ШТАММ ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПРОТЕИНАЗ, ПЕПТИДАЗ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, α-АМИЛАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ Российский патент 2008 года по МПК C12N1/14 C12N9/00 C12R1/69 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к созданию нового штамма Aspergillus oryzae POM-156 - продуцента комплекса протеиназ и пептидаз, α-амилазы, ксиланазы, β-глюканазы; оптимум действия рН 4,5-5,5 с высокой продуктивностью экзогидролаз. Штамм получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза комплекса протеолитических, амилолитических и целлюлолитических ферментов гемицеллюлазного действия при глубинном способе культивирования продуцента.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения комплекса протеиназ и пептидаз, α-амилазы, ксиланазы и β-глюканазы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности: спиртовой, мясомолочной, пивоваренной, винодельческой, сельскохозяйственной и других. Это обусловлено тем, что перерабатываемое сельскохозяйственное сырье содержит высокомолекулярные белковые полимеры. Наиболее характерное практическое применение комплексных препаратов протеолитического, амилолитического и целлюлолитического действия связано с интенсификацией биотехнологических процессов производства спирта, пива и т.д. Наличие в комплексе пептидаз, протеиназ, а также β-глюканазы позволяет использовать ферментные препараты для протеолиза микробного белка с целью получения биологически активных пищевых и кормовых добавок. Гидролитические ферменты получают как продукт биосинтетической деятельности грибов или бактерий [1, 2]. Однако использование грибов более предпочтительно, чем бактерий, так они синтезируют сложный комплекс протеаз, в состав которого входят активные пептидазы и протеиназы, а также богатый комплекс сопутствующих ферментов, осуществляющих более эффективный катализ высокомолекулярных микробного, растительного и животного сырья полимеров в кислой и слабокислой зоне рН. В связи с этим селекция новых грибных штаммов для получения комплекса гидролаз актуальна.

Известны штаммы - продуценты грибных протеаз из рода Aspergillus oryzae 251-90, 824-32 [3, 4], при глубинном культивировании которых синтезируются кислые и слабокислые протеазы. Недостатками этих продуцентов являются их низкая продуктивность, сложный состав питательных сред, а также длительный период роста продуцентов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus oryzae 387, регистрационный номер ВКПМ F-683 [2], один из наиболее активных продуцентов протеаз и комплекса других гидролитических ферментов. В глубинной культуре известного штамма Aspergillus oryzae 387 на 42 часа роста протеолитическая активность достигает 11,5 ед. ПС/см³ в зависимости от состава питательной среды.

Недостатком этого штамма является низкий уровень активности протеаз и сопутствующих ферментов в культуральной жидкости (к.ж.) гриба.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса: протеаз, содержащих активные карбокси- и аминопептидазы и протеиназы, а также сопутствующих ферментов - α-амилазы, β-глюканазы и ксиланазы.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма Aspergillus oryzae РОМ-156, заключается в получении более активного комплекса протеиназ и пептидаз, уровень активности которого в 2,5-3,9 раза превышает аналог, а также сопутствующих ферментов с высокой активностью в культуральной жидкости, превышающей аналог: по β-глюканазе - в 6-10 раз, по α-амилазе - в 1,3-1,4 раза, по ксиланазе - в 1,6-1,9.

Задача решается созданием нового штамма - продуцента комплекса гидролаз путем селекции и мутагенеза из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (5), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах и активному синтезу комплекса протеаз, β-глюканазы, α-амилазы и ксиланазы.

Заявляемый штамм Aspergillus oryzae POM-156 получен путем многоступенчатой селекции и мутагенеза с использованием эффективных химических и физических мутагенов, депонирован в ВКПМ под №F-931.

В результате мутагенеза после неоднократного отбора и рассева вариантов был получен штамм Aspergillus oryzae POM-156 - продуцент комплекса протеаз, α-амилазы, β-глюканазы и ксиланазы, обладающий высокой скоростью роста и продуктивностью комплекса перечисленных ферментов.

Изучали уровни продукции ферментативного комплекса в культуральной жидкости, полученной путем выращивания заявляемого штамма и известного штамма в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Общую протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона с использованием в качестве субстрата бычьего гемоглобина при оптимальных условиях действия протеаз, амилолитическую активность - по ГОСТ 20264.4-89, ксиланазную - по Шомоди-Нельсону, β-глюканазную - глюкозооксидазным методом. Сравнительные показатели уровней ферментативных активностей культуральной жидкости штамма Aspergillus oryzae POM-756 с прототипом представлены в табл.1 и табл.3.

Таким образом, в результате селекции и мутагенеза получен новый штамм Aspergillus oryzae РОМ-156, обладающий высоким уровнем синтеза комплекса протеаз: пептидаз и протеиназ, β-глюканазы, а также α-амилазы и ксиланазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения комплекса ферментов при использовании штамма Aspergillus oryzae POM-156. Штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим признакам.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г. Москвы.

Штамм Aspergillus oryzae POM-156 характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки. Через 6 суток роста на сусло-агаре образуются колонии диаметром 86-88 мм, поверхность колонии шероховатая, складчатая, профиль колонии плоский, форма колонии округлая, края волнистые, цвет - светло-салатовый, с возрастом цвет колонии темнеет. Цвет с обратной стороны - песочный.

При росте на агаризованной среде Чапека размер колонии через 6 суток 45-47 мм, цвет колонии коричнево-зеленый, форма колоний округлая, края ровные, белые, отмечается радиальная складчатость.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий гриба септированный, хорошо разветвленный, со вздутиями, конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма, в основном, округлая; толщина гиф 4-8 мкм.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма - дыхание. Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста 30-32°С, максимальная - 50°С, минимальная - 18°С. Оптимальное значение рН среды для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,4; рост продуцента имеет место в зоне рН от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки.

Штамм непатогенный.

Штамм Aspergillus oryzae POM-156 использовали для получения комплекса протеаз, β-глюканаз, а также ферментов амилолитического и ксиланолитического действия.

При глубинном культивировании штамма Aspergillus oryzae РОМ-156 в зависимости от условий протеолитическая активность составляет 28,0-39,2 ед. ПС/см³, амилолитическая - 14-17 ед. АС/см³, β-глюканазная - 3,8-4,8 ед. β-ГкС/см³, ксиланазная - 5,6-7,8 ед. КС/см³ (табл.3).

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 и штамм 387 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; КН₂РО₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 1). Ферментационную питательную среду засевают вегетативным посевным материалом в количестве 4%, выращенным при 30°С в течение 18 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³ ферментационной питательной среды, на круговой качалке (220-240 об/мин) при температуре 30-32°С в течение 38 часов. Максимальное накопление ферментов наблюдалось у штамма A.oryzae РОМ-156 к 38 часам культивирования. Уровень активности составлял: по протеазе - 28,0 ед. ПС/см³, по β-глюканазе - 4,1 ед. β-ГкС/см³, по α-амилазе - 14,0 ед. АС/ см³, по ксиланазе - 6,8 ед. КС/ см³ (табл.1). В состав синтезируемого комплекса протеаз входят: сериновая протеиназа - 0,081 ед./см³, карбоксильная - 1,19 ед./см³, металлозависимая - 0,412 ед./см³, лейцинаминопептидаза - 2,3 ед./см³, карбоксипептидаза - 0,79 ед./см³ (табл.2).

Пример 2. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 3,0; пшеничные отруби - 3,0; кукурузные столбики - 1,0 KH₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 2). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 39,2 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,8 β-ГкС/см³, амилолитическая - 17,0 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 7,8 ед. КС/см³.

Пример 3. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 4,0; соя - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 3). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 32,2 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,2 β-ГкС/см³, амилолитическая - 14,3 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 5,5 ед. КС/см³.

Пример 4. Штамм Aspergillus oryzae POM-156 культивируют на питательной среде следующего состава, %: ячменная мука - 4,0; соя - 0,5; солодовые ростки - 1,0; КН₂PO₄ - 1,5; остальное - водопроводная вода, рН - естественный (среда 4). Условия ферментации, аналогичные примеру 1. Активность внеклеточных протеаз составляет 31,4 ед. ПС/см³, β-глюканазная - 4,3 β-ГкС/см³, амилолитическая - 14,0 ед. АС/см³, ксиланолитическая - 5,7 ед. КС/см³.

Таблица 1Сравнительная оценка физиологической активности грибов Aspergillus oryzae - продуцентов протеазШтаммДлительность культивирования, часПротеолитическая активность, ед. ПС/см³ПСβ-ГкСACКС3874211,50,410,54,1РОМ-1563828,04,114,06,8

Таблица 2Биохимический состав ферментативных комплексов, синтезируемых микромицетом Aspergillus oryzaeНаименование ферментаШтамм A.oryzae387POM-56Общая протеолитическая акт-сть РН-5.5, ед. ПС/см³11,528,0Протеиназы  Сериновая0,0470,081Карбоксильная0,6031,190Металлозависимая0,1950,412Пептидазы  Лейцинамино-0,982,30Карбокси-0,370,79

Таблица 3Влияние питательных сред на ферментативную активность гриба Aspergillus oryzae шт.387 и шт. РОМ-156Штамм№ питательной средыФерментативная активностьПСβ-ГкСACКСед./см³% увеличенияед./см³% увеличенияед./см³% увеличенияед./см³% увеличения3871
2
3
49,7
10,1
9,8
9,4-
-
-
-0,5
0,8
0,6
0,7-
-
-
-11,3
12,3
10,8
10,2-
-
-
-3,8
4,2
3,4
3,2-
-
-
-РОМ-1561
2
3
430,0
39,2
32,2
31,4210
288
228
2343,8
4,8
4,2
4.3660
500
600
51515,0
17,0
14,3
14,032
38
32
376,2
7,8
5,5
5,763
86
62
78

Источники информации

1. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - М.: Изд. «Элеватор», 2000.

2. Патент РФ 2208633, кл. С 12 N 1/20, 2001.

3. Зуева Р.В. Физиолого-биохимические исследования экспериментально полученного мутанта Aspergillus oryzae - активного продуцента кислой протеиназы. Автореферат канд. диссертации. - М., 1971.

4. А.с. СССР №1440922, кл. С12N 1/14, 1988.

5. Патент РФ 2070921, 1993.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae РОМ-156 получен селекцией из известного штамма Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза. Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром, в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии г.Москвы. Изобретение обеспечивает получение комплекса протеиназ и пептидаз, уровень активности которого в культуральной жидкости превышает аналог: по β-глюканазе - в 6-10 раз, по α-амилазе - в 1,3-1,4 раза, по ксиланазе - в 1,6-1,9 раза при сокращении длительности процесса культивирования. 3 табл.

Штамм гриба Aspergillus oryzae РОМ-156, ВКПМ F-931 - продуцент комплекса протеиназ и пептидаз, β-глюканазы, α-амилазы и ксиланазы.