ШТАММ Л-1-23 Eimeria tenella (ВОЗБУДИТЕЛЯ КОКЦИДИОЗА) ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИН, ДИАГНОСТИКУМОВ И ПРОВЕДЕНИЯ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2007 года по МПК C12N1/10 A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностикумов и вакцинных препаратов против кокцидиозов кур, вызываемых Eimeria tenella (E. tenella), а также может быть использовано и для проведения научных исследований.

Кокцидиоз кур, вызываемый Е. tenella, имеет широкое распространение во всех странах и наносит существенный экономический ущерб промышленному птицеводству.

Многие научно-исследовательские центры занимаются изучением как самого паразита, так и вызываемого им заболевания у птиц. Основной целью научных исследований является создание средств и методов диагностики, химио- и специфической профилактики болезни.

Важным методом борьбы с кокцидиозом кур является специфическая иммунопрофилактика. Технология производства и применения вакцин такова, что используемые при их изготовлении штаммы должны обладать высокой иммуногенной активностью, репродуктивностью, не быть устойчивыми к действию различных антикокцидийных препаратов (химиопрепараты и ионофорные антибиотики).

Известен ряд штаммов E. tenella, используемых для производства вакцин [1, 2, 3, 4]. Эти штаммы выделены в других странах и используются при проведении научных исследований и производстве вакцин. Несмотря на то, что антигенные различия у разных штаммов на сегодняшний день не установлены, нельзя исключить, что они существуют. Поэтому появилась необходимость выделения такого штамма Е. tenella, который можно было бы использовать для указанных целей.

В качестве прототипа использован штамм E. tenella Л-1, выделенный из помета больных кокцидиозом цыплят с одной из птицефабрик Ленинградской области [5]. Штамм Л-1 в дозе от 5000 и выше ооцист на голову вызывает у зараженных восприимчивых цыплят острое переболевание с характерными клиническими (угнетенный вид, взъерошенные перья, бледность гребешков и слизистых оболочек, жажда, отказ от корма, кровянистый помет) и патолого-анатомическими признаками (у павших птиц отмечается сильное вздутие и геморрагические поражения слизистой оболочки слепых отростков кишечника). У переболевших цыплят образуется иммунитет к повторному заражению.

Таблица 1
Характеристика штамма Л-1 Е. tenellaПоказатели Размеры ооцист, мкм19,0-26,0 (средняя 22,6-18,8)Индекс формы ооцист1,16Препатентный период, час138Место локализации в кишечникеСлепые отросткиВирулентность, ЛД₅₀50000 ооцист на 1 головуЧувствительность к кокцидиостатикамЧувствителен к ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам

Однако штамм Л-1 Е. tenella обладает высокой вирулентностью, так как вакцинация птицы против кокцидиоза основана на введении в организм строго дозированного количества ооцист паразита, в связи с чем возможные нарушения при вакцинации могут вызывать вспышки кокцидиоза у иммунизированных цыплят.

Задачей изобретения является получение вакцинного штамма Е. tenella, со слабой степенью вирулентности, обладающего высокими иммуногенными свойствами в сочетании со способностью к высокому уровню репродуктивности в организме цыплят.

Поставленная задача достигается штаммом Л-1-23 Eimeria tenella для производства вакцин, диагностикумов и проведения научных исследований. Штамм Л-1-23 Eimeria tenella выделен путем заражения восприимчивого цыпленка одной ооцистой из штамма Л-1 Eimeria tenella.

Штамм Л-1-23 Eimeria tenella депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства Россельхозакадемии под номером 1.

Характеристика штамма Л-1-23 Eimeria tenella

Систематическое положение. Штамм Л-1-23 Е. tenella относится к роду Eimeria, семейству Eimeriidae, отряду Coccidiida.

Морфологическая характеристика. Имеет широкоовальные ооцисты длиной 19,0-26,0 мкм, шириной 16,0-22,0 мкм (средняя 22,6-18,8 мкм).

Биологические свойства. Препатентный период развития паразита составляет 130 часов. Место эндогенного развития паразита в кишечнике инвазированных цыплят - слепые отростки.

Вирулентные свойства. При заражении 15-дневных цыплят ооцистами, хранившимися не более 2-х месяцев, в дозе 800000 ооцист на голову летальность составляет 50% (ЛД₅₀).

Иммуногенные свойства. Заражение цыплят ооцистами вызывает формирование специфического иммунитета (гуморального и клеточного).

Культурально-биохимические свойства. Штамм Л-1-23 Е. tenella не культивируется на питательных средах. Поддерживается путем пассирования на цыплятах, вызывая через 72-96 часов характерные поражения в кишечнике с выделением ооцист, начиная с 130-го часа после заражения.

Штамм чувствителен к антикокцидийным препаратам - ампролиуму, никарбазину, фармкокциду, химкокциду, клинакоксу, ко всем ионофорным антибиотикам.

Специфичность. Штамм Л-1-23 Е. tenella специфичен только для кур. Паразит может проходить полный цикл развития также в куриных эмбрионах.

Пример 1. Использование штамма Л-1-23 Е. tenella для наработки культуры кокцидий для иммунохимиопрофилактики кокцидиозов кур.

Для иммунизации птицы используются специально подобранные штаммы кокцидий, обладающие слабой вирулентностью и высокой иммуногенностью, в дозах, не вызывающих клинического переболевания кокцидиозом. Такими свойствами обладает штамм Л-1-23 Е. tenella. Иммуногенный материал получают следующим образом. 14-дневных цыплят, свободных от кокцидий, заражают перорально ооцистами штамма Л-1-23 Е. tenella из матричной расплодки в дозе 2-3 тысячи на 1 голову. На 6-10 сутки после заражения из собранного от цыплят помета выделяют ооцисты методом флотации в насыщенном растворе поваренной соли. Споруляцию ооцист проводят в 2%-ном растворе двухромовокислого калия при температурном режие 26±2°С в течение 3-5 суток. Спорулированные ооцисты штамма Л-1-23 Е. tenella используют при изготовлении культуры кокцидий, предназначенной для вакцинации цыплят.

Культура кокцидий представляет собой гомогенную стерильную смесь серовато-оранжевого цвета без посторонних примесей, плесени, неразбивающегося осадка, безвредную для цыплят. Пероральное применение культуры кокцидий вызывает субклиническое переболевание цыплят с последующим выделением ооцист во внешнюю среду, что создает возможность естественного реинвазирования хозяина и формирования у него иммунитета, напряженность которого может быть определена с иммуноферментной тест-системы на основе штамма Л-1-23 Е. tenella.

Пример 2. Изучение в экспериментальных условиях антикокцидийной активности препаратов.

В настоящее время основным методом профилактики кокцидиозов кур является использование антикокцидийных препаратов. Первым этапом изучения эффективности (антикокцидийной активности) вновь синтезированных препаратов является проведение экспериментов с использованием интактных цыплят, зараженных лабораторными штаммами кокцидий с известной вирулентностью. К таким штаммам относится штамм Л-1-23 E. tenella.

Интактных цыплят заражают перорально ооцистами штамма Л-1-23 Е. tenella в дозе ЛД₅₀ и сразу начинают давать с кормом изучаемые препараты. Наблюдения за птицей ведут в течение 10 дней. Для оценки антикокцидийной активности препарата используют показатели летальности/выживаемости и привесов, которые служат для определения противококцидиозного индекса (ПКИ).

Таблица 2
Сравнительная оценка эффективности различных кокцидиостатиков при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-1-23 Е. tenellaНазначение группНаименование препаратовДоза препарата, % к кормуДоза ооцист, тысячПроцентПКИвыживаемостипривесаПодопытнаяхимкокцид0,0780010081,2190Подопытнаяникарбазин0,12580010079,7185Контрольная зараженная, без препарата  80053,328,8 Контрольная незараженная00010090,4200

В данном опыте установлено, что и химкокцид и никарбазин обладают выраженной антикокцидийной активностью при заражении цыплят кокцидиями штамма Л-1-23 Е. tenella.

Таким образом, штамм Л-1-23 Е. tenella обладает такими иммунобиологическими свойствами, которые позволяют использовать его для проведения экспериментальных исследований, а также в целях получения антигенного и иммуногенного материала, используемого для диагностики и специфической профилактики заболевания.

Источники информации

1. P.L.Long. Further studies on the patogenicity and immunogenicity of the embrio-adapted strain of Eimeria tenella. Avian Pathology, vol.3, №4, 1975.

2. T.K.Jeffers. Attenuation of Eimeria tenella through selection for precocciousness. J. Parasitol., vol.61, №6, 1975.

3. J. Johnson, W.M.Reid, T.K.Jeffers. Practical immunizatin of chickens against coccidiosis using an attenuated strain of Eimeria tenella. Poultry sciense, vol.58, №1, 1979.

4. T.C.Ivore, P.L.Long, M.Kogut and Joyce Johnson. Attenuation of Eimeria necatrix and E. tenella of U.S. origin by serial embryo passage. Avian Diseases, vol.27, №3, 1983.

5. ТУ-10-07-445-87 "Культура кокцидий для иммунохимиопрофилактики кокцидиозов кур", утверждены Начальником Главного управления ветеринарии Государственного агропромышленного Комитета СССР 20.07.1987.

Изобретение относится к ветеринарной паразитологии и биотехнологии. Штамм Л-1-23 Eimeria tenella депонирован в коллекции Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства Россельхозакадемии под номером КЭ №1. Штамм выделен от больного цыпленка, цыпленка, зараженного одной ооцистой из штамма Л-1 Eimeria tenella. Штамм специфичен только для кур, паразит может проходить полный цикл развития также в куриных эмбрионах. Штамм обладает такими иммунобиологическими свойствами, которые позволяют использовать его для проведения экспериментальных исследований, а также в целях получения антигенного и иммуногенного материала, используемого для диагностики и специфической профилактики заболевания. 2 табл.

Штамм Л-1-23 Eimeria tenella (коллекция Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства, КЭ №1) для производства диагностикумов и вакцин и для проведения научных исследований.