СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННОГО ПОРАЖЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/145 A61K39/385 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам профилактики острой лучевой болезни.

Известно, что различные вещества микробного происхождения повышают радиорезистентность организма [1]. Радиозащитным эффектом обладают многие вакцины, в том числе вирусные. Положительный эффект получен при использовании противооспенной вакцины в опытах на кроликах [2]. Несмотря на выраженное радиозащитное действие противооспенной вакцины, она не может быть использована в качестве способа профилактики лучевых поражений, так как ликвидация оспы во всех странах исключила противооспенную вакцину из числа препаратов, использующихся в медицинской практике.

Значительно более перспективным в качестве препарата двойного назначения (противоинфекционного и противолучевого) является гриппозная вакцина, поскольку гриппом ежегодно болеют сотни миллионов человек. Для иммунизации против гриппа до недавнего времени использовали жидкую инактивированную вакцину Омутнинского химического завода Кировской области. Вакцина содержала гриппозные антигены вирусов типа А1 и А2, очищенные хроматографическим методом. Указанная вакцина была исследована на предмет наличия у нее способности повышать радиорезистентность организма [3]. Было показано, что профилактическое подкожное введение вакцины мышам (0,2 мл) или хомячкам (0,2 мл) в различные сроки до облучения (1-30 сутки) на 10-40% повышает выживаемость облученных и защищенных животных по сравнению с невакцинированными [3]. Однако упомянутая вакцина в настоящее время снята с производства в связи с ее слабыми специфическими иммуногенными свойствами и в медицинской практике не применяется.

В настоящее время для профилактики гриппа используется вакцина «Гриппол» [4]. Она отличается от жидкой инактивированной вакцины производства Омутнинского химического завода тем, что имеет в своем составе водорастворимый высокомолекулярный иммуностимулятор - N-оксидированное производное поли-1,4-этиленпиперазина (Полиоксидоний), а также содержит поверхностные гликопротеины (гемагглютинин и нейраминидаза), выделенные из очищенных вирусов гриппа типа А и В [5]. Одна иммунизирующая доза вакцины «Гриппол» для подкожного введения человеку (0,5 мл) содержит, согласно инструкции по применению, по 5 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа А (подтипы H₁ N₁ и Н₃ N₂), 11 мкг гемагглютинина штаммов вируса гриппа типа В и 500 мкг полиоксидония. Вакцина «Гриппол» свободна от примесей невирионного происхождения и является высокоочищенным, эффективным и безопасным препаратом. Она разработана Институтом иммунологии ФМБА. Вакцины «Гриппол» широко использутся в качестве средства для профилактики заболевания гриппом [5]. В настоящее время ею иммунизировано более 40 млн человек. Наблюдения за результатами вакцинации населения свидетельствуют о безвредности, хорошей переносимости и высокой профилактической эффективности препарата. Поэтому вакцина «Гриппол» разрешена к широкому применению в эпидемиологической практике для профилактической иммунизации детей, начиная с возраста 6 месяцев, и взрослых [6]. Ее применение показано для групп населения с высоким риском заболевания гриппом.

До настоящего времени оставался неизученным вопрос о противолучевой эффективности вакцины «Гриппол», что, безусловно, является актуальным и имеет не только научный, но и практический интерес. В случае получения положительных результатов вакцина «Гриппол» может быть рекомендована как препарат двойного действия: антигриппозного и радиозащитного. Она может быть использована для иммунизации работников атомной промышленности, солдат и офицеров Российской Армии, сотрудников МЧС и других групп риска радиационного воздействия.

Целью изобретения является разработка нового способа профилактики лучевых поражений с помощью вакцины «Гриппол», широко используемой при вакцинации населения против гриппа.

В результате, нами установлено, что введение в организм противогриппозной вакцины «Гриппол» подкожно до облучения значительно повышает резистентность организма к воздействию ионизирующего излучения. Способ прост и удобен в применении.

Для достижения поставленной цели было изучено радиозащитное действие вакцины «Гриппол» на мышах гибридах (СВА×C57B1)F₁ самцах, массой тела 18-23 г, при экспериментальной острой лучевой болезни, которую вызывали путем облучения мышей гамма-квантами ¹³⁷Cs на установке ИГУР. Мощность дозы 1,2-2,0 рад/сек. Контроль за мощностью дозы и ее пространственным распределением проводили с помощью термолюминисцентного дозиметра ИКС-А с использованием термолюминисцентного алюмофосфатного стекла ИС-7 с погрешностью ±10%. В качестве модели использовали однократное равномерное радиационное воздействие, вызывающее костномозговую форму острой лучевой болезни различной степени тяжести. Были использованы дозы облучения с различной биологической активностью: 6,0 (СД_10/30); 7,5 (СД_10-70/30); и 8,5 (СД_100/30) Гр. Наблюдение за подопытными животными начинали сразу и проводили в течение 30 суток после облучения. Облучение мышей проводили в специальных пластиковых контейнерах, разделенных на индивидуальные ячейки. Вакцину «Гриппол» вводили мышам в качестве радиозащитного средства однократно подкожно в дозах 0,5; 0,2 и 0,05 мл за 1, 7 или 14 суток до облучения. Наряду с группами защищенных облученных мышей были сформированы соответствующие группы облученных контрольных животных, которым вместо вакцины «Гриппол» вводили физиологический раствор. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляли по массе тела. В каждой группе было по 10-12 мышей. Облучение в указанных дозах приводило к развитию у мышей типичной костномозговой формы острой лучевой болезни, которая проявлялась снижением двигательной активности и пищевой мотивации. Мыши становились неопрятными, масса тела у них снижалась. В костном мозге и в периферической крови уменьшалось число клеток. Гибель облученных животных имела место в разгар острой лучевой болезни (7-е - 20-е сутки после облучения). Об эффективности вакцины «Гриппол» судили на основании учета продолжительности жизни мышей при дозе облучения 8,5 Гр; по выживаемости и массе тела после облучения в дозе 7,5 Гр; по содержанию клеток в костном мозге и периферической крови при дозе облучения 6,0 Гр. Полученные данные обрабатывали стандартными методами вариационной статистики при использовании компьютерной программы «Biostat» [7].

В ходе исследований обнаружено у вакцины «Гриппол» новое свойство, проявляющееся в повышении резистентности иммунизированных мышей к воздействию ионизирующего излучения.

Для определения оптимальной радиозащитной дозы вакцины «Гриппол» мыши были иммунизированы ею в объеме 0,5; 0,2 или 0,05 мл. Доза облучения составила 7,5 Гр. Однако в данном опыте выживаемость в контрольной группе животных была высокой и составила 91,6%. Поэтому для определения оптимальной радиозащитной дозы вакцины использовали показатели массы тела мышей (таблица 1).

Таблица 1
Изменение массы тела у мышей, защищенных вакциной «Гриппол», вводимой в различных объемах за 7 суток до облучения гамма-квантами ¹³⁷Cs в дозе 7,5 Гр (М±m, г)Доза вакцины, млВремя обследования после облучения, сут.071015200,523,6±0,320,5±0,920,8±0,921,5±0,722,5±0,50,223,8±0,122,0±0,322,0±0,322,4±0,423,4±0,50,0524,1±0,221,9±0,421,1±0,719,7±0,921,7±1,0Контроль облучения23,1±0,621,5±0,621,7±0,720,4±0,822,0±0,6

До облучения масса тела в сравниваемых группах была одинаковой. После облучения масса тела мышей снижалась. Менее всего этот эффект был выражен у мышей, защищенных вакциной «Гриппол» в дозе 0,2 мл. На 15-е сутки лучевой болезни масса их тела была равна 22,4±0,4 г, у контрольных мышей - 20,4±0,8 г. Эта разница статистически значима. Критерий Стьюдента t=2,2; p=0,04. Разница между массой тела мышей, защищенных вакциной «Гриппол» в дозе 0,2 мл (22,4±0,4 г) или 0,05 мл (19,7±0,9 г), была статистически значима. Критерий Стьюдента, t=2,6; p=0,01. Масса тела мышей, защищенных вакциной «Гриппол» в дозе 0,2 мл (22,4±0,4 г), была выше массы тела мышей, защищенных вакциной «Гриппол» в дозе 0,5 мл (21,5±0,7 г). Однако этот эффект был менее статистически значим, чем в предыдущем случае. Критерий Стьюдента, t=l,8; p=0,09. Таким образом, оптимальной радиозащитной дозой вакцины «Гриппол», судя по показателям динамики массы тела, следует считать дозу 0,2 мл.

При определении оптимальных сроков введения вакцины «Гриппол» для повышения радиорезистентности мышей радиозащитную дозу вакцины 0,2 мл вводили мышам за 7 или 14 суток до облучения. Результаты проведенных опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Выживаемость мышей, защищенных вакциной «Гриппол», вводимой в дозе 0,2 мл за 7 или 14 сут до облучения гамма-квантами ¹³⁷Cs в дозе 7,5 ГрГруппа мышейСрок введения вакцины до облучения, сутЧисло мышейИз нихВыживаемость,
(M±m,%)паловыжилоОпыт14101990±10Контроль-107330±15Опыт7123975±13Контроль-105550±16

Из таблицы 2 видно, что максимальная эффективность радиозащитного действия вакцины «Гриппол» имела место при введении вакцины в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения в дозе 7,5 Гр. В защищенной группе выжило 90±10% животных, в контрольной - 30±15%. Превышение выживаемости в опытной группе над контрольной составило 60%. Эффект статистически значим, критерий Стьюдента t=7,4; p=0,003. При введении вакцины за 7 суток до облучения в защищенной группе выжило 75±13% животных, в контрольной - 50±16%. Выживаемость защищенных мышей на 25% выше выживаемости в контроле. Однако эта разница, судя по критерию Стьюдента, статистически не значима.

Радиозащитный эффект противогриппозной вакцины «Гриппол» был выше, чем у исследованной ранее жидкой инактивированной вакцины Омутнинского химического завода [3]. Противолучевые свойства последней были максимально выражены при введении в дозе 0,2 мл за 7 суток до облучения 7,1 Гр (СД_24/30) В этом случае выживало 66,6±5,5% мышей в группе, защищенной жидкой инактивированной вакциной, и 24,1±3,7% в контрольной группе. Разница между показателями выживаемости - 42,5%. При использовании вакцины «Гриппол» превышение выживаемости в опытной группе над контрольной составило 60%. Полученные результаты показывают, что 14 суток до облучения, судя по выживаемости, - это оптимальный срок введения вакцины «Гриппол» для проявления ее радиозащитного действия.

Доза облучения 8,5 Гр приводила к гибели 100% контрольных мышей. Защита мышей вакциной «Гриппол» (0,2 мл вакцины за 14 суток до лучевого поражения) обеспечила выживаемость 20% животных (табл. 3).

Таблица 3
Средняя продолжительность жизни мышей, защищенных вакциной «Гриппол», вводимой в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения гамма-квантами ¹³⁷Cs в дозе 8,5 Гр (СД_100/30)Группа мышейЧисло мышейИз нихСредняя продолжительность жизни, сут (М±т)паловыжилоОпыт108216,5±1,1Контроль1010010,9±1,1

О благоприятном влиянии препарата на течение острой лучевой болезни свидетельствует увеличение продолжительности жизни защищенных мышей. Средняя продолжительность жизни павших животных в опытной группе была равна 16,5±1,1 суток, а в контроле - 10,9±1,1 суток. Отсюда следует, что защита мышей вакциной «Гриппол» увеличила продолжительность жизни павших животных на 5,4 суток. Разница между показателями в сравниваемых группах статистически значима. Критерий Стьюдента, t=3,6; p<0,05.

Радиозащитное действие вакцин проявляется наиболее наглядно в стимуляции системы кроветворения [8]. Противолучевую эффективность «Гриппола» оценивали по влиянию на гемопоэз в костном мозге и клеточность периферической крови у облученных мышей. Вакцину (0,2 мл) вводили подкожно за 14 суток до облучения гамма-квантами ¹³⁷Cs в дозе 6,0 Гр (СД_10/30). Мышей забивали на 8-е сутки после облучения путем декапитации под эфирным наркозом. При изучении влияния вакцины «Гриппол» на состояние костномозгового кроветворения фиксировали общее количество клеток в костном мозге бедренной кости. На мазках-отпечатках костного мозга, окрашенных по Паппенгейму [9], определяли содержание различных генераций клеток. При изучении влияния вакцины «Гриппол» на состояние периферической крови определяли содержание в ней лимфоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов, ретикулоцитов, эритроцитов и уровень гемоглобина на гематологическом анализаторе «Alson-6». Общее число лейкоцитов в крови исследовали в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу определяли в мазках, окрашенных по Паппенгейму. Результаты изучения состояния гемопоэза у мышей представлены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4
Влияние вакцины "Гриппол", вводимой в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения мышей в дозе 6,0 Гр (СД_10/30), на содержание клеток в костном мозге бедренной кости (M±m×10⁶)Тип клеток в костном мозгеГруппа животныхДо облученияПосле облучения, 8-е суткиВсегоконтроль23,5±1,36,0±0,4опыт16,5±0,7*эритроидныеконтроль5,2±0,41,0±0,4опыт7,1±0,6*нейтрофильныеконтроль10,5±0,81,7±0,4опыт4,6±0,5*лимфоидныеконтроль5,6±0,50,6±0,1опыт1,3±0,3*Примечание: * -Статистически значимая разница по сравнению с контролем. Критерий Стьюдента, р<0,05.

На основании проведенных исследований установлено, что в процессе развития острой лучевой болезни у контрольных мышей происходит резкое снижение содержания клеток в костном мозге и периферической крови. Введение вакцины "Гриппол" в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения оказывало существенное действие на пострадиацинное восстановление эритропоэза, нейтрофилопоэза и лимфопоэза в костном мозге, что сопровождалось повышением уровня эритроцитов, ретикулоцитов, гемоглобина и нейтрофилов периферической крови. Об этом свидетельствует статистически значимые различия между показателями опытной и контрольной групп. Можно предполагать, что в основе противолучевого эффекта лежит способность вакцины оказывать стимулирующее действие на пострадиационное восстановление гемопоэза.

Таблица 5
Влияние вакцины "Гриппол", вводимой в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения мышей в дозе 6,0 Гр (СД_10/30), на содержание клеток в периферической крови.Клетки кровиГруппа животныхДо облученияПосле облучения, 8-е суткинейтрофилы (×10⁹/л)контроль0,9±0,10,1±0,02опыт0,3±0,04*ретикулоциты (×10⁹/л)контроль201,2±19,718,1±3,8опыт114,8±16,8*эритроциты (×10¹²/л)контроль9,9±0,38,3±0,1опыт9,3±0,2*гемоглобин (г/л)контроль128,5±5,1105,4±2,2опыт119,1±1,8*Примечание: * - Статистически значимая разница по сравнению с контролем. Критерий Стьюдента, р<0,05.

Таким образом, полученные данные убедительно доказывают, что вакцина «Гриппол» обладает противолучевым действием - повышает устойчивость организма к действию радиации. Она снижает тяжесть течения острой лучевой болезни и стимулирует гемопоэз. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения вакцины «Гриппол» как препарата двойного действия:

антигриппозного и радиозащитного, для работников атомной промышленности и других групп риска радиационного воздействия.

Пример 1

Радиозащитное действие вакцины «Гриппол» испытывают на мышах гибридах (СВА×C57B1)F₁. Используются самцы массой тела 18-23 г. Вакцину «Гриппол» вводят мышам в качестве радиозащитного средства однократно подкожно в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения. В качестве контрольных используют животных, которым вводят физиологический раствор. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляют по массе. В каждой группе по 10 мышей. Животных однократно равномерно облучают гамма-квантами ¹³⁷Cs на установке ИГУР в дозе 8,5 Гр (СД_100/30). Мощность дозы 1,2 рад/сек. Контроль за мощностью дозы и ее пространственным распределением проводят с помощью термолюминисцентного дозиметра ИКС-А с использованием термолюминисцентного алюмофосфатного стекла ИС-7 с погрешностью ±10%. Облучение мышей проводят в специальных пластиковых контейнерах, разделенных на индивидуальные ячейки. Результаты наблюдения показали, что доза облучения 8,5 Гр приводит к гибели 100% мышей. Введение вакцины «Гриппол» в объеме 0,2 мл за 14 суток облучения обеспечила выживаемость 20±12% животных. О радиозащитном действии вакцины «Гриппол» свидетельствует увеличение продолжительности жизни защищенных мышей. Средняя продолжительность жизни павших животных в опытной группе равна 16,5±1,1 суток, а в контроле - 10,9±1,1 суток. Защита мышей вакциной «Гриппол» увеличила продолжительность жизни животных на 5,4 суток по сравнению с контрольной группой. Разница между показателями в сравниваемых группах статистически значима, критерий Стьюдента, t=3,6; p =0,003.

Пример 2

Действие вакцины «Гриппол» на гемопоэз в костном мозге и клеточность периферической крови испытывают на мышах гибридах (СВА×C57B1)F₁. Используются самцы, массой тела 18-23 г. Вакцину «Гриппол» вводят мышам в качестве радиозащитного средства однократно подкожно в дозе 0,2 мл за 14 суток до облучения. В качестве контроля используют мышей, которым вводят физиологический раствор. Рандомизацию контрольных и опытных групп осуществляют по массе тела. В каждой группе по 10 мышей. Животных однократно равномерно облучают гамма-квантами ¹³⁷Cs на установке ИГУР в дозе 6,0 Гр (СД_10/30). Мощность дозы 1,2 рад/сек. Контроль за мощностью дозы и ее пространственным распределением проводят с помощью термолюминисцентного дозиметра ИКС-А с использованием термолюминисцентного алюмофосфатного стекла ИС-7 с погрешностью ±10%. Облучение мышей осуществляют в специальных пластиковых контейнерах, разделенных на индивидуальные ячейки. Мышей забивают на 8-е сутки после облучения путем декапитации под эфирным наркозом. При изучении состояния костномозгового кроветворения подсчитывают общее количество клеток в костном мозге бедренной кости. На мазках-отпечатках костного мозга, окрашенных по Паппенгейму, определяют содержание миелокариоцитов и других клеток различных генераций. При изучении периферической крови подсчитывают число клеток (лимфоциты, нейтрофилы, тромбоциты, ретикулоциты, эритроциты), определяют уровень гемоглобина на гематологическом анализаторе «Alson-6», а общее число лейкоцитов - в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу определяют в мазках, окрашенных по Паппенгейму. Результаты наблюдения показывают, что доза облучения 6,0 Гр приводит к резкому снижению содержания клеток в костном мозге контрольных мышей. До облучения общее число клеток в костном мозге бедренной кости было равно 23,5±1,3 (×10⁶); эритроидных - 5,2±0,4 (×10⁶); нейтрофильных - 10,5±0,8 (×10⁶); лимфоидных - 5,6±0,5 (×10⁶). На 8-е сутки после облучения у контрольных мышей суммарное число клеток в костном мозге бедренной кости снижается до 6,0±0,4 (×10⁶); эритроидных - до 1,0±0,4 (×10⁶); нейтрофильных - до 1,7±0,4 (×10⁶); лимфоидных - до 0,6±0,1 (×10⁶). О радиозащитном действии вакцины "Гриппол" свидетельствует значительно меньшее ухудшение показателей в опытной группе по сравнению с контрольными животными. Так, на 8-е сутки после облучения у иммунизированных мышей суммарное число клеток в костном мозге бедренной кости равняется 16,5±0,7 (×10⁶); эритроидных - 7,1±0,6 (×10⁶); нейтрофильных - 4,6±0,5 (×10⁶); лимфоидных - до 1,3=1:0,3 (×10⁶). Разница между показателями сравниваемых групп статистически значима, критерий Стьдента, t=2,2-13,0; р<0,05-0,01.

Результаты наблюдения показывают, что доза облучения 6,0 Гр приводит к резкому снижение содержания клеток в периферической крови контрольных мышей. До облучения содержание нейтрофилов составляет 0,9±0,1 (×10⁹/л); ретикулоцитов - 201,2±19,7 (×10⁹/л); эритроцитов - 9,9±0,3 (×10¹²/л); гемоглобина - 128,5±5,1(г/л). На 8-е сутки после облучения у контрольных мышей число нейтрофилов снижается до 0,1±0,02 (×10⁹/л); ретикулоцитов - до 18,1±3,8 (×l0⁹/л); эритроцитов - до 8,3±0,l(×l0¹²/л); гемоглобина - до 105,4±2,2 (г/л). О радиозащитном действии вакцины "Гриппол" свидетельствует менее выраженное снижение показателей в опытной группе по сравнению с контрольными животными. Так, на 8-е сутки после облучения у иммунизированных мышей число нейтрофилов равнялось 0,3±0,04 (×10⁹/л); ретикулоцитов - 114,8±16,8 (×l0⁹/л); эритроцитов - 9,3±0,2 (×10¹²/л); гемоглобина - 119,1±1,8 (г/л). Разница между показателями сравниваемых групп статистически значима, критерий Стьдента, t-4,4-5,6; p<0,01.

Источники информации

1. Андрущенко В.Г., Иванов А.А., Мальцев В.Н. Противолучевое действие веществ микробного происхождения (обзор литературы) // Рад. биология. Радиоэкология. - 1996. - Т.36. - В.2. - С.195-208.

2. Камалян Л.А. К вопросу о повышении радиорезистентности кроликов путем иммунизации их вирусом осповакцины // Радиобиология. - 1966. - Т.6. - №6. - С.860-864.

3. Иванов А.А., Ершов Ф.И., Уланова А.М., Кузьмина Т.Д., Ставракова Н.М., Тазулахова Э.Б., Г.А. Шальнова. Радиопротективные и интерфероногенные свойства гриппозной вакцины // Рад. биология. Радиоэкология. - 1995. - Т.35. - В.2.- С.231-235

4. Патент РФ №2164148 (МПК⁷ А 61 К 39/145).

5. Инструкция по применению вакцины гриппозной тривалентной полимерсубъединичной жидкой ГРИППОЛ. Регистрационое удостоверение №96.309.123. Утверждена Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 22.06. 2001 г.

6. Хаитов P.M., Некрасов А.В., Горбунов М.А. Вакцинация «Грипполом» детей // Вакцинация. - 2001. - Т.17. - №5. - С.1-5.

7. Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков // Издательство АН СССР. - 1963. - 322 с.

8. Гуценко К.К., Иванов А.А., Мальцев В.Н. Влияние бактериальных препаратов на гемопоэз облученных животных // Рад. биология. Радиоэкология. - 1994. - Т.34. - В.4-5. - С.582-586.

9. Кост Е.А. Справочник по клиническим и лабораторным методам исследования // М.: - Медицина. - 1963. - 436 с.

Изобретение относится к медицине, а именно к радиационной медицине, и может быть использовано для профилактики радиационного поражения. Для этого до облучения подкожно вводят гриппозную вакцину «Гриппол» в эффективном количестве. Изобретение позволяет повысить резистентность организма к воздействию ионизирующего излучения. 5 табл.

Способ профилактики радиационного поражения, включающий введение в организм гриппозной вакцины, отличающийся тем, что в качестве таковой используют гриппозную вакцину «Гриппол», которую вводят в эффективном количестве подкожно до облучения.