Способ получения растений-регенерантов эспарцета Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 

- Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в , селекции и семеноводстве эспарцета, Б частности для ускоренного размножения, в биотехнологической работе: в селекции на клеточном уровне, для укоренения при черенковании,в других1 областях исследований - в фитопатологии, генетике.

Конкретной областью применения предлагаемого способа является сельскохозяйственная биотехнология - для массового получения растений эспарцета из тканей, клеток и протопластов.

Целью изобретения является повышение количества получаемых растений за счет массовой регенерации.

Способ состоит в том, что после стерилизации исходный эксплантат (лист, стебель, корень, семядоли,

завязи) высаживают последовательно i на модификации питательной среды Мурасиге-Скуга для получения клеточ-- ной массы, затем ее размножения и, наконец, для регенерации растений и их укоренения на среду Шенка-Хиль- дебрандта.

Способ осуществляют следующим образом.

Отобранные для работы эксплантаты растений поверхностно стерилизуют насыщенным раствором г ипохлорита кальция, или готовят к исполнению отдельные части растений, выращенных в стерильных условиях.

Для получения инициальной каллус- ной массы эксплантат помещают на 20- 24 дней (1 пассаж) на питательную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу, в которую добавлены тригонеллин 9-10 мг/л, индолилмасо

со

о -4

31

ляная кислота (ИМК) 1,5-2 мг/л и культивируют в стандартных условиях. Полученные каллусы для размножения помещают на 20-24 дня (2 пассаж) на питательную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу, ин долилмасляной кислоты 0,20-0,25 мг/л бензиламинопурина 0,05-0,10 мг/л (6 БАЛ), пептон-гидролизата 200 - 250 мг/л, зеатин-рибозида 0,55 - 0,65 мг/л и оставляют в тех же условиях. Затем для получения эмбриоген- иых структур каллусы переносят на 10 12 дней (3 пассаж) на жидкую среду Мурасиге-Скуга с половинным содержанием солей и витаминами по прописи с добавлением тех же компонентов в тех же концентрациях и культивируют при 16-часовом фотопериоде и стан- дартных температурных условиях и медленном качании, затем (4 пассаж) переносят на твердую среду на 20-24 дн этого же состава, исключая пептон- гидролизат, с добавлением 0,30-Х), 35 м бМ-диметилаллиламинопурина () и культивируют при тех же условиях до появления регенерантов, которые затем пересаживают с добавлением индо- лилуксусной (ИУК) кислоты 0,50 - 0,55 мг/л.

Пример. Проводят стерилизацию исходного эксплантата, высадку его, размножение полученного инициального каллуса, пересадку его для образования, эмбриогенных структур, регенерацию из них растений, используя модификации питательной среды Мурасиге-Скуга, и заключительную пересадку растений для образования корней на модифицированную среду Шен ка-Хильдебрандта, и дальнейшее выращивание растений при 16-часовом фотопериоде. При этом в первичную инициальную среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу внося 9 мл/г тригонеллина с 1,5 мг/л индо- лилмасляной кислоты и культивируют в темноте. Для размножения каллусной массы в среду с солевой основой и витаминами по Мурасиге-Скугу добавля ют 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты 0,05 мг/л, 6-бензиламинопурина, 200 мгл/л петои-гидролизата, 0,55 мг/л зесгпгн-рибозида и культивируют в темноте. Получение эмбриогенных структур и регенерацию осуществляют на среде Мурасиге-Скуга с

половинным содержат-. JM солей и витаминами (полностью по прописи) с компонентами предыдущего этапа, исключив пептон-гидролизат и добавив 0,3 мг/л бу -диметилаллиламинопурина. Заключительную пересадку для ускоренного образования корней и растений осуществляют на среду Шенка-Хиль- дебрандта с добавкой 0,5 мг/л индо- лилуксусной кислоты и выращивают при 1Ь-часовом фотопериоде.

20Ј5

30

.

35

Аналогично примеру 1 осуществляют другие примеры, при этом проанализирована возможность использования различных эксплантатов и различных концентраций добавок к среде.

Результаты исследований представлены в табл. 1-6.

Использование изобретения позволяет за 10-12 недель за счет оптимизации образования эмбриогенного каллуса и его быстрой и массовой регенерации увеличить выход растений эспарцета из культуры тканей, облегчить процесс размножения и укоренения, а также расширить объем работ по клеточной селекции для получения исходного материала с ценными хозяйственными признаками для ускоренного создания новых сортов эспарцета. Формула из о.б р е т е н и я

1. Способ получения растений-реге- нерантов эспарцета, включающий стерилизацию исходного эксплантата, посадку его на питательную среду, получение и размножение инициального каллуса, пересадку его на среду для образования эмбриогенных структур, регенерацию из них растений, пересадку их на среду для корнеобразования и дальнейшее выращивание при 16-часовом фотопериоде, отличающий- с я тем, что, с целью повышения количества получаемых растений за счет массовой регенерации, независимо от особенностей генотипа, получение инициального каллуса осуществляют на 0 питательной среде Мурасиге-Скуга, в которую дополнительно вносят триго- неллин и индолилмасляную кислоту, размножение каллуса проводят на пи- - тательной среде Мурасиге-Скуга, дополнительно содержащей индолилмасляную кислоту, 6-бензиламинопурин, пептон-гидролизат, зеапин-рибозид, образование эмбриогенных структур и регенерацию из них растений осущест

40

45

55

вляют на питательной среде Мурасиге- Скуга, содержащей микро- и макросолн в количестве, равном половинному, указанного в прописи, в которую дополнительно вносят индолилмасляную кислоту, 6-бензиламинопурин, зеатин- рибозид и 6 у у-диметиламинопурин, и дальнейшее ускоренное образование корней проводят на среде Шенка-Хиль- дебрандта, в которую добавляют ин- долилукс-усную кислоту.

2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что в среду для получения инициального каллуса триго- неллин вносят в количестве 9-10 мг/л, индолилмасляную кислбту - в количестве 1,5-2 мг/л.

3.Способ поп.1, отличающийся тем, что в среду для раз-

множения каллуса вносят индолилмас- i ляную кислоту в количестве 0,20 - 0,25 мг/л, 6-бензиламинопурин - в количестве 0,05-0,10 мг/л, пептон- гидролизат - в количестве 200-250 мг/л зеатин-рибозид - в количестве 0,55 - 0,65 мг/л.

4.Способ поп.1, отличающийся тем, что в среду для образования эмбриогенных структур вног сят компоненты по п.З, а пептон-гид- ролизат заменяют на 6 -диметиламинопурин, который вносят в количестве

0,30-0,35 мг/л.

i

5.Способ поп.1, о т л и ч а ю - щ и и с я тем, что в среду для кор- необразования вносят индолилуксусную кислоту в количестве 0,50-0,55 мг/л.

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования растительных тканей и клеток. Изобретение может применяться для ускоренного размножения эспарцета. Целью изобретения является повышение количества получаемых растений за счет массовой регенерации. Способ состоит в том, что после стерилизации исходный эксплантат высаживают последовательно на модификации питательной среды Мурасиге-Скуга для получения клеточной массы и ее размножения, а для регенерации и укоренения получен- ную клеточную массу высаживают на модифицированную среду Шенка-Хиль- дебрандта. 4 з.п. ф-лы, 6 табл. с S

Частота индукции каллуса в

и инициальной среды (% от эксплантата). Сорт Закавказский ЭксплантатВариант среды по способу

предлагаемомуизвестному

Мурасиге- Мурасиге- Линсмайер Линсмайер Скуга Скуга Скуга Скуга

2,4 Д к-та ИМК + три- 2,4 Д к-та 6-ВАП гонеллин 6-БАП

Семядоли 50,8+2,7 95,1+2,3 60,9+2,3 37,9+3,4 Листья66,1+3,1 93,7±2,8 88,7+1,9 47,0+3,1

Стебли70,1+1,8 96,8+3,1 86,2±3,3 80,,8

Таблица 2

Влияние различных концентраций ИМК на индукиию каллуса

ЭксплантатВариант среды

Мурасиге- Мурасиге- Мурасиге- Скуга Скуга Скуга

ИМКИМК + ИМК +

1,5 мг/л + 9-10 мг/л + 11-12 мг/л тригонеллин тригонеллин

Семядоли 66,8+3,4 . 88,9+1,5 75,7+2,7 Листья80,1+3,7 91,7+3,7 87,0+4,0

Стебли73,7+2,9 95,8+2,4 88,7+2,5

Таблица зависимости от эксплантата

1

Таблица 3

Влияние компонентов среды на интенсивность накопления каллуса (прирост в % к исходной величине). Сорт Закавказский

ПоказателиСреда Мурасиге-Скуга

ИМКИМКБАЛ ИМК БАЛБАЛЗеатин- Пептон- Пептон-Зеатин-рибозид гидролизат гидролизатрибозидПептон- Зеатин- Зеатин-гидролизат рибозид рибозид

За 2 пассажа249-300180-238160-198140-178 Минимум-максимум250-340200-220150-208170-200 В трех независимых опытах298-370190-248207-219169-211

Та.б лица 4

ПоказателиСреда Мурасиге-Скуга 1/2 солей

1234

6-БАП6-БАПИМК6-БАЛ

ИМКИМКЗеатин-ИМК

Зеатин-Зеатин-рибозид6- -g

рибозидрибозидб-Р -в

...

Образование эмбр иодой (почек) за 2 пассажа минимум- максимум 360-600 150-168 178-200 Образование растений за 2 пассажа195 59 117 54

Примечание. 1 - все четыре компонента (по предлагаемому способу); 2:3:4 - с отсутствием одного из компонентов соответственно.

Таблица 51 Влияние питательной среды на образование корней у растений-рёТе- нерантов эспарцета в трех независимых опытах, %. Добавлена ИУКО,50- 0,55 все среды,

Вариант среды

Шенка

Хильдебрандта

Гамбор Б-5

Сорт Закавказский

Мурасиге- Скуга

1630707

Продолжение табл.5 i Влияние питательной среды на

образование корней у растений-ре- генерантов эспарцета в трех не- ,зависимых опытах, %. Добавлена ИУК 0,50 - 0,55 мг/л во все ереды

Вариант среды

Таблица 6 Инициация каллусных культур из эксплантатов сорта Закавказский в зависимости от условий культивирования через 7 дней от момента посадки,2

Эксплантат

10

Среда Мурасиге-Скуга . с добавлением ИМК и тригонеллина (по предлагаемому способу)