СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТОЛЕРАНТНЫХ К ИОНАМ СВИНЦА ОДНОДОЛЬНЫХ РАСТЕНИЙ IN VITRO Российский патент 2007 года по МПК A01H4/00 

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Действие свинца на культивируемые клетки растений не исследовано.

Известны способы получения толерантных к другим тяжелым металлам клеток и растений.

Известен способ выделения клеточной линии табака, устойчивой к алюминию (Conner A. J. Strategis for the selection and characterisation of aluminium-resistant variants from cell cultures of Nicotiana plumboginifola Planta, v. 166, P.466-473).

В следующем способе были получены устойчивые к кадмию растений льна-долгунца на среде Мурасиге-Скуга при концентрации кадмия 15 мг/л кадмия (Гончарук Е.А. Влияние кадмия на морфогенез, анатомию стебля и процесс регенерации льна-долгунца из клеточных и тканевых культур in vitro, автореферат диссертации на соискании ученой степени к.б.н. // ТСХА, 2000, 23 стр.).

Недостатками данного метода являлось длительное культивирование (в течение 14 пассажей), которое существенно уменьшало регенерационную способность клеток.

Задачей нашего метода было исключить вышеизложенные недостатки других методов и получить устойчивые к свинцу однодольные растения.

Раскрытие изобретения

Эта задача решается созданием нового способа толерантных к ионам свинца однодольных растений in vitro, состоящим из культивирования каллуса в течение 2-3 пассажей при концентрации нитрата свинца на среде Мурасиге-Скуга с 0,1-0,15% Pb(NO₃)₂, затем проводят регенерацию при концентрации нитрата свинца на среде с 0,1-0,15% Pb(NO₃)₂,и укоренение при концентрации нитрата свинца на среде с 0,1-0,15% Pb(NO₃)₂.

Сущность изобретения

По мнению авторов сущность нашего метода заключается в уменьшенном периоде культивирования и использовании свинца на каждом этапе селекции.

В данном методе была выбрана прямая схема селекции, т.к. свинец обладает средней токсичностью, а именно он существенно по своей фитотоксичности уступает кадмию и меди. В большинстве случаев химические элементы по степени опасности располагаются в следующей последовательности: Cu>Ni>Cd>Pb>Hg>Fe>Mo>Mn.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации нитрата свинца - выше 0,15% на стадии культивирования, регенерации и укоренения происходит гибель большинства клеток и потеря регенерационной способности и незначительное укоренение растений, а концентрация нитрата свинца - 0,25% является летальной. Концентрация нитрата свинца - ниже 0,1% на стадии культивирования, регенерации и укоренения не является эффективной и существенно не влияет на рост и регенерационную способность каллусных клеток.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам 1-6 представлены в таблице. Дополнительные материалы изложены в примерах 7-24 и представлены в таблице 2.

Пример 1.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Первичный каллус получали из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 30 г/л сахарозы, 500 мг/л гидролизата казеина и 7 г/л агар-агара. Первичный каллус массой 15-20 мг высаживали на селективную среду, содержащую в качестве селективного агента свинец. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во 2 пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 2.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во 2 и 3 пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 3.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 4.

Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, культивирование каллуса проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 5.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 6.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 7.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Регенерацию и укоренение проводят на среде с уменьшенным содержанием гидролизата казеина, макросолей, инозита, железа- хелата, сахарозы и с добавлением α-нафтилуксусной кислоты на стадии регенерации и укоренения, и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты на стадии регенерации. Регенерацию проводят на среде, содержащей 250 мг/л гидролизата казеина, макросоли - 30 мл/л, микросоли - 1 мл/л, витамины - 2 мл/л, инозит - 50 мг/л, хлорид кальция - 3,33 мл/л, железо-хелат - 3 мл/л, сахароза - 20 г/л, 0,5 мг/л 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты, 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, содержащей 250 мг/л гидролизата казеина, макросоли - 30 мл/л, микросоли - 0,5 мл/л, витамины - 2 мл/л, инозит - 50 мг/л, хлорид кальция - 3,33 мл/л, железо-хелат - 3 мл/л, сахароза - 20 г/л, 1 мг/л α-нафтилуксусной кислоты при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 8.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят аналогично примеру 2, в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во 2 и 3 пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 9.

Культивирование проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 10.

Культивирование проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, культивирование каллуса проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 11.

Культивирование проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 12.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 7, при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 13.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Регенерацию и укоренение проводят на среде без гидролизата казеина, с уменьшенным содержанием инозита, железа-хелата и с добавлением α-нафтилуксусной кислоты, а также с уменьшением содержания макросолей, микросолей, витаминов, хлорида кальция и сахарозы на стадии укоренения. Регенерацию проводят на среде, содержащей макросоли - 50 мл/л, микросоли - 1 мл/л, витамины - 2 мл/л, инозит - 50 мг/л, хлорид кальция - 3,33 мл/л, железо-хелат - 3 мл/л, сахароза - 30 г/л, 0,5 мг/л α-нафтилуксусной кислоты, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, содержащей макросоли - 30 мл/л, микросоли - 0,5 мл/л, витамины - 1 мл/л, инозит - 50 мг/л, хлорид кальция - 1,7 мл/л, железо-хелат - 3 мл/л, сахароза - 20 г/л, 2 мг/л α-нафтилуксусной кислоты при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 14.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 15.

Культивирование проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 16.

Культивирование проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 17.

Культивирование проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 18.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 13, при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 19.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 2 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Регенерацию и укоренение проводят на среде, содержащей полный комплекс полезных веществ, как на стадии культивирования, но без добавления 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. Регенерацию проводят на среде, содержащей 500 мг/л гидролизата казеина, макросоли - 50 мл/л, микросоли - 1 мл/л, витамины - 2 мл/л, инозит - 100 мг/л, хлорид кальция - 3,33 мл/л, железо-хелат - 5 мл/л, сахароза - 30 г/л, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, содержащей 500 мг/л гидролизата казеина, макросоли - 50 мл/л, микросоли - 1 мл/л, витамины - 2 мл/л, инозит - 100 мг/л, хлорид кальция - 3,33 мл/л, железо-хелат - 5 мл/л, сахароза - 30 г/л при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 20.

Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,1%. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во 2 и 3 пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,1%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,1%.

Пример 21.

Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 22.

Культивирование проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование каллуса проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,125%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,125%.

Пример 23.

Культивирование проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование каллуса полевицы побегоносной проводят при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 19,при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Пример 24.

Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 3 пассажей при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Регенерацию проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,15%. Укоренение проводят на среде, аналогично примеру 19, при концентрации нитрата свинца - 0,15%.

Таблица 1Влияние свинца на рост и выживаемость каллусных клеток№ примераКоличество пассажейКонцентрация Pb(NO₃)₂, %Процент прироста каллуса по отношению к контролю% образования регенерирующего каллуса% укоренения120,156,0±4,360,5±5,050,5+5,1230,150,0±3,350,5±4,150,5±5,1320,12533,5±1,640,5±4,941,0±5,0430,12526,5±3,028,5±4,040,5±4,1520,1518,5±1,633,0±3,340,0±4,0630,1516,0±1,618,0±1,233,0±3,3

Таблица 2Влияние свинца на рост и выживаемость каллусных клеток№ примераКоличество пассажейКонцентрация Pb(NO₃)₂, %Процент прироста каллуса по отношению к контролю% образования регенерирующего каллуса% укоренения720,156,0±4,344,5±4,650,5±4,0830,150,0±3,340,0±3,448,5±5,1920,12533,5±1,633,0±2,942,3±3,01030,12526,5±3,020,5±2,040,0±3,01120,1518,5±1,621,0±3,040.0±2,81230,1516,0±1,618,0±1,933,9±2,31320,156,0±4,356,0±4,050,5±4,41430,150,0±3,344,5±3,950,5±4,01520,12533,5±1,636,9±3,744,0±3,31630,12526,5±3,026,0±4,241,5±2,01720,1518,5±1,627,0±3,039,0±5,01830,1516,0±1,618,9±1,533,0±3,01920,156,0±4,360,5±5,050,5±5,12030,150,0±3,350,5±4,150,5±5,12120,12533,5±1,640,5±4,941,0±5,02230,12526,5±3,028,5±4,040,5±4,12320,1518,5±1,633,0+3,340,0±4,02430,1516,0±1,618,0±1,233,0±3,3

Обсуждение результатов

Техническим результатом является прирост каллусной ткани, который составлял от 16,0% до 56%; регенерационная способность от 18,0% до 60,5%; укоренение 33,0-50,5%.

Технический результат данного метода показывает его эффективность, позволяющую получить однодольные растения, устойчивые к высоким концентрациям нитрата свинца.

Для проверки устойчивости к высоким концентрациям свинца регенеранты были высажены в почву с 0,4% нитрата свинца. 90% растений, полученных из устойчивых клеточных линий, росли при концентрации 0,4% нитрата свинца, как растения в почве без токсиканта. При данной концентрации обычные растения не всходят, а у целых растений наблюдается очень значительное замедление роста (40% от контроля), некоторые растения погибают (20%). Следует отметить, что различные растения по-разному реагируют на загрязнение почвы свинцом. У многих растений под действием свинца появляются признаки угнетения (хлороз листьев, уменьшение листовой поверхности, торможение роста).

Кроме того, неожиданным образом было получено, что некоторые растения, полученные после селекции со свинцом, росли при концентрации нитрата свинца (0,5%).

Т.о. большинство растений-регенерантов, полученных из устойчивых к свинцу клеточных линий, обладало повышенной толерантностью к свинцу.

Следовательно, технический результат данного метода можно рекомендовать для получения однодольных растений, устойчивых к свинцу.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения толерантных к ионам свинца однодольных растений. Проводят культивирование каллуса в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга, содержащей нитрат свинца с 0,1-0,15%, затем проводят регенерацию на среде, содержащей нитрат свинца 0,1-0,15%, и укоренение на среде, содержащей нитрат свинца 0,1-0,15%. Изобретение позволяет получить однодольные растения с повышенной толерантностью к свинцу 2 табл.

Способ получения толерантных к ионам свинца однодольных растений in vitro, включающий культивирование каллуса в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга, содержащей нитрат свинца 0,1-0,15%, затем проводят регенерацию на среде, содержащей нитрат свинца 0,1-0,15%, и укоренение на среде, содержащей нитрат свинца 0,1-0,15%.