Способ лечения радиационных поражений организма Российский патент 2019 года по МПК A61K35/74 A61K39/85 A61P43/00 

Изобретение относится к ветеринарии и медицине, в частности, к производству и использованию препаратов, предназначенных для лечения радиационных поражений организма.

Известен способ лечения радиационных поражений организма путем подкожного введения противолучевой сыворотки млекопитающих в дозе 10-12 мг/кг в течение первых 10 сут после облучения (Патент RU №2169572, МПК А61К 35/38. - опубл. 27.06.2001).

Недостатком способа является сложная технология получения противолучевой сыворотки путем облучения крупных дорогостоящих сельскохозяйственных животных (лошадей, овец, свиней, волов), что ведет к существенному повышению себестоимости полученного препарата.

Известен способ лечения острой лучевой болезни (ОЛБ) с использованием веществ микробного происхождения (ВМП) (см. ст. В.Н. Андрущенко и др. «Противолучевое действие веществ микробного происхождения» // Радиац. биол. Радиоэкол. - 1996. - Т. 36. - В. 2. - С. 195-207).

Известен способ лечение радиационных поражений организма путем перорального введения лактобацилл, бифидобактерий и колибактерина в дозах 5⋅10⁸, 1⋅10⁸ и 1⋅10³ КОЕ/кг соответственно при облучении животных в минимально летальных дозах (ЛД_80/30) (см. статью В.Н. Мальцева и др. Бактериотерапия острой лучевой болезни // Радиобиология. - 1978. - Т. 17. - В. 5. - С. 757-760).

Известен способ лечения радиационных поражений организма путем двукратного внутрибрюшинного применения пробиотического препарата «Биоспорин» облученным в минимальной летальной дозе (ЛД_70/30) животным (см. статью А.В. Степанова, Н.В. Литуева, И.А. Поберий «Исследование радиомодифицирующих свойств препарата «Биоспорин» // Сб. матер. научно-практ конф. - Екатеринбург. 1997. - С. 42-45).

аспекте патогенеза и терапии острого лучевого поражения // Радиобиол. Радиоэкология. - 1997. - Т. 37. - В. 4. - с. 590-596).

Механизм радиозащитного действия цитокинов, в частности интерлейкина-1 (ИЛ-1) и туморнекротизирующего фактора (ТНФ-α), заключается в том, что они являются перехватчиками токсических радикалов (радиотоксинов), мишенью атаки которых являются стволовые клетки костного мозга (СКК). Опустошение стволового отдела иммуногемопоэза, вызванного радиоиндуцироваными токсическими радикалами, является основным механизмом развития острой лучевой болезни и наступление радиационной гибели организма.

Продукты метаболизма золотистого стафилококка - стерильного фильтрата фаголизата микроорганизма, после введения в облученный организм, являются индукторами цитокинов ИЛ-1 и ТНФ-α, последние, обладая способностью перехватывать и нейтрализовать токсические радикалы, предупреждают радиоиндуцированный апаптоз (гибель) стволовых клеток костного мозга - занимающих центральное место в системе иммуногемопоэза и являющихся, по сути, детерминантами выживаемости при острой лучевой болезни (ОЛБ).

Следовательно радиозащитный эффект при использовании продуктов метаболизма стафилококка реализуется по механизму миелопротекторного действия веществ микробного происхождения путем усиления синтеза цитокинов, перехватывающих и нейтрализующих токсические радикалы, мишенью атаки которых являются клетки иммуногемопоэза.

Задачей предлагаемого изобретения является оценка радиозащитного действия фильтрата фаголизата патогенного стафилококка, повышающего выживаемость животных на фоне летального облучения.

Технический результат заключается в активации защитных функций организма на фоне лечебного применения фильтрата фаголизата стафилококка путем нейтрализации продуктов радиолиза (радиотоксинов), стимуляции иммунологической реактивности (восстановление кишечного

биоценоза), защиты клеток костного мозга (миелоцитов) и периферической крови, а также ингибирования синтеза провоспалительных цитокинов.

Для достижения этого технического результата в предлагаемом способе лечения радиационных поражений организма, предусматривающем введение в организм бактериального препарата, в качестве бактериального препарата используют радиозащитный препарат - стерильный фильтрат фаголизата патогенного штамма стафилококка, который вводят однократно подкожно в дозе 0,35-0,40 мг/кг живой массы через 24 ч после облучения.

В экспериментах использовали фильтрат фаголизата стафилококка, который получали путем высева суточной культуры стафилококка (St. aureus) в мясопептонный бульон, ее культивирования в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 дней, выросшую культуру микробов инактивировали путем нагревания в течение 30 мин в водяной бане при температуре 90-95°С, затем бактерии осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 20 мин, супернатант (надосадочную жидкость) фильтровали через фильтр Зейтца. Полученный стерильный фильтрат, имеющий РН 7,9 и содержащий 1,0±0,2 мг/мл активно-действующего вещества (АДВ), использовали в качестве радиозащитного средства при острой лучевой болезни животных (патент РФ №2631795, МПК С12 №1/20, опубл. 26.09.17, бюл. №27).

Результаты определения химического состава культуральной жидкости на биохимическом анализаторе «Selectra junior» показали, что она содержит ферменты, углеводы, белки, мочевину, альбумины, креатинин, микроэлементы, сероактивный белок и гамма-глобулины в следующих количественных соотношениях:

Аланинаминотрансфераза - 2,7 ммоль /л Аспартатаминотрансфераза - 1,2 ммоль /л Креатинин - 125,0 ммоль/л Мочевина - 7,6 ммоль/л Общий белок - 0,5 г/л Глюкоза - 0,3 ммоль/л Щелочная фосфатаза - 20,9 ммоль /л Холестерин - 0,1 ммоль/л Амилаза - 0,8 г/л Общий билирубин - 0,5 ммоль/л Альбумины - 0,5 г/л Гамма-глобулины - 1,6 г/л Кальций - 0,1 ммоль/л Фосфор -23,3 мг/л Железо - 11,5 ммоль/л Сероактивный белок - 1,0 мг/л.

Способ лечения и профилактики радиационных поражений организма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение безвредности и стерильности полученного фильтрата стафилококков проводили общепринятыми в микробиологии и иммунологии методами (см. кн. под ред. Н.П. Бургасова «Руководство по вакцинному и сывороточному делу». - М: Медицина, 1978. - 439 с.).

Определение токсичности (безвредности) фильтрата стафилококка проводили на 50 белых мышах, разделенных на 5 групп по 10 животных в каждой. Испытуемый препарат в возрастающих дозах однократно подкожно вводили белым мышам по 0,1 мл (1-я группа), 0,2 мл (2-я), 0,3 мл (3-я), 0,4 мл (4-я) и 0,5 мл (5-я группа), что составляло 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг живой массы соответственно.

Установлено, что в течение 10 сут после однократного подкожного введения испытуемого препарата в диапазоне доз от 5 до 25 мг/кг живой массы, гибель животных ни в одной группе белых мышей не наблюдалась, что свидетельствует о его атоксичности и безвредности.

Пример 2. Для определения оптимальной лечебной дозы препарата, опыты проводили на 70 белых мышах, используя по 10 животных на каждый вариант (испытуемую дозу) опыта. Испытывали дозы фильтрата по 0,15

мг/кг, 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45 мг/кг живой массы. При этом всех мышей облучали на гамма-установке «Пума» в дозе 8,0 Гр. Испытуемый препарат в вышеуказанных дозах однократно подкожно вводили облученным животным через 24 ч после облучения. За облученными животными вели наблюдение в течение 30 сут, регистрируя павших и выживших животных в опытной и контрольной группах.

Установлено, что выживаемость леченных животных после облучения по группам составляла: 1-я (0,15 мг/кг) - 10%, 2-я (0,20 мг/кг) - 20%, 3-я -30%,. 4-я - 50%, 5-я - 80%, 6-я - 80%, 7-я - 60% соответственно. Следовательно, оптимальная лечебная доза испытуемого препарата составляет 0,35 - 0,40 мг/кг живой массы. Увеличение дозы препарата до 0,45 мг/кг не приводило к увеличению выживаемости облученных животных.

Пример 3. Изучение формирования радиорезистентности облученных животных на фоне применения предлагаемого радиозащитного средства.

Для изучения механизма формирования радиорезистентности у облученных животных на фоне применения испытуемого препарата -фильтрата золотистого стафилококка (ФЗС), опыты проводили на 30 белых мышах, разделенных на 3 группы по 10 животных в каждой. Облученным в дозе 8,0 Гр мышам 1-й группы однократно подкожно вводили испытуемый препарат в оптимальной лечебной дозе (0,4 мг/кг), через 24 ч после летального облучения. Животным 2-й группы и необлученным животным 3-й группы (биологический контроль) препараты не вводили и они служили контролем облучения и биологическим контролем соответственно. В качестве критериев оценки защитного действия препарата использовали его гемопротекторное и миелопротекторное действия на фоне летального облучения по показателям системы крови: клеточности костного мозга, эритроидных и лимфоидных клеток в костном мозге и периферической крови, изменения массы тимуса. Клеточность костного мозга и изменения клеток крови изучали в соответствии с общепринятыми в радиационной гематологии методиками (Е.А. Жербин, А.В. Чухловин. Радиационная гематология. - М: Медецина, 1989. - 176 с.).

Пробы крови и костного мозга брали у убитых на 10 сут животных после облучения и лечения в период разгара острой лучевой болезни. Результаты влияния испытуемого препарата на систему крови облученных и леченных предлагаемым препаратом животных представлены в таблице 1.

«*» - Р<0,05; «**» - Р<0,01; «***» - Р<0,001.

Из данных таблицы видно, что летальное облучение белых мышей вызывало гемотоксическое действие, которое сопровождалось опустошением костного мозга - апоптотической гибелью миелоцитов, а также реципрокным угнетением гемопоэза с подавлением всех активных ростков костно-мозгового кроветворения: эритроидного, нейтрофильного и лимфоидного. Установлено, что применение предлагаемого препарата (ФЗС)

на фоне летального облучения оказывало гемопротекторное действие, сохраняя пул миелоцитов (миелопротекторное действие) в костном мозге и количество клеток периферической крови (гемопротекторное действие).

Пример 4. Изучение влияния предлагаемого радиозащитного препарата (ФЗС) на иммунобиологическую реактивность организма.

У животных, облученных и леченных испытуемым препаратом по примеру 3, в период разгара острой лучевой болезни (7, 10 сут после облучения), изучали состояние показателей гуморального и клеточного иммунитета на фоне применения ФЗС. Для оценки иммунобиологической реактивности облученных и леченных испытуемым препаратом, белых мышей, в сыворотке крови определяли титры радиоантигенов РНГА-тесте, состояния клеточного иммунитета определяли по содержанию Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. При оценке состояния гуморального иммунитета под воздействием радиогенного фактора и лечебного препарата, в иммунологической тест-системе (РИГА), в качестве индикатора радиоантигенов использовали формалинизированные, танизированные и сенсибилизированные антирадиотоксическими антителами эритроциты барана, которые вступали в реакцию с гомологичными радиоиндуцированными антигенами (радиоантигенами-радиотоксинами). Результаты иммунологических исследований представлены в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что летальное облучение животных индуцировало резкое усиление синтеза радиотоксина, титры которого в РИГА составляли 6,9±0,13 log₂. Резкая антигенемия организма оказывала угнетающие действие на факторы клеточного иммунитета, которое сопровождалось достоверным снижением количества Т- и В- лимфоцитов (снижение их числа составляло в 1,94 и 5,93 раза соответственно).

Применение на фоне иммунотоксического действия гамма-лучей испытуемого препарата (ФЗС) оказывало иммунопротекторное действие, ингибируя синтез токсических антигенов (радикалов) в 4,06 раза, когда концентрация радиотоксина у летально облученных и леченных предлагаемым препаратом животных составляла 1,7±0,55 log₂ против 6,9±0,13 log₂ у облученных не леченных животных (Р<0,001).

Эффективное ингибирование синтеза токсических продуктов радиолиза - радиоантигенов на фоне применения испытуемого препарата оказывало иммунокорегирующее действие на систему иммуногемопоэза. Как видно из данных таблицы 2, при применении испытуемого препарата последовало восстановление количества иммуноцитов (Т- и В- лимфоцитов), количество которых на 10 сут опыта (в период разгара ОЛБ) не имели достоверных отличий от контроля.

Пример 5. Изучение влияния предлагаемого препарата на кишечный биоценоз (аутофлору кишечника).

Для оценки влияния предлагаемого препарата на радиоиоиндуцированный дисбактериоз, у белых мышей, облученных и леченных по примеру 3, на 10 сут (в период разгара острой лучевой болезни) брали пробы фекалий и подвергали их микробиологическому анализу.

Результаты изучения микробной обсемененности кишечника у интактных (контрольных), облученных и леченных испытуемым препаратом (ФЗС) белых мышей представлены в таблице 3.

Примечание: х - Р<0,05.

Из данных таблицы видно, что летальное облучение животных гамма-лучами оказывает резкое изменение кишечного биоценоза, увеличивая количество как аэробных, так и анаэробных микробов, относящихся к постоянной микрофлоре кишечника (кишечная палочка, энторобактерии, клостридии, дрожжеподобные грибы, стафилококки и т.д.), индуцирующие пострадиационный дисбактериоз кишечника.

Таким образом, применение испытуемого препарата на фоне летального облучения оказывает сдерживающее действие на развитие радиоиндуцированного дисбактериоза, нормализуя оптимальный состав микробного биоценоза кишечника.

Пример 6. Изучение цитокининдуцирующей способности предлагаемого радиозащитного препарата ФЗС.

Учитывая, что вещества микробного происхождения (эндотоксины, полисахариды, липополисахариды) являются индукторами медиаторов иммуногемопоэза - цитокинов, а механизм действия стафилотоксина основан на его способности продуцировать интерлейкин-1 (ИЛ-1) и туморнекротизирующий фактор (ТНФ-α), обладающие радиозащитным эффектом, проводили опыты по определению уровня цитокинов в сыворотке крови облученных и леченных ФЗС животных.

Для этой цели, у облученных и леченных по примеру 4 белых мышей в динамике (0, 3, 7, 10, 14 дней после облучения) брали пробы крови, получали сыворотки и в них определяли концентрацию ключевых радиозащитных цитокинов (ИЛ-1 и ФНО-α).

Концентрацию цитокинов в сыворотки крови облученных и леченных ФЗС животных определяли с помощью стандартных тест-систем, разработанных в Государственном НИИ особо чистых препаратов (Санкт-Петербург) и производимых фирмой «Протективный контур» (Санкт-Петербург), на основе «сэндвич» - варианта твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) - применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (см. ст. Ю.С. Лобковой и др. Цитокиновый профиль как критерий оценки специфической иммунотерапии атопических аллергических заболеваний // Ж-л Иммунология. - 1999. - №2 - С. 35-38). Подготовку реактивов, проведение анализа и оценку результатов осуществляли согласно «Инструкций по применению наборов для иммуноферментного анализа ИЛ-1 и ФНО-α», приложенным к наборам.

Результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови облученных и леченных ФЗС животных представлены в таблице 4.

Примечание: хх - Р<0,01, ххх - Р<0,001; 1-я контрольная, 2 - облученная, 3 - облученная + леченная ФЗС, 0 - исходный уровень цитокинов, цифры в колонках - концентрация цитокинов, нг/мл.

Из приведенных в таблице материалов видно, что облучение животных в летальной дозе приводило к ингибированию синтеза медиаторов иммуногенеза - цитокинов, в частности, ключевых факторов иммунологической и противорадиационной защиты - интерлейкина-1 (ИЛ-1) и туморнекротезирующего фактора (ФНО-α), снижая их первоночальный

уровень в 4,52 и 2,16 раза соответственно на 10-й день после облучения (период разгара острой лучевой болезни (ОЛБ)).

Полученные данные свидетельствуют о том, что применение на фоне летального облучения (через 24 ч после лучевого воздействия) животных предлагаемого средства (ФЗС) предотвращало нарушение синтеза изучаемых цитокинов - во все сроки исследования концентрация их недостоверно отличалось от контрольных значений (Р>0,05).

Следовательно, одним из механизмов противорадиационной защиты организма при использовании с лечебной целью продуктов метаболизма стафилакокков является индукция радиозащитных цитокинов - интерлейкина-1 (ИЛ-1) и туморнекротизирующего фактора (ФНО-α), которые способны перехватывать токсические радикалы, предотвращая апоптотическую гибель стволовых клеток костного мозга и лимфоидных клеток - детерминантов выживаемости макроорганизма при острой лучевой болезни.

Пример 7. Изучение радиозащитной активности фильтрата культуры стафилококков на различных видах животных.

Для оценки радиозащитной активности предлагаемого средства (ФЗС) на различных видах животных и для экстраполяции этих данных на крупных (сельскохозяйственных) животных, проводили опыты на 45 белых мышах, 27 белых крысах и 33 кроликах породы «Шиншилла», разделенных на три группы по 15 белых мышей, 9 белых крыс и 11 кроликов в каждой группе соответственно.

Для моделирования острой лучевой болезни (ОЛБ) тяжелой степени тяжести, животных облучали на гамма-установке «Пума» при мощности экспозиционной дозы излучения 3,13⋅10^-5 Кл (кг⋅с) в дозах соответственно 8,0 Гр (белые мыши), 9,0 Гр (белые крысы) и 11,0 Гр (кролики). Через 24 ч после облучения животным однократно подкожно вводили испытуемый препарат (ФЗС) в дозе 0,35-0,40 мг/кг живой массы. За животными в течение 30 дней после облучения вели наблюдение, регистрируя павших и выживших

животных в каждой группе. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы, несмотря на различную радиочувствительность использованных в опытах животных, которая составляла в 1,12-1,22 раза между ними, радиозащитная активность испытуемого препарата для различных по радиочувствительности животных незначительно отличается друг от друга: М±m=77,83±0,77, σ=2,24, CV=8%.

Следовательно, если радиочувствительность сельскохозяйственных животных колеблется в диапазоне доз от 6,5 Гр (крупный и мелкий рогатый скот) до 8,0 Гр (свиньи), а лабораторных животных - от 8,0 Гр до 11,0 Гр, то полученные результаты радиозащитной активности испытуемого препарата легко могут быть экстраполированы на сельскохозяйственных животных, обеспечивая не менее 70%-ной выживаемости сельскохозяйственных животных от ОЛБ.

Результаты сопоставительного анализа полученных данных позволяют сделать вывод о лечебно-профилактическом действии ФЗС путем повышения выживаемости облученных животных, которая реализуется через систему иммуногемопоэза и цитокиновой системы, нейтрализуя радиотоксины и блокируя их доступ к мишеням атаки - стволовым клеткам костного мозга (миелопротекторный эффект), периферической крови (лимфоцитам, моноцитам), являющихся детерминантами выживаемости организма при радиогенном стрессе.

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины и может быть использовано для лечения радиационных поражений организма. Для этого используют бактериальный радиозащитный препарат - стерильный фильтрат фаголизата патогенного штамма стафилококка, который вводят однократно подкожно в дозе 0,35-0,40 мг/кг живой массы через 24 ч после облучения. Применение способа позволяет повысить выживаемость облученных животных до 80%. 5 табл., 7 пр.

Способ лечения радиационных поражений организма, предусматривающий введение в организм бактериального препарата, отличающийся тем, что в качестве бактериального препарата используют радиозащитный препарат - стерильный фильтрат фаголизата патогенного штамма стафилококка, который вводят однократно подкожно в дозе 0,35-0,40 мг/кг живой массы через 24 ч после облучения.