ШТАММ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ И АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Российский патент 2013 года по МПК C12N1/14 C12N9/58 C12N9/30 C12R1/69 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению штамма - продуцента протеолитических и амилолитических ферментов, и может быть применено для гидролиза растительных и животных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве.

Известно, что мицелиальный гриб Aspergillus oryzae имеет широкое применение в пищевой промышленности, так как не обладает патогенными свойствами. Биосинтез протеаз и амилаз, характерный для представителей Aspergillus oryzae, используется, например, при изготовлении некоторых пищевых продуктов (ферментированных приправ, ферментированных напитков), когда требуется гидролиз белков и углеводов (RU 2361914, 2009, RU 2187947, 2002).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-369, обладающий способностью продуцировать комплекс протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне pH, α-амилазу. Однако основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует α-амилазу и протеазу на жидких средах лишь на четвертые - пятые сутки (SU 1440922, 1988).

Известен штамм Aspergillus oryzae ВКПМ F-683, продуцирующий комплекс кислых и слабокислых протеаз, α-амилазы и сопутствующих ксиланаз, глюканаз и цитаз. Известно, что при глубинном культивировании данный штамм продуцирует целый комплекс высокоактивных ферментов. Получаемые ферментные комплексы применяются в пищевой промышленности.

Однако применение штамма является ограниченным из-за недостаточно высокой скорости роста и особых требований к питательным средам, так как он растет на средах с содержанием сухих веществ не более 18% (RU 2070921, 1996).

Задача изобретения состоит в получении штамма Aspergillus oryzae, продуцирующего протеазы и α-амилазу, обладающего высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании.

В качестве изобретения предлагается новый штамм микромицета Aspergillus oryzae 37-53, полученный методом многоступенчатой селекции и мутагенеза, депонированный в ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM) под регистрационным номером RCAM01135. Штамм является продуцентом протеаз и α-амилазы, обладает высокой скоростью роста, преимущественно при твердофазном культивировании, и интенсивным спорообразованием.

Техническим результатом изобретения является более высокая скорость роста предлагаемого штамма Aspergillus oryzae RCAM01135.

В частности, на средах с соевым шротом максимумы протелитической и амилолитической активностей проявляются на третьи сутки культивирования, и интенсивность спорообразования была самой высокой также на третьи сутки. Это позволяет рассматривать заявленный штамм как перспективное средство для использования в пищевой промышленности для переработки сельскохозяйственного сырья, например сои, с целью получения различных пищевых вкусоароматических добавок, в бродильном производстве, хлебопекарной промышленности.

Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки:

а) характер роста (опушение, край колонии). Колонии пушистые, округлой формы, края ровные, мицелий белый, спорообразующий, цвет колонии от оливкового до темно-зеленого. Вегетативный мицелий септированный, хорошо разветвленный с крупными вздутиями, толщина гиф 6-12 мкм; конидии формируются экзогенно, поверхность конидии гладкая, форма округлая, диаметр спор 5-6 мкм; образует конидиальные головки с одноярусными стеригмами;

б) размер колонии (при определенном времени инкубации). На 3 сутки роста на сусло-агаре диаметр колонии 50×51 мм;

в) воздушный мицелий (наличие, цвет, особенности спороношения). С обильным спороношением темно-зеленого цвета. По краю колонии белый пушистый мицелий 3 мм;

г) цвет субстратного мицелия. Белый;

д) цвет обратной стороны колонии. Светло-коричневый;

е) другие признаки (пигмент, экссудат и т.д.). Пигменты не выделяются, экссудат отсутствует;

ж) изменения культуры по мере старения. Цвет колонии с возрастом темнеет, становится буро-зеленым;

з) поведение на других средах. На среде Чапека с глюкозой: на 3 сутки роста цвет колонии - зеленый, поверхность гладкая; диаметр колонии 32×34 мм.

По исследованиям морфологических признаков культуры проведена идентификация штамма в соответствии с определителем мицелиальных грибов (Билай В.И., Коваль Э.С. Аспергиллы. Определитель. - Киев: Наук. Думка, 1988, - 204 с.).

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к кислороду - аэроб. Оптимальная температура роста - 28-30°C. Максимальная температура - 50°C. Минимальная температура - 18°C. Оптимальное значение pH для роста гриба - 5,5. Рост гриба отмечается в диапазоне pH от 2,5 до 10,0.

В качестве источника углерода гриб использует крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин и лактозу. Ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный. В режиме глубинного и твердофазного культивирования была установлена способность к синтезу ферментов амилолитического и протеолитического действия.

Штамм хранится на агаризованном солодовом сусле 8% CB; pH среды - естественный; температура хранения +20-25°C.

Пример 1

Глубинное и твердофазное культивировстие штамма Aspergillus oryzae RCAM01135

Глубинное культивирование штамма Aspergillus oryzae 37-53 осуществляли на различных комплексных естественных средах, составленных с учетом физиологических потребностей продуцента. При конструировании питательных сред принимали во внимание то обстоятельство, что для синтеза протеаз и α-амилазы благоприятны крахмал, белки, поэтому основными компонентами среды являлось зерновое сырье. В качестве источника фосфорного питания для микромицета применяли фосфорнокислый калий. Таким образом, для глубинного культивирования штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 были использованы питательные среды следующего состава, %:

1. Ячменная мука - 3,0, пшеничные отруби - 3,0, крахмал - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5;

2. Пшеничная мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5%;

3. Соевая мука - 6,0, ячменная мука - 5,0, KH₂PO₄ - 1,5;

4. Соевая мука - 6,0, пшеничные отруби - 2,0, KH₂PO₄ - 1,5;

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 см³, содержащих 50 см³ стерильной питательной среды, на круговой качалке с числом оборотов 220 об/мин при температуре 30°C. Полученные результаты представлены в табл.1.

Таблица 1 Глубинное культивирование гриба Asp.oryzae RCAM01135 на натуральных питательных средах № среды Сутки Рост (густота, цвет КЖ) pH РСВ, % Ферм, акт-сть, ед./см³ ПС АС 1 1 ++бежевая каша 4,74 4,0 - - 2 +хаки (желтоватая) каша 4,8 2,8 1,5 0,64 3 +хаки (желтоватая) жижа 5,36 2,2 1,8 0,82 2 1 ++++бежевая каша 5,09 3,0 - - 2 ++хаки (желтоватая) каша 5,42 2,0 1,3 0,93 3 ++хаки светлая жижа 5,6 2,2 1,5 1,10 3 1 +++++очень густая бежевая каша 5,69 5,0 - - 2 темная бежевая каша 7,6 5,0 0,05 0,35 3 ++++хаки темная каша 8,46 5,4 0,03 0,56 4 1 +++++густая бежевая каша 7,10 5,0 - - 2 темная бежевая каша 8,33 4,9 0,06 0,35 3 +++хаки темная каша 8,73 5,4 0,02 0,12

Как видно из таблицы 1, селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 на питательных средах, содержащих ячменную или пшеничную муку, а также пшеничные отруби (среды №1 и 2), проявлял способность к синтезу протеаз и α-амилазы: общая протеолитическая активность на 3-и сутки культивирования составила 1,5-1,8 ед. ПС/см³, амилолитическая 0,82-1,10 ед. АС/см³. На средах, в состав которых входила соеваая мука (среды №3 и 4), уровень активности синтезируемых ферментов снижался в 2-3 раза.

Твердофазное культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на пшеничных отрубях с влажностью 52,4% и на соевом шроте с влажностью 51,8% при температуре 30°C в стационарных условиях. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2 Поверхностное культивирование гриба A.oryzae RCAM01135 на различных средах Среда для культивирова
ния Характеристика роста гриба, сутки Ферментативная активность, ед./г 2 4 7 ПС АС Отруби Белый мицелий, начало спорообразования, цвет спор зеленый Обильное спорообразование, споры пылят, цвет зеленый с оливковым оттенком Без изменений 43,5 9,0 Соевый шрот 1 2 3 41,0 12,0 Белый мицелий Обильное спорообразование, цвет спор зеленый с оливковым оттенком Обильное спорообразование, споры оливкового цвета

Результаты глубинного и твердофазного культивирования подтверждают биосинтетическую способность селекционированного штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 по отношению к протеолитическим и амилолитическим ферментам, что характерно грибам рода Aspergillus вида oryzae.

Таким образом, полученный штамм хорошо развивается на жидких и твердых питательных средах, синтезирует ферменты протеолитического и амилолитического действия и идентифицирован как мицелиальный гриб Aspergillus oryzae.

Пример 2

Культивирование штамма Aspergillus oryzae RCAM01135 на средах с соевым шротом

Наработку экспериментальных образцов селекционированной культуры Aspergillus oryzae RCAM01135 осуществляли на среде с соевым шротом и на соевом шроте с добавлением 10% перловки с разной влажностью в течение 3-х суток при 30°C (табл.3).

Таблица 3 Биохимическая характеристика экспериментальных образцов гриба A.oryzae RCAM01135 Среда для культивирова
ния Влажность поверхн. культуры, % Биохимические показатели гриба Белок по Кьельдалю, % а.с.в. Белок по Лоури, мг/г а.с.в. $$n{h}_2^{+}$$
мг%/г а.с.в. Соевый шрот 58,7 43,0 35,0 317,0 Соевый шрот +10% перловки 51,3 41,0 52,8 309,7 62,4 44,3 58,3 322,5

Экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были получены в результате ускоренного роста микромицета при поверхностном культивировании на соевом шроте, обогащены белком, аминным азотом и могут быть использованы для дальнейшей переработки в производстве продуктов ферментации сои.

Селекционированный штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 и наработанные экспериментальные образцы гриба A.oryzae RCAM01135 были исследованы в Испытательной лаборатории технохимического контроля и арбитражных методов анализа ГНУ ВНИИПБТ Россельхоакадемии.

Результаты испытаний по идентификации ГМИ показали, что в чистой культуре микромицета Aspergillus oryzae RCAM01135 трансгенные последовательности отсутствуют (протокол испытаний от 23 марта 2012 г.).

При анализе тяжелых металлов в экспериментальных образцах гриба A. oryzae RCAM01135 было установлено, что их содержание не превышает предельно допустимых концентраций (протокол от 18 апреля 2012 г.). В таблице 4 приведены результаты анализа по содержанию тяжелых металлов в субстрате - соевом шроте и в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135. Аналогичные результаты получены во всех исследуемых экспериментальных образцах.

Таблица 4 Содержание тяжелых металлов в поверхностной культуре гриба A.oryzae RCAM01135 Анализируемый объект Содержание тяжелых металлов, мг/кг Свинец Pb Мышьяк As Кадмий Cd Ртуть Hg Соевый шрот 0,0052 0,0034 0,0027 0,0009 (ПДК для сои)¹ (¹СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов») 0,5 0,3 0,1 0,02 Поверхностная культура гриба A.oryzae 37-53 0,0065 0,0047 0,0029 0,0014

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты. Депонирован в ГНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM01135. Может быть использован при получении различных пищевых продуктов (ферментированных приправ, добавок, напитков). Изобретение позволяет повысить скорость роста и интенсивность спорообразования. 4 табл., 2 пр.

Штамм микромицета Aspergillus oryzae, депонированный в ГНУ ВНИИСХМ (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения - RCAM) под регистрационным номером RCAM01135, - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов для использования в пищевой промышленности.