СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА В КАЧЕСТВЕ РАДИОПРОТЕКТОРА И СТИМУЛЯТОРА КОЛОНИЕОБРАЗОВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ ОБЛУЧЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2014 года по МПК A61K36/81 A61K31/715 A61P39/00 

Изобретение относится к радиационной и экспериментальной биологии, биотехнологии и медицине, а именно к средствам радиозащиты и к стимуляторам колониеобразования стволовых клеток, может быть использовано в научно-исследовательской и клинической практике для защиты живых организмов при воздействии ионизирующего излучения, в экстренной и военной медицине, при возникновении чрезвычайных ситуаций - как средство защиты от радиационного поражения.

Сущность изобретения заключается в использовании растительного полисахарида гамма-плант (Чекановская Л.А. Полисахарид гамма-плант (γ-pl), обладающий противоинфекционным действием и не обладающий геммаглютинирующим действием. RU 2028303 C1) в качестве радиопротектора и стимулятора колоний стволовых клеток в селезенках облученных животных.

В настоящее время остро стоит проблема защиты от лучевых поражений. Для снижения последствий облучения используют радиопротекторы. К радиопротекторам относят вещества, способные при профилактическом применении оказывать защитное действие, проявляющееся в сохранении жизни облученного живого организма или ослаблении степени тяжести лучевого поражения с пролонгацией состояния дееспособности и сроков жизни (В.И. Легеза, В.Г. Владимиров. Новая классификация профилактических противолучевых средств. Радиационная биология. Радиоэкология, т.38, вып.3, стр.416, 1998 г.). Основные требования, предъявляемые к радиопротекторам, заключаются в том, что они должны быть достаточно эффективными и не вызывать побочных реакций. Известные радиопротекторы в полном объеме этим требованиям не отвечают и выбор биологически активных веществ, обладающих радиомодифицирующей активностью, достаточно ограничен.

Известны радиопротекторы - гаммафос и цистамин, входящие в военную аптечку АИ-1,2,3 Вс, 4, обладающие ФУД (фактор уменьшения поглощенной дозы) 1,6 и 1,15 соответственно. (Свердлов и соавторы 1974); Они относятся к радиопротекторам кратковременного действия, считаются наиболее эффективными. Недостатком широко используемого в практике радиопротектора цистамина (Куна П. Химическая радиозащита. Пер. с чешск. М.: Медицина, 1989, с.61-75) является то, что его действие наблюдается при дозах введения, близких к токсичным. Применение этих доз вызывает у лабораторных животных серьезные острые побочные действия: падение артериального давления, брадикардию, снижение минутного объема крови с нарушением кровоснабжения тканей. Отмечаются тошнота, рвота, дефекация, судороги скелетных мышц, гибель в результате паралича дыхательного центра.

Другие известные радиопротекторы - биогенные амины обладают ФУД 1,3-1,5, также имеют ряд серьезных побочных действий: вызывают спазм сосудов и циркуляторное изменение кровоснабжения в радиочувствительных органах и тканях (С.А. Куценко. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита. СПб: ООО «Издательство ФОЛИАНТ», 2004). Применение этих препаратов ограничено из-за трудности установления оптимальных доз, времени и пути введения.

К общим недостаткам наиболее эффективных из известных радиопротекторов следует отнести также то, что их радиозащитные свойства, в основном, проявляются при использовании перед облучением. При экстремальных ситуациях, в частности при авариях на атомных установках, использовании атомного оружия противником, когда ввести препарат необходимо после облучения, защитный эффект значительно снижен (Шашков B.C. Анашкин О.Д. Суворов Н.Н. Манаева И.А. Эффективность серотонина, мексамина, АЭТ и цистамина при повторном введении после гамма-облучения. // Радиобиология, 1971, т.XI, вып.4, с.621-623).

Известен способ стимулирования колониеобразования стволовых клеток в селезенке после облучения препаратами IL-1a и IL-1b в дозе 1 мкг/животное через 1 или 3 ч после радиационного воздействия [Чигарева Н.Г. Интерлейкин-1b в качестве средства ранней терапии острой лучевой болезни / Н.Г. Чигарева, А.Ф. Мясоедов, Н.В. Петкевич и др. // Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины: Тез. докл. науч.-техн. конф. - СПб., 2000. - С.31]. Показано, что препараты IL-1 оказывали положительное влияние на кроветворение, что проявлялось в увеличении содержания форменных элементов в периферической крови, росте числа миелокариоцитов в костном мозге, возрастании количества колониеобразующих единиц на селезенке [Легеза В.И. Цитокины как средства ранней патогенетической терапии радиационных поражений. Эффективность и механизм действия / В.И. Легеза, Н.Г. Чигарева, Ю.А. Абдуль, И.Ш. Галеев // Радиац. биология. Радиоэкология. - 2000. - Т.40, №4. - С.420-424]. В литературе большое количество работ указывают на то, что наиболее перспективным препаратом для раннего лечения радиационных поражений в России является рекомбинантный IL-1β (беталейкин). Препарат Беталейкин, являющийся лекарственной формой рекомбинантного IL-1β человека, разрешен приказом Минздрава РФ №51 от 18.02.1997 г. к клиническому применению в качестве иммуностимулятора и как средство восстановления костномозгового кроветворения у раковых больных после интенсивных курсов химио- и радиотерапии (регистрационный номер 97/51/6). Недостатком данного способа является использование фармакологического препарата, имеющего определенные противопоказания для применения. IL-1 - провоспалительный цитокин, вырабатывается клетками организма, и уровень его в крови имеет достаточно широкие значения, которые невозможно учесть в чрезвычайных ситуациях. Ошибки в установлении оптимальных доз, времени и пути введения приводят к сильным побочным эффектам - нарушениям иммунорегуляции, стимуляции реакции воспаления, высокой цитотоксичности; применение вызывает лихорадку, потливость, головную боль. Сильное повышение уровня IL-1 приводит к артериальной гипотензии, анорексии, разрушению хрящей в суставах. IL-1 участвует в регуляции температуры тела, его повышенная продукция приводит к развитию лихорадки. Кроме того, существует ряд заболеваний, в патогенезе которых отмечается повышение уровней IL-1 и применение терапии цитокинами противопоказано.

Целью данного изобретения является разработка способа, позволяющего использовать полисахарид растительного происхождения гамма-плант для противорадиационной защиты с обеспечением высокой выживаемости живых организмов до и после воздействия лучевого поражения, что даст возможность не только расширить имеющийся арсенал радиопротекторных веществ, но и найти наиболее эффективное соединение, не обладающее токсичностью.

Поставленная задача решается тем, что обнаружены новые радиопротекторные свойства препарата гамма-плант, природного нетоксичного полисахарида (препарат «Гамма-плант» зарегистрирован Минздравом России и разрешен к медицинскому применению и промышленному выпуску. Регистрационное удостоверение МЗ РФ №99/47/12 от 10 февраля 1999 г. Регистрационное удостоверение МЗ РФ №99/47/1 от 10 февраля 1999 г. В Регистре лекарственных средств России «Гамма-плант» внесен в раздел ФГ-9 «Ненаркотические анальгетики» на стр.386 издания 2001 г.), отработаны дозы и пути его введения, до и после облучения животных, на фоне регистрации стимуляции колоний стволовых клеток облученных животных. При этом достигается: высокое значение ФУД - 2-2,2, стимуляция роста колоний стволовых клеток в 2-2,3 раза по сравнению с необлученными животными и рост выживаемости до 95%.

Гамма-плант представляет собой гликопротеин, содержащий до 95% углеводов и не менее 0,5% белка с высокой молекулярной массой, выделенный из растительных клеток. Лекарственная форма гамма-планта представлена в ампулах в виде 0,01% раствора для иньекций. Широта терапевтического диапазона гамма-планта более 1000.

Для выполнения поставленной задачи проводили оценку влияния гамма-планта на выживаемость облученных животных - самцах линии F₁(CBA×С₅₇В1/6) массой 20-25 г. Соединение вводили внутривенно в дозах 1, 10, 100 γ/на животное. Противолучевая активность соединения была изучена в дозе 800 рад (ЛД_80/30). Облучение животных производили на установках ИГУР. Контролем служили только облученные животные. В течение 30 суток проводилось наблюдение за общим состоянием и поведением животных. Контрольные животные отличались пониженной активностью, плохим аппетитом и потерей волосяного покрова, также наблюдался диспепсический синдром. Животные с введением гамма-планта проявляли большую активность, нормальный аппетит и отсутствие потери волосяного покрова.

Для оценки профилактических радиопротективных свойств гамма-планта опытным животным вводили внутривенно за 1 час до лучевого воздействия в дозе 800 рад (мощность дозы 158 рад/мин, время облучения 5 мин 4 сек).

Для оценки терапевтических радиопротективных свойств гамма-планта опытных животных подвергали лучевому воздействию в дозе 800 рад (мощность дозы 158 рад/мин, время облучения 5 мин 4 сек), после чего вводили гамма-плант внутривенно через 1,6 и 24 часа.

Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты опыта по оценке противолучевой активности гамма-планта в опытах на мышах при внутривенном способе введения в условиях острого облучения. Время введения Доза препарата, γ/животное Количество животных Выжило Абс. % За 1 час 1 20 13 65 10 20 16 80 100 20 12 60 Через 1 час 1 20 16 80 10 20 16 80 100 16 14 87,5 Через 6 часов 1 20 19 95 10 19 17 85 100 19 16 84,2 Через 24 часа 1 20 16 80 10 20 16 80 100 20 16 80 При этой дозе облучения выживаемость мышей в контрольных группах была равна 20%.

Результаты свидетельствуют о том, что в данных условиях соединение гамма-плант обладает противолучевой активностью. Исследованные дозы 1, 10 и 100 мкг/животное проявляют одинаковую активность, что еще больше увеличивает терапевтическую широту. Обращает на себя внимание высокий терапевтический радиозащитный эффект гамма-планта в течение суток - это очень важное качество соединения, которое дает возможность оказать экстренную помощь практически в любой точке земного шара. Применение гамма-планта в качестве радиопротектора обеспечивает высокий радиозащитный эффект, было предположено, что этот эффект основывается на стимуляции роста колоний гемопоэтических стволовых клеток.

Гамма-плант готовили из исходного стерильного раствора, содержащего 100 мкг сухого полисахарида в 1 мл физиологического раствора. В опытах использовали раствор с концентрацией 10 мкг/0,2 мл, который готовился непосредственно перед опытом после разведения исходного раствора стерильным физиологическим раствором. Вводился однократно.

Для оценки стимулирующего действия полисахарида гамма-плант на колониеобразование кроветворных клеток-предшественников в селезенке до или после облучения были проведены экспериментальные исследования на мышах-гибридах F₁(СВА×С₅₇В₁/6), самцах в возрасте 3 месяцев с массой тела 20-22 г.

Для оценки профилактического действия гамма-планта подопытным животным за 1 час и 3 часа до облучения внутривенно вводили 10 мкг/животное полисахарида. Все животные подвергались гамма-облучению (источник Co⁶⁰) в дозе 6 Гр на аппарате «Луч» (мощность дозы - 52,63 с Гр/мин, время облучения - 11 мин 24 сек).

Для определения терапевтического действия гамма-планта животные сначала подвергались гамма-облучению (источник Co⁶⁰) в дозе 6 Гр на аппарате «Луч» (мощность дозы - 52,63 сГр/мин, время облучения - 11 мин 24 сек), а затем подопытным животным через 1 час и 24 часа после облучения внутривенно вводили 10 мкг/животное полисахарида.

Все подопытные группы животных сравнивались с контрольной группой животных, в которой мышам вводился физиологический раствор по схеме введения полисахарида. Все животные подвергались гамма-облучению (источник Co⁶⁰) в дозе 6 Гр на аппарате «Луч» (мощность дозы - 52,63 сГр/мин, время облучения - 11 мин 24 сек).

На восьмые сутки после облучения всем животным проводилась эвтаназия введением раствора нембутала из расчета 60 мг/кг массы тела, извлекалась селезенка, которую взвешивали и помещали для фиксации в свежеприготовленный раствор уксуснокислого спирта (смесь 3 частей 95%-го этилового спирта и 1 части ледяной уксусной кислоты). После 2 часов фиксации селезенки переносились в 70% раствор этилового спирта, и производился подсчет образовавшихся селезеночных колоний на поверхности селезенок, диаметр которых превышал 0,2 мм. Средние значения числа сформированных колоний и стандартной ошибки (M±m) вычислялись на основе методических указаний, подготовленных Минздравом СССР по оценке в радиобиологических опытах выживаемости КОЕ-С (колониеобразующие единицы селезеночные), 1975 г.

Критерием стимулирующего действия полисахарида гамма-плант служило образование колоний в селезенках облученных животных. Число колоний является пропорциональным числу выживших клеток-предшественников.

Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты опыта по оценке противолучевой активности гамма-планта (ГП) по тесту выживаемости гемопоэтических стволовых клеток, формирующих селезеночные колонии (КОЕ-С), на 8-е сутки после облучения мышей-гибридов F₁(СВА×С57В1/6) № группы Группа Масса селезенки, мг M±m Количество КОЕ-С в группе, M±m 1. Контроль, облучение 6 Гр 31,5±1,5 0,8±0,1 2. Введение ГП за 3 ч до 6 Гр 32,1±0,5 1,6±0,2∗ 3. Введение ГП за 1 ч до 6 Гр 33,8±1,8 1,9±0,4∗ 4. Введение ГП через 1 ч после 6 Гр 34,7±1,4 1,9±0,3∗ 5. Введение ГП через 24 ч после 6 Гр 33,0±1,3 1,6±0,3∗ ∗ - статистически значимое (р<0,05) различие с показателем контрольной группы по числу КОЕ-С.

Из таблицы следует, что все используемые временные интервалы полисахарида гамма-плант являются стимуляторами гемопоэтических стволовых клеток.

Однократное введение мышам полисахарида до облучения увеличивает количество колоний в 2-2,3 раза, причем наибольший профилактический эффект наблюдался в группе, в которой гамма-плант вводили за час до облучения.

Однократное введение мышам полисахарида после облучения также увеличивает количество колоний в 2-2,3 раза, причем наибольший терапевтический эффект наблюдался в группе, в которой гамма-плант вводили спустя час после облучения.

Примеры конкретного выполнения:

Пример №1.

Исследования были выполнены на мышах-гибридах F₁(CBA×C₅₇B1/6), самцах в возрасте 3 месяцев с массой тела 20-22 г. Было использовано 5 групп мышей, содержащих по 12 животных в каждой группе.

1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

2-я группа - мышам вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл за 3 часа до облучения.

3-я группа - мышам вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл за 1 час до облучения.

4-я группа - мышам вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл через 1 час после облучения.

5-ая группа - мышам вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 24 часа после облучения.

Гамма-плант непосредственно перед опытом разводят из исходного стерильного раствора, содержащего 100 мкг сухого полисахарида в 1 мл физиологического раствора, до раствора с концентрацией 10 мкг/0,2 мл стерильным физиологическим раствором и вводят мышам однократно, внутривенно в хвостовую вену или подкожно.

Затем животные подвергаются гамма-облучению (источник Co⁶⁰) в дозе 6 Гр на аппарате «Луч» (мощность дозы - 52,63 сГр/мин, время облучения - 11 мин 24 сек).

На восьмые сутки после облучения всем животным проводилась эвтаназия введением раствора нембутала из расчета 60 мг/кг массы тела, извлекалась селезенка, которую взвешивали и помещали для фиксации в свежеприготовленный раствор уксуснокислого спирта (смесь 3 частей 95%-го этилового спирта и 1 части ледяной уксусной кислоты). После 2 часов фиксации селезенки переносились в 70% раствор этилового спирта, и производился подсчет образовавшихся селезеночных колоний на поверхности селезенок, диаметр которых превышал 0,2 мм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Из таблицы следует, что введение полисахарида гамма-плант увеличивает число эндогенных колоний в селезенке в 2,0-2.3 раза.

Наблюдаемое увеличение числа колоний в селезенках облученных животных связано с увеличением числа выживших кроветворных клеток-предшественников. Это свидетельствует о наличии у исследуемого препарата способности проявлять не только терапевтическое, но и радиопротекторное действия на стволовых клетках от действия ионизирующей радиации.

Пример №2

Исследования были выполнены на мышах-гибридах F₁(CBA×C₅₇B1/6), с массой тела 20-25 г. Было использовано 13 групп мышей, содержащих по 10 животных в каждой группе.

1-я группа (контроль) - животным вводили физиологический раствор.

2-я группа - мышам внутривенно вводили по 1 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл за 1 час до облучения.

3-я группа - мышам внутривенно вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл за 1 час до облучения.

4-я группа мышам внутривенно вводили по 100 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл за 1 час до облучения.

5-ая группа - мышам внутривенно вводили по 1 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 1 час после облучения.

6-ая группа - мышам внутривенно вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 1 час после облучения.

7-ая группа - мышам внутривенно вводили по 100 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 1 час после облучения.

8-ая группа - мышам внутривенно вводили по 1 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 6 часов после облучения.

9-ая группа - мышам внутривенно вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 6 часов после облучения.

10-ая группа - мышам внутривенно вводили по 100 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 6 часов после облучения.

11-ая группа - мышам внутривенно вводили по 1 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 24 часа после облучения.

12-ая группа - мышам внутривенно вводили по 10 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 24 часа после облучения.

13-ая группа - мышам внутривенно вводили по 100 мкг гамма-планта в объеме 0,2 мл спустя 24 часа после облучения.

Гамма-плант непосредственно перед опытом разводили из исходного стерильного раствора, содержащего 500 мкг сухого полисахарида в 1 мл стерильного физиологического раствора, до растворов с концентрацией 1 и 10 мкг/0,2 мл стерильным физиологическим раствором. Исходный раствор представлял собой концентрацию 100 мкг/0,2 мл.

Полученные растворы вводили мышам однократно, внутривенно в хвостовую вену.

Затем животных облучали на установках ИГУР в дозе 800 рад (мощность дозы 158 рад/мин, время облучения 5 мин 4 сек)).

В течение 30 суток проводилось наблюдение за общим состоянием и поведением животных, после чего оценивали выживаемость животных всех групп.

Результаты приведены в таблице 1.

Внедрение данного вещества в качестве радиопротектора для нужд работников АЭС, спасателей, медицинских работников и военных позволит повысить эффективность их работы в случае возникновения чрезвычайных ситуаций или при взаимодействии с радиоизотопами, обеспечивая более чем двукратное значение ФУД при отсутствии негативных побочных явлений, в том числе токсичных.

Изобретение относится к радиационной и экспериментальной биологии, биотехнологии и медицине, а именно к средствам радиологической защиты и к стимуляторам колониеобразования стволовых клеток. Изобретение может быть использовано в научно-исследовательской и клинической практике для защиты живых организмов при воздействии ионизирующего излучения; в экстренной и военной медицине, при возникновении чрезвычайных ситуаций - как средство защиты от радиационного поражения. Предложено применение препарата гамма-плант в качестве радиопротектора с колониестимулирующими свойствами для повышения выживаемости и улучшения состояния организмов, подверженных облучению. Гамма-плант - нетоксичный полисахарид растительного происхождения, зарегистрирован Минздравом России и разрешен к медицинскому применению; в Регистр лекарственных средств России «Гамма-плант» внесен в раздел ФГ-9 «ненаркотические анальгетики». Технический результат: изобретение позволяет в 2,0-2,3 раза повысить эффективность колониеобразования стволовых клеток в селезенке, увеличивает выживаемость подопытных животных до 95% с коэффициентом ФУД (фактор уменьшения дозы), равным 2-2,2. 2 табл.

Применение препарата гамма-плант в качестве радиопротектора с выраженными колониестимулирующими свойствами для повышения выживаемости и улучшения состояния организмов, подверженных облучению.