СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АУТОЛОГИЧЕСКИХ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК C12N5/02 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение касается, в целом, получения и очистки аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в условиях, обеспечивающих возможность их использования в клеточной терапии. В частности, изобретение касается среды для аутологического культивирования таких клеток и ее применения в культивировании и увеличении объема упомянутых клеток, а также композиций, содержащих их.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одной из сложнейших проблем медико-биологических исследований является разработка терапевтических стратегий, позволяющих заменять или восстанавливать клетки или ткани, разрушенные или поврежденные при наиболее изнуряющих или инвалидизирующих заболеваниях, таких как нейродегенеративные заболевания (болезни Паркинсона и Альцгеймера), диабет, мышечные и сердечные заболевания, печеночная недостаточность и т.д.

Одной из наиболее многообещающих терапевтических стратегий является клеточная терапия, основанная на хорошо известном факте, что существует возможность получения клеток, более или менее недифференцированных, которые способны делиться с выработкой функциональных дифференцированных клеток и в некоторых случаях даже способны к регенерации. К ним относятся стволовые клетки и клетки-предшественники, которые далее будут вместе именоваться стволовыми клетками-предшественниками. Эти клетки могут быть обнаружены в эмбриональных и даже во взрослых тканях. Поэтому клеточная терапия заключается в трансплантации или имплантации пациенту достаточного количества стволовых клеток-предшественников для воссоздания и восстановления функциональности поврежденного органа.

Один из предложенных способов клеточной терапии основан на использовании стволовых клеток-предшественников взрослого организма, полученных от животного (ксеногенные клетки), от донора (аллогенные клетки), или от самого пациента (аутологические клетки). Использование аутологических стволовых клеток-предшественников лишено некоторых недостатков других способов клеточной терапии, таких как нехватка доноров, необходимости иммунодепрессивного лечения во избежание отторжения организмом пациента, а также этических проблем, связанных с использованием эмбриональных клеток.

Тем не менее, чтобы осуществление клеточной терапии стало возможным, необходимы дополнительные знания о том, какие клетки являются пригодными в каждом конкретном случае и как их идентифицировать, а, кроме того, необходима разработка методик правильной обработки стволовых клеток-предшественников, обеспечивающей их пригодность для клинического использования.

Аутологическая клеточная кардиомиопластика (СМР) представляет собой конкретный пример клеточной терапии для лечения сердечных заболеваний (ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность и т.д.). Общее доработанное описание можно найти в Curr. Control. Trials Cardiovasc. Med. 2001; 2:208-210 (D.A.Taylor). Методики и композиции для выделения, культивирования, увеличения объема и использования различных стволовых клеток-предшественников, пригодных для СМР, можно найти в US 5130141, WO/0107568, WO/0194555, WO 79854301, US 2001/0038837 и US 5543318.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение касается, в целом, получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, пригодных для использования в клеточной терапии, и, в частности, создания доступной методики правильной обработки стволовых клеток-предшественников, обеспечивающей их пригодность для клинического применения, включая специфические способы их получения, культивирования, очистки и увеличения объема.

Предлагаемое в данном изобретении решение основано на том обнаруженном авторами факте, что применение аутологической среды культивирования, включающей аутологическую человеческую сыворотку и питательные вещества, вместе с антикоагулянтом, обеспечивает возможность культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, которые могут быть использованы в изготовлении фармацевтических композиций для лечения различных патологий посредством клеточной терапии.

Изобретение описано на примере получения аутологической среды культивирования, содержащей питательные вещества, аутологическую человеческую сыворотку, гепарин и протамин, и ее использования в культивировании in vitro, очистке и увеличении объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для изготовления соответствующих фармацевтических композиций для лечения ишемических кардиомиопатий и идиопатических кардиомиопатий посредством аутологической клеточной СМР.

Один из аспектов данного изобретения относится к среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, содержащей аутологическую человеческую сыворотку и питательные вещества, вместе с антикоагулянтом и средством реверсирования антикоагуляции.

В соответствии с другим аспектом, изобретение касается способа приготовления упомянутой среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников. В одном из вариантов осуществления аутологическую человеческую сыворотку, присутствующую в такой среде культивирования, получают путем плазмофереза.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к использованию упомянутой среды культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, включающему инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в упомянутой культуре и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для использования в клеточной терапии, который включает инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в упомянутой культуре и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие мышечные стволовые клетки-предшественники, вместе с одним или более наполнителями, приемлемыми с фармацевтической точки зрения.

В соответствии со следующим аспектом, изобретение относится к терапевтическому способу аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, выращенные ex vivo в аутологической среде культивирования.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой столбцовую диаграмму, отображающую оценку функции левого желудочка путем анализа фракции выброса левого желудочка (LVEF), рассчитанной по двумерной эхокардиограмме (2D) и на основе автоматического определения границы между кровью и эндокардом (ABD): до хирургической операции (базовая величина), во время последующих контрольных наблюдений через 40 дней после клеточной трансплантации (40 дней) и во время последующих контрольных наблюдений в течение 3 месяцев (3 месяца).

Фиг.2 показывает оценку перфузии путем РЕТ-томографии с использованием ¹³N-аммония и РЕТ-оценку метаболизма глюкозы ¹⁸F-FDG (фтордиокси-D-глюкозы): до хирургической операции (базовая величина) и во время контрольного наблюдения (КН) через 3 месяца после клеточной трансплантации (КН 3 месяца). Фиг.2А: Снимки, принадлежащие пациенту №5, являющемуся типичным примером пациента, получившего клеточную трансплантацию. Фиг.2В: Снимки, соответствующие сердцу пациента №9, не получившего клеточной трансплантации (из-за заражения культуры миогенных клеток скелетной мышцы). Стрелки показывают ткань в области инфаркта, до и после операции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Аутологическая среда культивирования

В первом аспекте данное изобретение относится к аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, называемой здесь далее "аутологической средой культивирования по изобретению", которая содержит:

а) от 0,1% до 90 вес.% аутологической человеческой сыворотки;

b) от 0,1% до 10000 МЕ/мл гепарина;

c) от 0,1% до 10000 МЕ/мл протамина; и

d) среду культивирования с основными питательными веществами, включая или не включая глутамин, в количестве, необходимом до 100 вес.%.

Аутологическая среда культивирования по изобретению представляет собой полную среду культивирования, полученную из аутологической человеческой сыворотки, взятой у того пациента, который является объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников. Аутологическая человеческая сыворотка, если это желательно, может быть подвергнута обычной обработке, например тепловой обработке, с целью инактивации комплемента.

Аутологическая человеческая сыворотка может быть взята у того пациента, который является объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, при помощи любой общепринятой методики, например из образцов крови пациента или, предпочтительно, путем проведения плазмофереза у упомянутого пациента. В одном из вариантов осуществления изобретения, плазмоферез проводят с использованием гепарина в качестве антикоагулянта и протамина сульфата для реверсирования антикоагуляции. Хорошо известно, что плазмоферез обычно проводят с использованием ACD (антикоагулирующий раствор "кислота-цитрат-декстроза") [например, на 1 литр воды добавляют моногидрат лимонной кислоты (8 г), цитрат (22 г) и моногидрат глюкозы (24,5 г) в качестве антикоагулянта]. Этот антикоагулянт высвобождает кальциевый хелатор, поэтому для реверсирования эффекта ACD и получения сыворотки необходимо добавить кальций, который впоследствии причиняет вред клеточной культуре. Плазмоферез позволяет получить весьма существенное количество сыворотки, превосходящее количество сыворотки, полученной из образцов крови пациента, так как при плазмоферезе не происходит потери крови у пациента, что является для него важным преимуществом. Кроме того, использование сыворотки, полученной из плазмофереза с использованием гепарина и протамина, дает возможность ее использования в среде культивирования без последующих проблем в клеточной культуре.

Аутологическая среда культивирования по изобретению содержит основные питательные вещества и, возможно, глутамин. Существуют доступные серийно выпускаемые среды, которые содержат основные питательные вещества для клеточной культуры. В принципе, любая среда, предоставляющая необходимые питательные вещества для культивирования клеток, может быть использована в данном изобретении. В одном из вариантов осуществления питательные вещества предоставляются средой НАМ F12 [GIBCO BRL].

В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению дополнительно содержит антибиотик. Практически любой антибиотик может быть использован в данном изобретении. В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению включает антибиотик, выбранный из пенициллина, стрептомицина, гентамицина и их смесей. Подобным образом, аутологическая среда культивирования по изобретению может также содержать, если это желательно, противогрибковое средство, например, амфотерицин В и/или фактор роста, например фактор роста фибробластов, такой как нативный или рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF).

В одном из вариантов осуществления аутологическая среда культивирования по изобретению содержит:

89 вес.% среды НАМ F12;

10% аутологической человеческой сыворотки пациента;

гепарин 0,1-10000 МЕ/мл;

протамин 0,1-10000 МЕ/мл; и

1% пенициллина/стрептомицина и, возможно,

0,25 мг/мл амфотерицина В и/или

0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFGF.

2. Способ приготовления аутологической среды культивирования по изобретению

В другом аспекте изобретение относится к способу приготовления среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по данному изобретению, который включает смешивание и гомогенизацию различных ее компонентов.

Предпочтительно, упомянутую аутологическую человеческую сыворотку получают плазмоферезом, как описано выше, с использованием гепарина в качестве антикоагулянта для получения плазмы и протамина для реверсирования антикоагуляции и получения сыворотки. Таким образом, полученная аутологическая человеческая сыворотка уже содержит гепарин и протамин.

3. Применение аутологической среды культивирования по изобретению

В следующем аспекте изобретение относится к использованию аутологической среды культивирования по изобретению для культивирования in vitro, очистки и увеличения объема аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.

Использование аутологической человеческой сыворотки в среде культивирования для выращивания аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников создает множество преимуществ, например выращивание клеток может осуществляться в любой точке земного шара без риска заражения прионами, вирусами и болезнями, передаваемыми от животного человеку, что присуще традиционным способам культивирования клеток с использованием эмбриональной телячьей сыворотки для выращивания клеток. Использование аутологической человеческой сыворотки в культурах человеческих клеток вместо телячьей сыворотки создает большие преимущества, так как (i) позволяет избежать реакции "антиген-антитело", (ii) позволяет избежать воспалительных реакций, вызываемых гетерологическими белками; и (iii) позволяет избежать разрушения клеток в результате многократных промывок, обязательных для клеток, культивируемых в телячьей сыворотке, перед их введением в человеческий организм. Фактически, имеющийся клинический опыт аутологической клеточной СМР показывает наличие злокачественной желудочковой экстрасистолии у пациентов через 2 недели после терапии клетками, культивированными в телячьей сыворотке; в 40% случаев это осложнение требует применения имплантируемых дефибрилляторов.

4. Способ получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников

В следующем аспекте изобретение относится к способу получения композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, включающему инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в аутологической среде культивирования по изобретению и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.

Практически любая аутологическая человеческая стволовая клетка-предшественник может быть подвергнута культивированию и развитию в аутологической среде культивирования по изобретению, при условии адаптации в каждом случае условий среды и культивирования к конкретному клеточному типу. Однако в одном из вариантов осуществления, который будет описан более подробно в следующем разделе, такие аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники представляют собой аутологические человеческие стволовые клетки - предшественники мышечных.

Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники могут быть получены путем биопсии у соответствующего пациента, являющегося объектом последующей имплантации таких аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников.

Инкубацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников в аутологической среде культивирования по изобретению проводят в условиях, обеспечивающих возможность роста и деления клеток.

Очистка полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников может быть проведена любым традиционным способом. В частности, очистка упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников включает иммуноочистку путем использования специфических и селективных антител к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам, что дает возможность идентификации упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе характерных внеклеточных антигенов. Предпочтительно, упомянутые специфические и селективные антитела к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам соединяют с магнитными микросферами для очистки и обогащения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников при помощи магнитного клеточного сепаратора.

Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники, полученные описанным выше способом, могут быть введены в состав фармацевтических композиций и могут быть использованы в генной терапии.

5. Способ получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных

Как указано выше, в отдельном и предпочтительном варианте осуществления данного изобретения аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники представляют собой аутологические человеческие стволовые клетки, являющиеся предшественниками мышечных или миогенных клеток.

Поэтому в следующем аспекте изобретение относится к способу получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, пригодных для использования в клеточной терапии, который включает инкубацию упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в упомянутой среде культивирования и очистку полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных.

Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных могут быть получены путем биопсии у соответствующего пациента, являющегося объектом последующей имплантации таких аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, в частности биопсии скелетных мышц.

Предшествующими исследованиями установлено, что введение пациенту перед осуществлением биопсии, в области биопсии, фармацевтической композиции, включающей фармацевтический препарат, стимулирующий пролиферацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, обеспечивает возможность увеличения количества упомянутых клеток при инициации культуры. В частности, такая предварительная обработка осуществляется путем внутримышечного введения пациенту перед проведением биопсии скелетных мышц, обычно в течение периода от 2 дней до 15 минут перед осуществлением биопсии, в области проведения биопсии, фармацевтической композиции, включающей упомянутый фармацевтический препарат, стимулирующий клеточную пролиферацию. В частности, упомянутый фармацевтический препарат представляет собой местный анальгетик, такой как лидокаин или бупивакаин, стимулирующий пролиферацию миобластов, что впоследствии обеспечивает более высокую эффективность культивирования клеток.

Путем биопсии скелетных мышц извлекают образец мышечной ткани, который подвергают обычной обработке для расщепления мышечных волокон, как описано ниже. Полученную клеточную суспензию культивируют в аутологической среде культивирования по изобретению. Вообще говоря, образец, извлеченный путем мышечной биопсии, содержит различные типы тканей, например адипоциты, фибробласты, предшественники мезенхимы, гемопоэтические клетки, мышечные волокна, васкулярную ткань (эндотелий, гладкие мышцы) и, безусловно, миобласты и клетки-сателлиты. Обычно исходное содержание аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в образце скелетной мышцы, извлеченном путем биопсии, которые имеют фенотип, определяемый как CD56+/CD45-, составляет менее 10%. Подобным образом присутствует также небольшая доля стволовых клеток (клеток-сателлитов), трудно поддающихся идентификации, которые воспроизводят сами себя и дифференцируются в клетки, которые экспрессируют антиген CD56 и могут быть предшественниками мышечных клеток. Как известно, процесс дифференциации этого клеточного типа включает этап развития клетки-сателлита в миобласт, затем в незрелый миоцит, позднее в зрелый миоцит, и наконец, в мышечное волокно. Предшественниками мышечных клеток могут быть миобласты и миоциты (зрелые и незрелые), которые могут быть идентифицированы на основе присутствия антигена CD56, интрацитоплазматической экспрессии десмина и отсутствия антигена CD45 (то есть, они показывают фенотип СВ56+/десмин+/СD45-). Во время культивирования клеток происходит пролиферация клеток-сателлитов и миобластов, которые к этому времени превращаются в миоциты. Таким образом, после инкубации и развития клеток в среде культивирования накапливаются миобласты и миоциты (зрелые и незрелые), используемые в изготовлении фармацевтической композиции для инъекции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных пациенту, которые, после инъекции завершают процесс дифференциации в организме пациента, превращаясь в мышечные волокна или миоволокна и развивая свою функцию.

Инкубацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в аутологической среде культивирования по изобретению осуществляют в условиях, обеспечивающих возможность развития клеток (роста и деления).

Очистка полученных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных может быть проведена любым традиционным способом. В частности, очистка упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников включает иммуноочистку путем использования специфических и селективных антител к таким аутологическим человеческим стволовым клеткам-предшественникам, что дает возможность идентификации упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе характерных внеклеточных антигенов, например антител к человеческому CD56 (CD56 представляет собой внеклеточный антиген, характерный для скелетных мышц) в отсутствие специфического антигена гемапоэтической клетки CD45 (т.е. отбираются клетки, показывающие фенотип CD56+/CD45-).

Предпочтительно, упомянутые антитела соединяют с магнитными микросферами для очистки и обогащения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных при помощи магнитного клеточного сепаратора. В другом варианте осуществления клеточную культуру подвергают стадии предварительного посева с целью осаждения фибробластов перед проведением идентификации и выделения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных. В этом случае очистка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных включает стадию предварительного посева клеточной культуры с целью осаждения всех или части фибробластов, присутствующих в упомянутой клеточной культуре, и затем идентификацию и выделение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных путем использования антител к человеческому CD56, соединенных обычным способом с магнитными микросферами, и селекцию клеток, показывающих фенотип CD56+/CD45-.

Композиция, включающая аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, полученные вышеупомянутым способом, представляет собой дополнительный аспект данного изобретения.

В альтернативе, изобретение относится к способу получения аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, начиная с тканевой биопсии скелетных мышц, для приготовления фармацевтической композиции, который включает:

a) проведение биопсии у пациента, являющегося объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, для извлечения фрагмента ткани скелетных мышц, содержащего аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных;

b) культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из скелетных мышц в аутологической среде культивирования по изобретению в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных;

c) очистку упомянутых культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и

d) сбор упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и, возможно,

e) замораживание упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных до изготовления такой фармацевтической композиции.

Как указано выше, местное введение пациенту, в течение периода от 2 дней до 15 минут перед осуществлением биопсии, в области проведения биопсии, лидокаина или бупивакаина стимулирует пролиферацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных и позволяет увеличить количество таких клеток при инициации культуры.

Культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из скелетных мышц в аутологической среде культивирования по изобретению в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, включает проведение ряда предварительных обычных процедур обработки, например промывки, удаления жировой ткани, разделения мышц, ферментативного расщепления, фильтрации и сбора клеток, например, путем осаждения. Как правило, после ферментативного расщепления мышечных волокон образуется клеточная суспензия, содержащая большое количество клеточных обломков. После стадий культивирования обломки клеток и волокон удаляют и обогащают суспензию стволовыми клетками-предшественниками мышечных.

Очистку культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных проводят, кроме всего прочего, для получения композиций, обогащенных аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных, которые, по существу, не содержат фибробластов. С этой целью клеточная культура может быть подвергнута первой стадии предварительного посева, в результате которой фибробласты осаждаются быстрее, чем миобласты или клетки-сателлиты, и последующему процессу идентификации и выделения упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных любым общепринятым способом, например путем использования специфических и селективных антител к таким клеткам, что дает возможность идентификации на основе внеклеточных антигенов упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, показывающих фенотип CD56+/CD45-, при помощи антител, которые специфически узнают такие аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, соединенных обычным способом с магнитными микросферами.

В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, вместе с, по меньшей мере, одним наполнителем, приемлемым с фармацевтической точки зрения. В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция пригодна для парентерального введения. В принципе, любой наполнитель, приемлемый с фармацевтической точки зрения и способный доставлять аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, может быть использован в данном изобретении. В одном из вариантов такая фармацевтическая композиция включает альбумин, используемый в качестве наполнителя для поддержания аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных в виде суспензии.

В данном изобретении выражение "фармацевтическая композиция" относится к композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, подготовленной для терапевтического применения в клеточном имплантате, содержащей, по меньшей мере, 20 миллионов клеток, при плотности клеток, по меньшей мере, 50 миллионов клеток/мл и, по меньшей мере, 40% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/CD45-, аутологическую среду культивирования по изобретению и, по меньшей мере, один наполнитель, приемлемый с фармацевтической точки зрения. В одном из вариантов осуществления, такая фармацевтическая композиция содержит от 20 до 200 миллионов клеток при плотности клеток от 50 до 70 миллионов клеток/мл, и, по меньшей мере, 70% аутологических стволовых клеток-предшественников CD56+/CD45-, аутологическую среду культивирования по изобретению и человеческий альбумин в количестве от 0,1% до 20 вес.% от общего веса.

Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, полученные способом, описанным выше, а также содержащие их фармацевтические композиции могут быть использованы в приготовлении фармацевтической композиции:

для восстановления и/или воссоздания ткани сердечной мышцы, и/или

для лечения постишемической сердечной недостаточности, и/или

для лечения дилатационной кардиомиопатии и/или

для лечения неишемической кардиомиопатии.

6. Терапевтическая методика

Согласно следующему аспекту данное изобретение относится к терапевтической методике проведения аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, способные регенерировать сердечную ткань, выращенные и поддерживаемые ex vivo в аутологической среде культивирования; при этом упомянутая методика включает отбор образца материала у пациента, являющегося объектом последующей имплантации, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, увеличение количества таких клеток путем культивирования в аутологической среде культивирования по данному изобретению и имплантацию аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, отобранных у пациента, у которого предварительно был извлечен упомянутый материал, содержащий аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных.

В частности, изобретение относится к терапевтической методике проведения аутологической клеточной СМР для образования, регенерации и восстановления дисфункциональной ткани миокарда путем имплантации фармацевтической композиции, включающей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных, регенераторы сердечной ткани, поддерживаемые ех vivo после выращивания в аутологической среде культивирования; при этом упомянутая методика включает следующие этапы:

а) биопсия скелетной мышцы у пациента, предпочтительно, с предварительной обработкой путем внутримышечной инъекции местного анестетика, такого как лидокаин или бупивакаин;

b) приготовление среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников на основе аутологической сыворотки пациента;

c) изготовление композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных на основе биопсии а) и среды культивирования b);

d) изготовление фармацевтической композиции на основе композиции с); и

e) имплантация фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда.

Аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных включают миобласты и миоциты (зрелые и незрелые) и обладают способностью восстанавливать сердечную ткань при их имплантации в сердечную мышцу.

В данном описании выражение "пораженные участки миокарда" относится как к ишемической, так и к идиопатической кардиомиопатиям. В частном варианте осуществления методика проведения аутологической клеточной СМР по изобретению применяется для пациентов с ишемической кардиомиопатией вследствие инфаркта миокарда, для которых невозможна хирургическая или подкожная реваскуляризация, а также для пациентов с альтернативной сердечной реваскуляризацией. Цель такой аутологической клеточной СМР - ограничение развития инфаркта, реконструкция сердечной ткани и регенерация миокарда. Определение пациентов с ишемической кардиомиопатией включает пациентов с инфарктом правого или левого желудочков, причем в последнем случае - с возможностью ишемической регургитации митрального клапана. В другом варианте осуществления методику аутологической клеточной СМР по изобретению применяют для пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией.

Преимущества клеточной СМР включают снижение фиброза, уменьшение рубцовой области инфаркта и улучшение эластичности и свойств стенки желудочка (что существенно для восстановления диастолической функции).

В одном из вариантов осуществления имплантацию фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда выполняют путем прямой инъекции. Выражение "имплантация путем прямой инъекции" в данном изобретении означает эпикардиальное или эндоваскулярное введение фармацевтической композиции по изобретению пациентам с ишемической или идиопатической кардиомиопатиями. В одном из вариантов осуществления ее выполняют путем эпикардиального или эндоваскулярного введения фармацевтической композиции по изобретению пациентам с ишемической кардиомиопатией, с распределением следующим образом: около 70% - в периферическую область инфарктного рубца и 30% - примерно в центральную часть рубца. Эпикардиальное введение может быть выполнено при помощи обычного хирургического обнажения или путем торакоскопии. При хирургическом подходе (классическом или миниторако/стернотомии) ишемическую область обнажают в достаточной мере для возможности проведения инъекций терапевтической композиции в область инфаркта и, главным образом, в окружающие области. Инъекция фармацевтической композиции, содержащей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных по данному изобретению, также может быть сделана в периферическую область поражения. При таком распределении имплантации по изобретению достигают максимального выживания имплантированных клеток в периферической области за счет остаточного орошения и существующей коллатеральной реваскуляризации миокарда и, в некоторой степени, избегают высокой смертности клеток, наблюдаемой в имплантатах, введенных в высокофиброзную ткань ишемического рубца.

В другом варианте осуществления имплантат фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда осуществляют путем системного или интракоронарного введения через подкожный венозный доступ.

В следующем варианте осуществления методику аутологической клеточной СМР по изобретению применяют для пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией путем осуществления нескольких имплантаций фармацевтической композиции по изобретению между коронарными артериями в миокарде обоих желудочков.

Сегодня мы располагаем новыми компьютеризованными системами для хирургии сердца. Увеличивается количество роботизированных операций по коронарному шунтированию путем торакального доступа, так как они обеспечивают возможность быстрого и безопасного излечения пациента при сниженном риске инфекции и отличном косметическом результате. В одном из вариантов осуществления при помощи видеоконтролируемого манипулятора в миокард вводят иглу, снаружи торакса размещают шприц и соединяют его с иглой при помощи пневмокамеры малого размера. Преимущество такого подхода при лечении пациентов с сердечной недостаточностью заключается в том, что терапевтическая методика аутологической клеточной СМР может выполняться безопасно, без манипуляций с сердцем, что устраняет риск гемодинамических изменений и фибрилляции желудочков.

Благоприятный эффект клеточной СМР может быть ограничен коэффициентом смертности инъецируемых клеток. Для решения этой проблемы в данном изобретении предлагается осуществление периодических инъекций при помощи методик подкожной или хирургической имплантации аутологических стволовых клеток-предшественников по изобретению. Такой подход будет способствовать достижению цели СМР за счет постепенного уменьшения поврежденных областей инфаркта или восстановления патологического миокарда. С этой целью изобретение включает создание специализированного банка аутологических стволовых клеток-предшественников каждого пациента, полученных из выделенных и замороженных клеток во время процедуры культивирования, проведенной для каждого пациента. Из сохраненных в банке аутологических стволовых клеток-предшественников могут быть выращены новые клеточные культуры для изготовления новых композиций, без проведения новой биопсии или извлечения ткани.

Следующие примеры приведены для иллюстрации изобретения и должны рассматриваться лишь как неограничивающие примеры.

Пример 1

В данном примере описаны получение и обработка аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных для использования в аутологических клеточной СМР с целью восстановления поврежденной дисфункциональной ткани миокарда в живой тканевой структуре, способной производить систолическое и диастолическое давление.

1.1 Биопсия скелетных мышц

За день до проведения хирургической биопсии пациенту вводят путем внутримышечной инъекции 2%-ный раствор лидокаина в переднелатеральную часть группы мышц бедра и окружающие ткани. Биопсию проводят путем 5 см разреза в переднелатеральной части группы мышц бедра и извлечения в стерильных условиях фрагмента 2-3 см³ скелетной мышцы (15 г). Извлеченную мышечную ткань сразу же разрезают на кусочки ножницами, помещают в полную среду культивирования или в раствор фосфатного буфера (PBS) и выдерживают при 4°С. Процедуру выделения и очистки клеток и их культивирование необходимо начинать как можно скорее, чтобы гарантировать выживание клеток. Образцы отправляют в лабораторию биологии клетки в подходящем контейнере и при низкой температуре.

1.2 Приготовление аутологической среды культивирования

Из образцов крови

В службе переливания крови у пациента отбирают венозную кровь. Путем венопункции наполняют 50 10-мл пробирок для сбора сыворотки. После осаждения клеток и выпадения фибрина, в условиях камеры ламинарного потока, сыворотку экстрагируют из каждой пробирки и собирают в пустой баллон для крови. Отбирают образцы сыворотки для гематологических и микробиологических исследований (на бактерии и вирусы). Баллон с сывороткой замораживают при -80°С до получения результатов гематологических и микробиологических исследований.

Перед приготовлением среды культивирования подвергают тепловой инактивации комплемент сыворотки при 56°С в течение 1 часа и после этого производят фильтрацию. Часть сыворотки объединяют со средой культивирования и выдерживают при 4°С, затем нагревают до 37°С и фильтруют перед введением клеточной культуры. Конечная среда культивирования содержит 10% аутологической человеческой сыворотки пациента, 89% среды HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765), 1% пенициллина/стрептомицина, гепарин (2 МЕ/мл собранной сыворотки), протамин (в виде сульфата), (3 МЕ/мл собранной сыворотки) и, возможно, амфотерицин В (0,25 мг/мл) и/или 0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFGF.

Остальную человеческую сыворотку замораживают при -40°С до приготовления новой среды культивирования. В каждом препарате среды культивирования комплемент снова инактивируют при 56°С в течение 1 часа с последующей фильтрацией.

Из плазмофереза

Сразу после осуществления плазмофереза пациенту вводят дозу 50 МЕ/кг нефракционированного гепарина натрия. Процедуру плазмофереза проводят в соответствии со стандартной методикой, применяемой для данного оборудования. Во время плазмофереза стандартный антикоагулянт заменяют физиологическим раствором 0,9% хлорида натрия с гепарином в качестве антикоагулянта. Плазму заменяют альбумином с концентрацией 5%. Процедуру завершают сразу после получения объема плазмы, необходимого для приготовления аутологической среды культивирования. Количество гепарина в собранной плазме рассчитывают в соответствии с объемом плазмы пациента и добавляют 1,5 МЕ протамина на каждую ME гепарина. Плазма находится в таком виде до коагуляции. Затем сыворотку выделяют, распределяют в виде небольших аликвот и замораживают. Так же как и для сыворотки, полученной из образцов крови, в этом случае образцы сыворотки также подвергают гематологическому и микробиологическому анализу перед использованием.

1.3 Выделение клеток-сателлитов и выращивание in vitro

Все виды обработки проводят в асептических условиях и с использованием камеры с ламинарным потоком. Фрагменты извлеченной скелетной мышцы промывают в PBS. Жировую ткань удаляют ножницами и осторожно разделяют мышечные волокна. Фрагменты мышцы снова промывают в PBS, пока надосадочный слой не станет визуально чистым. Ткань центрифугируют 5 минут при 100 g. Затем ткань расщепляют путем двух последовательных ферментативных обработок: сначала клетки инкубируют в коллагеназе IA (1,5 мл/мг/г ткани) в течение 1 часа. Каждые 10 минут пробирки взбалтывают для механического содействия расщеплению. Либо пробирки помещают в инкубатор с возвратно-поступательным/орбитальным взбалтыванием (ROSI) при 37°С. Затем клетки инкубируют в течение 20 минут с 0,25 трипсина 1 Х EDTA (2 мл). Сразу после этого клетки промывают (10 минут при 300 g) и для прекращения ферментативной реакции добавляют 1 мл соответствующей сыворотки пациента, полученной ранее. Проводят фильтрацию через сетку с ячейкой 40 мкм (нейлоновый клеточный фильтр). Для фрагментов, которые могли остаться в сетке, процедуру расщепления повторяют снова. Наконец, клетки, полученные после фильтрации, собирают путем осаждения (20 минут при 300 g), а супернатант выбрасывают.

Клетки пересуспендируют в свежей полной среде культивирования: 10% аутологической человеческой сыворотки пациента, 89% среды HAM-F12 (GIBCO-BRL, Cat. No.21765), 1% пенициллина/стрептомицина и, возможно, амфотерицин В (0,25 мг/мл), дополнительно содержащей гепарин (2 МЕ/мл собранной сыворотки) и протамин (в виде сульфата) (3 МЕ/мл собранной сыворотки), и высевают в колбы для клеточной культуры. Затем колбы инкубируют в течение 3 недель при 37°С при влажности 5%. Колбы помещают в инкубатор без наклона во избежание неправильной пролиферации клеток. После 2-3 дней инкубации инкубацию возобновляют в среде для удаления кровяных клеток и мертвых клеток. После выращивания клеток до субконфлюэнции (50% смыкания монослоя) осуществляют один этап культивирования (фракция 1:5) во избежание появления миогенной дифференциации при высоких плотностях. Понадобится проведение нескольких этапов 50%-х конфлюэнций для предотвращения дифференциации моноядерных клеток в многоядерные мышечные трубочки.

На каждом этапе культивирования клетки собирают путем трипсинизации (2 мл 2,5 трипсина/этилендиаминтетрауксусная кислота в каждой колбе в течение 1-5 минут в инкубаторе). Полное отделение клеток проверяют путем наблюдения в микроскопе плавающих клеток. Затем реакцию прекращают путем добавления полной среды культивирования и суспензию полученных клеток распределяют в 5 новых колб. На каждом этапе культивирования клеток проводят исследование на бактерии (анализ на аэробные и анаэробные бактерии), вирусы и грибы.

1.4 Удаление фибробластов

Как правило, культуры загрязнены фибробластами, поэтому для их удаления необходимо добиться соответствующего увеличения объема миобластов. При проведении первого пассажа и после нейтрализации трипсином культивируемые клетки выдерживают в инкубаторе в течение 30 минут. Этого времени достаточно для осаждения фибробластов, в то время как большинство миобластов (более мелких) остаются в суспензии. Клеточный супернатант собирают и переносят в новые колбы для культивирования. Степень чистоты миобластов измеряют проточным цитометром с человеческим антителом к CD56 и окраской на десмин. Образцы со степенью чистоты миобластов менее 50% подвергают процедуре клеточного обогащения. С этой целью на второй стадии, после сбора клеток и перед их посевом, их обрабатывают мышиным антителом анти-CD56 (человека), соединенным с магнитными микросферами. Путем положительной селекции при помощи магнитного сепаратора клеток получают клеточные популяции, обогащенные в высокой степени миобластами, предшественниками мышечных клеток, более чем в 90% которых экспрессируется CD56 и десмин.

Обычно для получения необходимого количества клеток необходимо провести несколько пассажей. Как правило, примерно к концу 3 недели получают более 200 миллионов клеток. Это количество может быть увеличено пассажами в многоцепьевой системе культивирования.

1.5 Выделение клеток для специализированного банка

Во время культивирования клеток для каждого пациента может быть выделено некоторое количество клеток, которые могут быть заморожены. Из этих сохраненных клеток могут быть выращены новые клеточные культуры для осуществления периодических повторных интрамиокардиальных инъекций (что позволит избежать повторения процедур биопсии). Во время второго пассажа некоторые образцы обогащенных клеток, положительных на CD56, подвергают криоконсервации с использованием 5% диметилсульфоксида (DMSO), при условии запрограммированного замораживания и, наконец, хранят в жидком азоте. Концентрация клеток должна составлять 25-50 миллионов клеток на 1 мл. В случае необходимости клетки размораживают и культивируют в среде для миобластов для последующего использования (подкожной имплантации) после выращивания ex vivo.

1.6 Инъекционная среда

В день клеточной имплантации клетки собирают и промывают в инъекционной среде (человеческий альбумин 0,5% и полная среда культивирования) и сохраняют до имплантации на льду. Проточным цитометром измеряют конечную степень чистоты миобластов. С использованием цитометра Malassez (путем окрашивания трипановым синим) определяют концентрацию и жизнеспособность клеток. Кроме того, перед имплантацией оценивают стерильность клеточной культуры (грам-тест).

1.7 Методика культивирования клеток

Имплантация клеток может быть выполнена путем эпикардиального или эндоваскулярного введения. Эпикардиальное введение может быть выполнено путем хирургического вмешательства или путем торакоскопии. При хирургическом вмешательстве (классическом или миниторако/стернотомии) ишемическую область обнажают в достаточной мере для возможности осуществления около 10 инъекций клеточной суспензии в области инфаркта и, главным образом, в окружающую область. Для этой цели используют изогнутую иглу калибра 23-26G×4 см. Рекомендуемая плотность клеток составляет 50-70 миллионов клеток/мл. Инъекцию выполняют медленно, около 15 минут. После каждой инъекции отверстия иглы должны быть заблокированы путем надавливания (1-2 минуты) во избежание регургитации клеточной суспензии.

Протокол имплантации миобластов:

- имплантат, по меньшей мере, 20 миллионов клеток, предпочтительно ˜200 миллионов клеток;

- плотность клеток: 50-70 миллионов клеток на 1 мл;

- время культивирования: ˜21 день;

- концентрация миобластов: выше 70%;

- средняя продолжительность жизни клеток при 2-8°С: 96 часов.

Пример 2

В данном примере описаны клинические испытания фазы I/II, проводимые для оценки пригодности и безопасности интрамиокардиальной трансплантации композиции аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных по изобретению пациентам, перенесшим инфаркт миокарда.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ

2.1 Отбор пациентов

В исследовании участвовали 12 пациентов, которые ранее перенесли инфаркт миокарда, по меньшей мере, за 4 недели до их включения в протокол, и таких, которые ожидали аортокоронарного шунтирования. При отборе пациентов в расчет принимали возраст (приемлемый - в диапазоне 30-80 лет), сердечную функцию (фракции выброса левого желудочка выше 25%) и отсутствие злокачественной аритмии или анамнеза мышечной дистрофии, а также отсутствие положительного результата в тестах на печеночную или почечную дисфункцию, беременность, ВИЧ или гепатит.

2.2 Мышечная биопсия, культивирование и идентификация аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных

Получение аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных для терапевтической композиции осуществляли по описанию в Примере 1.

Мышечную биопсию выполняли в переднелатеральной части группы мышц бедра в стерильных условиях и после предварительной обработки лидокаина гидрохлоридом. Во время операции использовали аутологическую среду культивирования клеток человека по изобретению, содержащую 79% среды НАМ F12 (GIBCO-BRL). Аутологическую сыворотку пациента получали путем плазмофереза, как описано в пункте 1.2 предыдущего примера, который проводили за день до проведения мышечной биопсии (от 800 до 2135 мл на пациента, в среднем 1735 мл).

Для выделения клеток-сателлитов проводили ферментативное расщепление путем инкубации с трипсином/EDTA (0,5 мг/мл и 0,53 мл EDTA, GIBCO-BRL) и затем с коллагеназой (0,5 мг/мл GIBCO-BRL). Методика выращивания клеток и удаления фибробластов описана в предыдущем примере. Степень чистоты миобластов в собранных клетках измеряли проточным цитометром и окраской по специфическим моноклональным антителам к человеческому N-CAM (CD56), CD45 и десмину.

Среднее число миогенных клеток, полученных на 1 пациента, составляло 221×10⁶ (всегда в диапазоне 105-390×10⁶), а средняя степень чистоты миогенных клеток CD56+/CD45 составляла 65,6±6,4%.

2.3 Трансплантация клеток

Перед хирургической операцией у каждого пациента определяли функцию и жизнеспособность сердечной мышцы путем позитронной эмиссионной томографии (PET), эхокардиограммы и электрокардиограммы (Holter EGC 24 часа). Аортокоронарное шунтирование с экстракорпоральным кровообращением проводили через 3-4 недели после проведения мышечной биопсии. Пациенты получили в среднем 2 трансплантаци (от 1 до 4).

После наложения всех швов и восстановления самопроизвольного сердечного сокращения проводили клеточную имплантацию путем эпикардиального введения, по меньшей мере, 10 повторных инъекций в области инфаркта и окружающие области, которые с электрокардиографической точки зрения были идентифицированы как гипокинетические, акинетические или дискинетические. Для инъекций использовали глазную канюлю калибра 23G (Maersk Medical Ltd. Redditch, B98 9NL GB). Области, в которые должен был быть введен клеточный имплантат, идентифицировали перед хирургической операцией путем эхокардиограммы, чтобы оценить сократимость упомянутых областей во время последующего наблюдения за клеточной трансплантацией.

После хирургической операции пациенты находились под постоянным телеметрическим наблюдением. Образцы крови отбирали каждые шесть часов для выявления сердечных некротических ферментов. Для предотвращения воспаления после операции вводили метилпреднизолон (500 мг). Для предотвращения сердечных аритмий проводили 3-месячное лечение амиодароном перорально. Для оценки реакции на проведенную кардиомиопластику осуществляли последующее врачебное наблюдение посредством PET (через 3 месяца после трансплантации), эхокардиограммы (через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации). Кроме того, оценивали наличие аритмий посредством Holter-ECG (через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации).

Протокол и все проведенные процедуры были предварительно одобрены этическим комитетом института и региональным этическим комитетом по клиническим испытаниям в соответствии с требованиями закона.

Эхокардиографические исследования. Общую и регионарную сократимость миокарда измеряли путем двумерной эхокардиографии (при помощи ультразвуковой системы Sonos 5500, Phillips). Анализ регионарного движения стенки левого желудочка выполняли по методике, описанной в Standards Committee of the Amercan Society of Echocardiography (Schiller NB et al, J AM Soc Echocardiogr. 1989; 2:358-367): левый желудочек разделили на 16 фрагментов и оценивали для каждого сегмента движение стенки как 1 = нормальное, 2 = гипокинезия, 3 = акинезия, 4 = дискинезия. Индекс регионарной подвижности (бальный индекс движения стенки, WMSI) определяли как сумму индексов всех сегментов, деленную на количество оцененных сегментов. Индекс WMSI получили для сегментов, обработанных клеточным имплантатом и отдельно - для необработанных сегментов. Фракцию выброса левого желудочка (LVEF) получали при помощи системы автоматического определения границы между кровью и эндокардом (автоматическое определение границы ABD) (Perez JE et al, J. Am. Coll. Cardiol. 1992; 19:336-344). Также оценивали регионарную сократимость каждого сегмента при помощи технологии ColorKinesis и ультразвукового анализа ткани по Доплеру. Оценки выполняли в виде двойного слепого испытания (2 независимых наблюдателя, не обладающих предварительной информацией). Воспроизводимость в испытании для конечного диастолического объема в левом желудочке составила 2,8±6,4 (коэффициент вариации 5,5%), а для фракции выброса (LVEF) 0,3±4,6 (коэффициент вариации 6,6%).

Позитронная эмиссионная томография (PET). При помощи PET оценивали кровоток в миокарде и метаболизм глюкозы, до хирургической операции и через 3 месяца после клеточной трансплантации.

Оценку перфузии и метаболизма проводили в РЕТ-томографе (ЕСАТ EXACT HR+, Siemens/CTI knoxville, USA), который обеспечивает 62 трансаксиальных среза с пространственным разрешением между планами 4,5 мм. Метки для исследования метаболизма глюкозы (¹⁸F-FDG) и для перфузии (¹³N-аммоний) получали в циклотроне (циклон 18/9, Ion Beam Applications, Бельгия) и в лаборатории радиофармпрепаратов данного центра.

Протокол получения снимков каждого пациента осуществляли в виде 2-минутного пропускания германия-68 для локализации сердца в поле наблюдения, а затем 5-минутного пропускания для выполнения поправки на фотонное затухание. Сразу после этого начинали перфузию ¹³N-аммония (9,25μКи/кг, максимум 740μКи) путем внутривенной инъекции с постоянной скоростью 10 мл/мин. Получение динамических данных начинали в момент инъекции. Получение снимков в динамической последовательности осуществляли в течение 20 минут по схеме переменной длительности: 12×10 с, 4×10 с, 4×30 с, 3×300 с. Получение данных PET осуществляли в соответствии с протоколом, описанным в библиографии (Muzik О et al. J. Nucl. Med. 1993; 34:336-344). После накопления снимков для оценки перфузии оставляли 50 минут на физическое затухание радиоактивности ¹³N-аммония (период полураспада 9,9 минут). Затем начинали получение данных метаболического превращения глюкозы с использованием эугликемического гиперинсулинемического клэмп-теста (Knuuti MJ et al, J. Nucl. Med. 1992; 33:1255-1262). ¹⁸F-FDG вводили путем внутривенной инъекции, после стабилизации уровней глюкозы в диапазоне 85-95 мг/децилитр, ударной дозы 4,6 μКи/кг, максимум 370μКи. Получение последовательных снимков ¹⁸F-FDG начинали в момент инъекции и продолжали в течение 60 минут (8×15 с, 2×30 с, 2×120 с, 1×180 с, 4×300 с, 3×600 с) в соответствии с протоколом, описанным Knuuti et al, см. выше.

После получения снимков выполняли сегментацию пропускания, до коррекции экранирования, снимки метаболического испытания реконструировали с использованием метода OSEM (максимизация ожидания упорядоченных подгрупп) с двумя повторностями и 8 подгруппами. Ко всем опытам (и перфузии, и метаболизму) применяли фильтр Гаусса (сглаживающий фильтр Гаусса) с 6 мм FWHM (полная ширина полумаксимального объема). Для обычного анализа трансаксиальные снимки переориентировали относительно короткой оси, вертикальной длинной оси и горизонтальной длинной оси левого желудочка.

Наконец, для количественного анализа использовали 6 смежных секций средней области левого желудочка по короткой оси. Кровоток в миокарде рассчитывали в виде абсолютных скоростей в соответствии с 3-компартментной моделью (Muzik О et al. J. Nucl. Med. 1993; 34:83-91), а скорости использования глюкозы (скорости использования глюкозы в миокарде, rMGU) оценивали путем графического анализа Патлака (Patlak CS et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1985; 5:584-590).

РЕЗУЛЬТАТЫ

2.4 Клеточная трансплантация и послеоперационное развитие

Демографические, клинические и функциональные особенности пациентов, участвовавших в испытании, приведены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1
Особенности пациентовПациентВозрастПолЛокализация инфарктаРазвитие (месяцы)Симптомы локального инфаркта по классификации NYHAЛокализация шунтированиястенокардия/одышкабазовые данные/FU163МПередняя4Нестабильное ЛПIII/IILAD, RC, ОМ264МПередне-вер хушечная6III/IIII/ILAD, ОМ340МНижняя5Нестабильное /IIII/IRC, LAD,455МПередняя23II/III/ILAD, RC, ОМ568МПередне-вер хушечная168III/IIIIII/IILAD, RC, ОМ674жПередняя10/IIIIII/IIILAD769МНижняя125Нестабильное/IIIII/LAD, RC, OM, Dg871МНижняя108Нестабильное/IIII/ILAD, OM956МПередняя120III/IILAD, Dg, OM1074МНижняя20III/IIII/LAD, OM, Dg, RC1168МПередняя3I/II/ILAD, RC, OM1273МПередне-вер хушечная146III/IIIIII/IILAD, Dg, OM

Аббревиатуры:

Пол: М - мужской; F - женский

Классификация NYHA: Классификация Кардиологической Ассоциации Нью-Йорка.

FU (КН): Контрольное наблюдение, проведенное через 3 месяца после хирургической операции и клеточной трансплантации.

Локализация шунтирования: LAD - левая передняя нисходящая артерия; RC - правая коронарная артерия; М - ветвь тупого края; Dg - диагональная коронарная артерия.

Во время операции аортокоронарного шунтирования, после окончания пересадки и восстановления самопроизвольного сокращения сердца, визуализировали область, пораженную инфарктом, и вводили путем инъекции раствор объемом 3-5 мл, содержащий миогенные клетки при концентрации 20×10⁶ клеток/мл. Области инъекции идентифицировали для последующего эхокардиографического наблюдения. Перед осуществлением трансплантации, сразу после сбора клеток для упомянутой трансплантации, выполняли микробиологическое культивирование для предотвращения заражения культур. По этой причине пациенту №9 не была сделана трансплантация, так как его клеточные образцы показали положительное окрашивание в грам-тесте на стерильность. Тем не менее, данные этого пациента также включили в протокол для последующего наблюдения.

Таблица 2
Особенности пациентовПациентМышечная биопсия (г)К-во имплантированных миогенных клеток (×10⁶)Базовая LVEF, 2D/ABDLVEF во время КН, 2D/ABD11031835/3755/5621316540/4550/5337,519245/4670/654739340/4762/6651020027/2640/506911030/3840/4879,517140/38нет КН85,510540/4247/5199045/4035/38101439025/29нет КН111010040/4351/491211,318043/4146/45

Аббревиатуры:

LVEF - фракция выброса левого желудочка.

КН - Контрольное наблюдение, проведенное через 3 месяца после хирургической операции и клеточной трансплантации.

2D - двумерная эхокардиограмма; ABD - автоматическое определение границы между кровью и эндокардом.

Послеоперационное развитие пациентов с имплантированными клетками проходило без осложнений. Поскольку в предшествующих клинических исследованиях были обнаружены сердечные аритмии, связанные с трансплантацией миогенных клеток скелетной мышцы, то пациенты находились под наблюдением во время госпитализации (непрерывная телеметрия), а также проходили наблюдение через 40 дней и через 3 месяца после трансплантации (посредством Holter-ECG, 24 часа). Ни в одном случае не было обнаружено существенного увеличения аритмий. Более того, после трансплантации было уменьшено число преждевременных сокращений желудочка. Однако у пациента №6 развилась кратковременная вентрикулярная тахикардия через 40 дней после операции. Этот пациент во время операции был подвергнут аневризмэктомии, что могло быть причиной такого явления.

Серологический анализ сердечных и печеночных ферментов не показал существенных изменений после трансплантации, и их количество постепенно возвращалось к нормальным значениям. В качестве косвенного показателя воспаления измеряли протеин С, при этом существенных изменений не произошло ни после трансплантации, ни во время последующего наблюдения.

Все пациенты покинули больницу и в настоящее время живы.

2.5 Функция левого желудочка

Среднее значение фракции выброса левого желудочка, измеренное при помощи двумерной эхокардиографии, увеличилось с 35,5±2,3% (среднее ± стандартная ошибка) перед операцией до 53,5±4,98% через 3 месяца после трансплантации (р<0,05). Общая сердечная сократимость, измеренная эхокардиографически на основе автоматического определения границы между кровью и эндокардом (ABD), увеличилась с 39,8±3,26% до 56,3±3,1% (р<0,05) (Фиг.1).

Также отмечено улучшение регионарной сократимости, продемонстрированное снижением среднего количества акинетических/гипокинетических/дискинетических сегментов с 7 (в диапазоне от 5 до 10, до операции) до 3 (в диапазоне от 0 до 5 через 3 месяца после трансплантации).

Базовый индекс регионарной подвижности WMSI, в среднем 1,72±0,14, снизился через 3 месяца после трансплантации до 1,25±0,07 (р<0,05) (Таблица 3). Для проведения различий между потенциальными преимуществами для сердечной функции, обеспечиваемыми трансплантацией миогенных клеток, и преимуществами, обеспечиваемыми реваскуляризацией, сравнивали улучшение индексов WMSI для сегментов, получивших клеточный трансплантат, и для сегментов, не получивших клеточного трансплантата. Индексы WMSI существенно снизились через 3 месяца по сравнению с базовыми индексами (до операции), причем большее снижение произошло в сегментах, которые получили клеточный трансплантат (Таблица 3).

Снижение WMSI связано с улучшением по классификации NYHA, от базового значения 2,2±0,2 до 1,5±0,26 - значения через 3 месяца (р<0,01).

Таблица 3
Регионарная функция (на основе WMSI, балльного индекса движения стенки) Базовая величинаЧерез 40 днейЧерез 3 месяцаРОбщая величина1,73±0,071,40±0,071,25±0,070,027Обработанные сегменты2,64±0,132,03±0,161,64±0,160,027Необработанные сегменты1,29±0,131,1±0,061,05±0,040,043

2.6 Перфузия в миокард и анализ применимости

Перфузионное (РЕТ-аммоний) и метаболическое (FDG-глюкоза) исследования проводили на 7 пациентах в виде тестов, проведенных до операции (за 1-5 дней) и через 3 месяца после трансплантации. Для каждой области оценивали удерживание метки с присвоением каждой области количественного цифрового показателя. Среднее удерживание глюкозы для всего миокарда до операции составило 0,158±0,026 мкмоль·г^-1·мин^-1, а через 3 месяца 0,270±0,008 мкмоль·г^-1·мин^-1 (p<0,05). Дифференциальный анализ областей, пораженных инфарктом (некротическая ткань в результате инфаркта миокарда) подтвердил существенное увеличение удерживания аммония и глюкозы, что показывает улучшение функции миокарда, т.е. применимость в пораженных инфарктом областях (Таблица 4). См. также Фиг.2.

Таблица 4
Позитронная эмиссионная томография PET. Оценка кровотока по удерживанию ¹³N-аммония (мл·г^-1·мин^-1) и метаболизма глюкозы по ¹⁸F-FDG (мкмоль·г^-1·мин^-1).  Базовая величинаЧерез 3 месяцаРОбщая величина¹⁸F-FDG0,158±0,0260,270±0,0080,028 ¹³N-аммоний0,47±0,050,5±0,0030,273Обработанные сегменты¹⁸F-FDG0,126±0,0220,231±0,0110,028 ¹³N-аммоний0,36±0,0040,39±0,010,686Необработанные сегменты¹⁸F-FDG0,170±0,0290,284±0,0130,046 ¹³N-аммоний0,59±0,0070,62±0,060,5

ОБСУЖДЕНИЕ

Главные выводы исследований:

1. Прямая трансплантация аутологических миогенных клеток скелетной мышцы в миокард пациентов с инфарктом миокарда и аортокоронарным шунтированием в анамнезе применима и безопасна.

2. Хотя явные различия между эффектами после шунтирования и после клеточной трансплантации отсутствуют, исследования функциональности и применимости показывают, что трансплантация аутологических миогенных клеток способствует улучшению сократимости левого желудочка и восстановлению тканей.

3. Скелетные миобласты способны приживаться, по крайней мере, в течение 3 месяцев после хирургической операции.

Хотя для того чтобы проверить, способны ли миобласты скелетной мышцы приживаться в удовлетворительной степени, необходимо непосредственное исследование миокарда, увеличение удерживания глюкозы, выявленное при помощи PET, ясно показывает, что в областях, пораженных инфарктом, в которых не было обнаружено жизнеспособной ткани, после трансплантации начинает появляться жизнеспособная ткань. С другой стороны, хотя в исследование не были включены контрольные пациенты, результаты ¹⁸F-FDG-PET для пациента 9, которому было сделано только аортокоронарное шунтирование из-за микробиологического заражения клеточной культуры, не показали существенных изменений в использовании глюкозы при контрольном наблюдении через 3 месяца (Фиг.2В), что является хотя и не окончательным доказательством, но обнадеживающим фактором.

Эти результаты показывают, что аортокоронарное шунтирование с трансплантацией аутологических миогенных клеток скелетной мышцы существенно улучшает сократимость сердца, о чем ясно свидетельствует увеличение фракции выброса и особенно снижение индекса WMSI. Из этих результатов нельзя сделать заключение о том, что улучшение сердечной функции обусловлено только шунтированием. Тот факт, что сегменты миокарда, которые получили клеточную трансплантацию, показали более существенные улучшения, в том числе увеличение удерживания глюкозы в этих сегментах, указывает на то, что улучшение сердечной функции обусловлено не только шунтированием. Для доказательства того, что трансплантация аутологических клеток обусловливает улучшение сердечной функции, следовало бы выполнить трансплантацию без других сопутствующих видов лечения, однако это пока невозможно по этическим соображениям, за исключением имплантации клеток путем подкожной инъекции.

Недавние исследования в отношении других клинических испытаний показывают, что трансплантация аутологических миобластов скелетных мышц связана с сердечными аритмиями (Menasche P et al. Lancet 2001; 357:279-280. Menasche P et al. J. Am. Coil. Cardiol. 2003; 41:1078-1083. Hagege AA et al. Lancet 2003; 361:491-492. Pagani FD et al. J. Am. Coil. Cardiol. 2003; 41:879-888). В самом деле, некоторым пациентам потребовалась имплантация внутрисердечных дефибрилляторов. До настоящего времени точная причина таких аритмий не известна, но они могут быть связаны с образованием электрических цепей циркуляции возбуждения (возможно, из-за того, что с имплантированными миобластами скелетной мышцы не устанавливаются щелевые контакты), количеством и объемом имплантированных клеток или использованием аутологических миогенных клеток. Следует отметить, что в этих протоколах для культивирования и развития in vitro аутологических миогенных клеток была использована зародышевая телячья сыворотка, являющаяся источником ксеногенных белков. Контакт человеческих клеток с телячьей сывороткой в течение 3 недель приводит к фиксированию в клеточной поверхности упомянутых животных белков. Трансплантация этих клеток может вызвать воспалительную реакцию с последующим фиброзом. Проведенные клинико-патологические исследования показывают, что трансплантированные этим способом клетки встраиваются в фиброзную структуру, в которой отсутствует реваскуляризация. Такая тканевая конфигурация представляет опасность для цепей циркуляции возбуждения, которые могут индуцировать эктопическую выработку сильных вентрикулярных аритмий. В отличие от этих исследований, в данном клиническом исследовании были использованы культивированные аутологические миогенные клетки скелетных мышц в полностью аутологической среде культивирования, что позволяет избежать иммунных реакций. Это может служить объяснением того, почему в данном клиническом исследовании таких аритмий не наблюдалось.

Изобретение относится к области биотехнологии. Аутологическая среда содержит аутологическую человеческую сыворотку, гепарин, протамин, среду с основными питательными веществами, антибиотик, противогрибковое средство и/или фактор роста фибробластов. Среда позволяет увеличить объем аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников при культивировании. Также предложены способы ее получения и применения. Изобретение может быть использовано в медицине. 10 н. и 19 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.

1. Аутологическая среда культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников, содержащая:

a) от 0,1 до 90 вес.% аутологической человеческой сыворотки;

b) от 0,1 до 10000 МЕ/мл гепарина;

c) от 0,1 до 10000 МЕ/мл протамина и

d) среду культивирования с основными питательными веществами, включая или не включая глутамин, в количестве, необходимом до получения 100 вес.% и необязательно содержащая:

e) антибиотик;

f) противогрибковое средство и/или

g) фактор роста фибробластов (FGF)

аутологическую человеческую сыворотку пациента в количестве 10%;

гепарин в количестве 0,1-110 МЕ/мл;

протамин в количестве 0,1-100 МЕ/мл,

отличающаяся тем, что дополнительно содержит

1% пенициллина/стрептомицина и, возможно,

0,25 мг/мл амфотерицина В и/или

0,1-250 пг/мл рекомбинантного bFCF,

при этом указанной средой культивирования является среда HAM-F12 в количестве 89%.

a) проведение биопсии у пациента, являющегося объектом последующей имплантации аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных, для извлечения фрагмента ткани скелетных мышц, содержащей аутологические человеческие стволовые клетки-предшественники мышечных;

b) культивирование упомянутых аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных из ткани скелетных мышц в аутологической среде культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 в условиях, обеспечивающих возможность развития упомянутой культуры аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных;

c) очистку упомянутых культивированных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных и

d) сбор упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных; и, возможно,

e) замораживание упомянутых очищенных аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников мышечных до изготовления упомянутой фармацевтической композиции.

a) биопсию скелетной мышцы у пациента предпочтительно с предварительной обработкой мышцы путем внутримышечной инъекции местного анестетика;

b) приготовление среды культивирования аутологических человеческих стволовых клеток-предшественников по любому из пп.1-8 на основе аутологической сыворотки пациента;

c) приготовление композиции, обогащенной аутологическими человеческими стволовыми клетками-предшественниками мышечных на основе биопсии а) и среды культивирования b);

d) приготовление фармацевтической композиции на основе композиции с) и

e) имплантацию фармацевтической композиции аутологических стволовых клеток-предшественников d) в пораженные участки миокарда.