых металлов регенераты полевицы были высажены в почву при содержании свинца - 650 мг/л, кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л. 90% растений, полученных из устойчивых к тяжелым металлам клеток, росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.
При концентрации кадмия - 18 мг/л кадмия, цинка - 300 мг/л, свинца - 1100 мг/л - 50% растений росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.
Кроме того, неожиданным образом было показано, что при взаимодействии тяжелых металлов не всегда происходит усиление токсического действия, цинк уменьшает токсическое действие кадмия и свинца, но в то же время кадмий и свинец усиливают токсическое действие друг друга.
Т.о. большинство растений-регенерантов, полученных из устойчивых к тяжелым металлам клеточных линий, обладает повышенной комплексной устойчивостью.
Следовательно, данный метод можно рекомендовать для получения растений, устойчивых к комплексному воздействию токсикантов - солям кадмия, свинца и цинка.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ КАДМИЯ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO | 2006 |
|
RU2306696C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ СВИНЦА ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO | 2006 |
|
RU2305400C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ МЕДИ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO | 2004 |
|
RU2260937C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ ГАЗОННЫХ ТРАВ IN VITRO | 2004 |
|
RU2260936C1 |
СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ КЛЕТОК ЛЬНА МНОГОЛЕТНЕГО | 2012 |
|
RU2506741C1 |
Способ получения растений-регенерантов эспарцета | 1988 |
|
SU1630707A1 |
СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ГРЕЧИХИ IN VITRO | 2013 |
|
RU2538167C1 |
СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ ИРИСА СИБИРСКОГО (I.SIBIRICA L.) | 2011 |
|
RU2479992C1 |
СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ МАКЛЕИ СЕРДЦЕВИДНОЙ (MACLEAYA CORDATA (WILLD) R.BR.) (ВАРИАНТЫ) | 2003 |
|
RU2264084C2 |
Способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro | 2016 |
|
RU2619052C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии. Проводят культивирование каллуса однодольных растений в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л. Затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л. Изобретение позволяет эффективно получить растения-регенеранты, обладающие повышенной комплексной устойчивостью к тяжелым металлам. 1 табл.
Способ получения толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, предусматривающий получение каллуса из семян, культивирование, регенерацию и укоренение на питательной среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л, затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ МЕДИ ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO | 2004 |
|
RU2260937C1 |
US 5965796, 12.10.1999 | |||
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ЗАСОЛЕНИЮ ГАЗОННЫХ ТРАВ IN VITRO | 2004 |
|
RU2260936C1 |
Авторы
Даты
2007-11-27—Публикация
2006-02-20—Подача