ШТАММ ГРИБА Aspergillus foetidus - ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ПЕКТИНАЗ, β-ГЛЮКАНАЗЫ, КСИЛАНАЗЫ, ЦЕЛЛЮЛАЗЫ, ХИТИНАЗЫ, МАННАНАЗЫ И ПРОТЕАЗЫ ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ПОЛИМЕРОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И МИКРОБНОГО СЫРЬЯ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/14 C12N9/24 C12N9/42 C12N9/62 C12R1/66 

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К-5-1 продуцирует комплекс гидролитических ферментов и депонирован в коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ГНУ ВНИИСХМ под номером RCAM 01136. Изобретение обеспечивает активный синтез комплекса ферментов: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, применяемых в пищевой промышленности для деструкции растительных субстратов и микробной биомассы, с целью получения биологически активных добавок с заданными функциональными свойствами.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136) получен с использованием эффективных методов селекции и мутагенеза с применением УФ-облучения и нитрозогуанидина (концентрация 0,3%, экспозиция 20 минут) из известного штамма Aspergillus foetidus 379-К (ВКПМ-F-962), используемого для глубинного культивирования при производстве пектиназ.

Изобретение обеспечивает получение комплексного ферментного препарата с широкой субстратной специфичностью для глубокой деструкции растительного и микробного сырья на основе глубинного культивирования нового штамма - продуцента гидролитических ферментов.

Ферменты, катализирующие гидролиз полисахаридов, имеют большое промышленное значение в перерабатывающих отраслях пищевой промышленности для реализации биокаталитических процессов, обеспечивающих эффективную деструкцию полимеров растительного и микробного сырья в технологиях производства соков, морсов, экстрактов и биопрепаратов пищевого и кормового назначения. В связи с этим, селекция новых штаммов - продуцентов комплекса высокоактивных гидролаз: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, весьма актуальна.

Известен штамм - продуцент комплекса гидролаз, содержащего ксиланазы, β-глюканазы, пектиназы и ксилоглюканазы из рода Aspergillus - Aspergillus aculeatus [1]. Недостатком этого продуцента является отсутствие секретируемых им хитинолитических, протеолитических и маннанолитических ферментов.

Известен штамм-продуцент целлюлаз, β-глюканаз и ксиланаз из рода - Trichoderma - Trichoderma longibrachiatum [2]. Недостатком этого продуцента является отсутствие секретируемых им пектолитических, хитинолитических и протеолитических ферментов.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Aspergillus foetidus 379-К - один из наиболее активных продуцентов пектиназ, регистрационный номер ВКПМ-F-962 (Патент РФ №2393212, 2010) [3].

Недостатком этого штамма является низкий уровень активности β-глюканазы, хитиназы и маннаназы, необходимых для деструкции микробного сырья.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма микромицета Aspergillus foetidus, обладающего высокой способностью к образованию комплекса гидролитических ферментов: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136), заключается в получении более активного комплекса ферментов, катализирующих гидролиз полисахаридов, уровень активности которых в 2,0-4,0 раза превышает показатели аналога, а также эндополигалактуроназы и пектинэстеразы, уровень активности которых в культуральной жидкости превышает показатели аналога в 1,5 раза, и протеазы, превышающей показатели аналога в 1,2 раза.

Сущность настоящего изобретения - получение нового штамма - продуцента комплекса высокоактивных гидролаз: пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы.

Задача решается созданием нового штамма - продуцента комплекса гидролаз путем селекции и комбинированного мутагенеза (химического и физического) из известного штамма Aspergillus foetidus 379-К, способного к синтезу комплекса гидролитических ферментов, необходимых для деструкции микробного и растительного сырья.

Заявляемый штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136) получен путем многоступенчатой селекции с использованием эффективных методов мутагенеза с использованием УФ-облучения и нитрозогуанидина.

Активности гемицеллюлолитических ферментов определяли методом Шомоди-Нельсона, основанном на измерении скорости образования восстанавливающих Сахаров при гидролизе субстрата, в результате действия ферментов (3). Активности эндополигалактуроназы и пектиэстеразы по ГОСТ 20264.3-81. Сравнительные показатели уровней активности ферментов в культуральной жидкости штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1 с прототипом представлены в таблице 1.

Таким образом, в результате селекции и комбинированного мутагенеза получен новый активный штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 (RCAM 01136), обладающий высоким уровнем синтеза комплекса гидролаз, в том числе пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы, что позволяет повысить эффективность технологических процессов при гидролизе растительного и микробного сырья с целью получения комплексных пищевых добавок.

Таблица 1 Сравнительные показатели уровня активности ферментов в культуральной жидкости грибов Aspergillus foetidus 379-К и Aspergillus foetidus 379-К-5-1 Активности ферментов Aspergillus foetidus   Шт.379-К Шт.379-К-5-1 β-Глюканазная, ед β-ГкС/см³ 6,5 13,3 Целлюлазная, ед ЦС/с³ 2,6 6,1 Ксиланазная, ед КС/см³ 3,3 13,5 Маннаназная, ед МС/см³ 0,27 0,64 Хитиназная, ед ХС/см³ 0,024 0,05 Протеазная, ед ПС/см³ 2,2 2,7 Эндополигалактуроназная, ед Эндо-ПгС/см³ 2,01 3,7 Пектинэстеразная, ед ПэС/см³ 2,1 3,3

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры и на косяках с сусло-агаром в отделе нанотехнологий ферментов, дрожжей, органических кислот и биологически активных добавок Государственного научного учреждения ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии г. Москвы.

Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 депонирован во Всероссийской Коллекции Полезных Микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ под коллекционным номером RCAM 01136.

Культурально-морфологические признаки штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1:

Культура представляет сильно ветвящийся мицелий, разделенный перегородками. Конидии, образуемые микромицетом, гладкие. Форма конидий круглая, редко встречается овальной формы. Цвет конидий черный, с обильным образованием воздушного мицелия. Колонии выпуклые с возвышенностью в центре. Обратная сторона колонии коричневая. Поверхность колонии складчатая.

На среде сусло-агар колонии круглые, к 5 суткам достигают 37-38 мм, имеют мозговидную складчатость. Центральная зона колонии - зона обильного спороношения - диаметром 12-14 мм черного цвета с темно-коричневым оттенком и обильным образованием воздушного мицелия. Край колонии ровный. Обратная сторона колонии коричневого цвета.

На среде с мальтозой колонии круглые, по краю колонии обильный мицелий, размер колонии на 5 сутки - 32-34 мм, край колонии гладкий и ровный, структура колоний крупнозернистая, колонии крупные. Поверхность колоний складчатая. Обратная сторона колонии темно-серого цвета.

На среде с экстрактом солодовых ростков и пшеничных отрубей колонии круглые, по всей колонии воздушный мицелий, край колонии ровный и гладкий, структура колонии мелкозернистая, колонии крупные размер колонии на 5 сутки - 38-40 мм. Поверхность колонии сильно складчатая.

На среде с крахмалом колонии черного цвета, форма колоний круглая, край колоний гладкий, структура колоний крупнозернистая, колонии крупные, размер колонии на 5 сутки - 30-32 мм. Обратная сторона колонии светло-коричневая.

Физиолого-биохимическая характеристика штамма Aspergillus foetidus 379-К-5-1:

Штамм ассимилирует нитратные и аммонийные соли. Культура слабо усваивает глюкозу. Хорошо усваивает мальтозу, крахмал и сахарозу.

Дыхание аэробное. Оптимальная температура роста 28-30°С; оптимальное значение pH для роста и биосинтеза гриба 5,3-5,5. Рост продуцента имеет место в зоне pH от 2,7 до 3,0. Патогенными свойствами не обладает.

Пример 1. Штаммы Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%, (NH₄)₂SO₄ - 1,1%, KH₂PO₄ - 0,5%, MgSO₄ - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную питательную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 100 см³, на круговой качалке 220 об/мин при температуре 30°С в течение 72 часов. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составлял: по β-глюканазе - 12,4 ед/см³ и 5,7 ед/см³, по ксиланазе - 8,7 ед/см³ и 5,9 ед/см³, по целлюлазе - 6,0 ед/см³ и 4,8 ед/см³, по хитиназе - 0,039 ед/см³ и 0,018 ед/см³, по маннаназе - 0,57 ед/см³ и 0,19 ед/см³, по протеазе - 2,4 ед/см³ и 1,7 ед/см³, по эндополигалактуроназе - 3,2 ед/см³ и 1,85 ед/см³, по пектинэстеразе - 2,9 ед/см³ и 1,73 ед/см³ соответственно.

Пример 2. Штаммы Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%; (NH₄)₂SO₄ - 1,1%; KH₂PO₄ - 0,5%; MgSO₄ - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 100 см³ питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 48 часов.

Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составляет: по β-ГкС - 9,0 ед/см³ и 5,2 ед/см³; по КС - 13,5 ед/см³ и 7,6 ед/см³; по КМЦ - 6,1 ед/см³ и 5,0 ед/см³, по ХС - 0,035 ед/см³ и 0,012 ед/см³, по МС - 0,34 ед/см³ и 0,10 ед/см³, по ПС-1,5 ед/см³ и 1,2 ед/см³, по Эндо-ПгС - 3,7 ед/см³ и 2,01 ед/см³, по ПэС - 1,8 ед/см³ и 1,02 ед/см³ соответственно.

Пример 3. Штамм Aspergillus foetidus 379-К-5-1 и 379-К культивируют на питательной среде следующего состава: солодовые ростки - 5,0%, пшеничные отруби - 10,0%; (NH₄)₂SO₄ - 1,1%; KH₂PO₄ - 0,5%; MgSO₄ - 0,5%; остальное - водопроводная вода, pH - естественный. Ферментационную среду засевают споровым посевным материалом в количестве 2%, выращенным при 30°С в течение 120 часов. Культивирование гриба осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 100 см³ питательной среды на качалке 220 об/мин, при температуре 30°С в течение 96 часов.

Максимальное накопление по β-глюканазе наблюдалось у штамма А. foetidus 379-К-5-1 к 96 часам культивирования. Уровень активности ферментов, синтезируемых штаммами 379-К-5-1 и 379-К, составлял: по β-глюканазе - 13,3 ед/см³ и 6,5 ед/см³, по ксиланазе - 3,6 ед/см³ и 1,56 ед/см³, по целлюлазе - 2,4 ед/см³ и 0,89 ед/см³, по хитиназе - 0,05 ед/см³ и 0,024 ед/см³, по маннаназе - 0,64 ед/см³ и 0,27 ед/см³, по протеазе - 2,7 ед/см³ и 2,2 ед/см³, по эндополигалактуроназе - 2,6 ед/см³ и 1,3 ед/см³, по пектинэстеразе - 3,3 ед/см³ и 2,1 ед/см³ соответственно (табл.2).

Таблица 2 Влияние длительности культивирования на физиологическую активность микромицетов Aspergillus foetidus продуцентов гидролаз Штамм гриба Длительность культивирования, ч Ферментативная активность, ед./см³ β-ГкС ХС МС Эндо-ПгС ПэС 379-К 48 5,2 0,012 0,1 2,01 1,02 72 5,7 0,018 0,19 1,85 1,73 96 6,5 0,024 0,27 1,3 2,1 379-К-5-1 48 9,0 0,035 0,34 3,7 1,8 72 12,4 0,039 0,45 3,2 2,5 96 13,3 0,05 0,64 2,6 3,3

Источники информации

1. Микробные ферменты и биотехнология. Под редакцией В.М. Фогарти. - Москва: Агропромиздат, 1986.

2. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - Москва: Издательство «Элевар», 2000.

3. ГОСТ Р 53973-2010 Препараты ферментные. Методы определения β-глюканазной активности.

4. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ, 1995, с.144-156.

Аналогичные патенты РФ

1. Патент РФ №2303057 С1, C12N 1/14, C12N 9/42. Штамм мицелиального гриба Aspergillus aculeatus - продуцент комплекса карбогидраз, содержащего ксиланазы, бета-глюканазы, пектиназы и ксилоглюканазы.

2. Патент РФ №2303065 C1, C12N 9/42, C12N 1/14. Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum - продуцент целлюлаз, бета-глюканаз и ксиланаз.

3. Патент РФ №2393212 C1, C12N 1/20, C12N 9/24. Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К - продуцент пектолитических ферментов.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Предложен штамм микромицета Aspergillus foetidus 379-К-5-1 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полисахаридов растительного и микробного сырья. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM 01136. Преимуществом нового штамма является получение более активного комплекса ферментов, катализирующих гидролиз полисахаридов, а также эндополигалактуроназы и пектинэстеразы. Штамм Aspergillus foetidus RCAM 01136 получен с использованием эффективных методов селекции и мутагенеза с применением УФ-облучения и нитрозогуанидина из известного штамма. Изобретение позволяет расширить ассортимент получаемых ферментов, используемых для деструкции полисахаридов. 2 табл.

Штамм гриба Aspergillus foetidus 379-К-5-1, депонированный в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM 01136 - продуцент комплекса пектиназ, β-глюканазы, ксиланазы, целлюлазы, хитиназы, маннаназы и протеазы для деструкции полимеров растительного и микробного сырья.