ШТАММ Bacillus subtilis P-1 - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕАЗЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 C12N9/56 C12N9/56 C12R1/125 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к созданию нового штамма, используемого для получения фермента - протеазы. Протеолитические ферменты широко используются в медицине, в пищевой, сельскохозяйственной, кожевенной промышленности и других отраслях народного хозяйства. Протеолитические ферменты получают в качестве продуктов биосинтетической деятельности из грибов или бактерий. Однако бактерии использовать предпочтительнее, т.к. они имеют более быстрый цикл развития и синтеза протеазы по сравнению с грибами. В связи с этим селекция новых бактериальных штаммов для получения протеаз актуальна и в настоящее время.

Наиболее близким к заявляемому объекту является штамм Bacillus subtilis ФУ-79, регистрационный ЦМПМВ-1989 (1), один из наиболее сильных продуцентов протеазы. Известный штамм может продуцировать протеазу в количестве 14,7-30 ПЕ/мл, в зависимости от питательной среды, за 38 часов биосинтеза.

Недостатком этого штамма является длительность процесса культивирования - 38 часов, а также необходимость его выращивания на средах, в которые входят нестандартные пищевые компоненты - кукурузный экстракт, осахаренный крахмал, которые повышают стоимость питательных сред, делают их менее стандартными, а также снижают удельную активность фермента протеазы в культуральной жидкости, поскольку с ними вносится дополнительный белок.

Задачей изобретения является создание нового штамма Bacillus subtilis, способного продуцировать протеазу в промышленных объемах на синтетической питательной среде.

Технический результат, получаемый от использования нового штамма, заключается в получении фермента - протеазы с высокой общей и удельной активностью в культуральной жидкости при сокращении длительности процесса культивирования.

Задача решается созданием нового штамма путем селекции из известного штамма Bacillus subtilis 534, регистрационный ВКМВ-1666Д (2), способного к быстрому росту на простых по составу питательных средах.

Штамм Bacillus subtilis 534 многократно пересевали через питательную среду, содержащую возрастающие концентрации антибиотика. Полученную популяцию антибиотикоустойчивого варианта штамма высевали моноспоровым рассевом на агаризованную среду с казеином для выделения колоний, обладающих высокой продукцией протеазы. В результате селекции выделен штамм Bacillus subtilis P1, обладающий высокой продукцией протеазы на простых по составу синтетических питательных средах.

Для подтверждения генетических различий исходного штамма Bacillus subtilis 534 и селекционированного штамма Bacillus subtilis P1 произведен анализ геномного полиморфизма штаммов Bacillus subtilis 534 и P1 методом концевого мечения рестриктазных фрагментов радиоактивной меткой [а-³²Р]ДАТФ с последующим разделением высоковольтным секвенирующим электрофорезом в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (чертеж). На радиоафтографе, представленном на чертеже, можно видеть большое количество общих для штаммов полос. Вместе с тем можно отметить присутствие целого ряда полос, позволяющих выявить имеющиеся различия между исследуемыми штаммами.

Для выявления различий между штаммами в уровне продукции протеазы исследовали зоны гидролиза голодного агара с казеином отдельных колоний популяции исходного штамма 534 и нового штамма Р1. Данные сравнительного анализа представлены в табл.1. Изучали также уровни продукции протеазы в культуральной жидкости, полученной путем выращивания штаммов в жидкой питательной среде с аэрацией и перемешиванием. Протеолитическую активность культуральной жидкости определяли по методу Ansona в модификации Петровой И.С. - Винцюкайте М. М. (3). Сравнительные показатели уровней протеолитических активностей культуральной жидкости штаммов Bacillus subtilis 534 и P1 в сравнении с прототипом представлены в табл.1.

Таким образом, в результате селекции получен новый штамм Bacillus subtilis P1, обладающий высоким уровнем синтеза протеазы и сокращенной длительностью процесса культивирования, что позволяет повысить технологичность процесса получения фермента при использовании штамма Bacillus subtilis P1.

Штамм хранится в виде лиофильно высушенной культуры в вакуумных ампулах в научной лаборатории государственного унитарного предприятия "Иммунопрепарат" г. Уфы.

Штамм Bacillus subtilis P1 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

Вегетативные клетки-палочки овоидной формы с размерами (7-1,3)х((0,5) мкм, расположены отдельно или небольшими цепочками. Образуют внутренние центральные споры овальной формы. В популяции жгутики лофотрихиальные и перитрихиальные. Колонии на мясопептонном агаре плоские, слегка блестящие, белого цвета с ровными краями. На мясопептонном бульоне при температуре 37^oС через 18-24 ч наблюдается равномерное помутнение бульона. Аэроб, грамположительный, обладает подвижностью, оптимальные условия роста при температуре 37^oС и рН 6,0-7,5.

Биохимические свойства.

Не растет в анаэробных условиях, гидролизует мочевину и крахмал, разжижает желатину. Дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Ферментирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, маннит, лактозу. Редуцирует нитраты. Продуцирует каталазу, протеазу. Не обладает лецитиназной активностью. Образует аммиак и сероводород, не образует индол.

Антибиотикоустойчивость
Определение чувствительности штамма к антибиотикам изучали диско-диффузионным методом, используя стандартные диски, пропитанные антибиотиками. Штамм высевали на агаризованную питательную среду и раскладывали диски с антибиотиками, по 5 на чашку Петри. Посевы инкубировали при температуре 37^oС в течение 24 ч. Устойчивыми считали штамм при отсутствии задержки роста антибиотиком.

Штамм обладает устойчивостью к пенициллину, карбенициллину, ампициллину, оксациллину, полимиксину.

Вирулентность
Культура штамма В. subtilis P1 была проверена на вирулентность. Для исследования вирулентности штамм выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 24 ч при температуре 37^oС. Выросшую биомассу смывали 0,9%-ным раствором натрия хлорида и готовили бактериальные суспензии с концентрацией клеток от 0,5 до 5,0 млрд/ в мл. Полученные суспензии вводили белым беспородным мышам массой (16±1) г двумя способами: однократно внутрибрюшинно и пятикратно перорально (по одной дозе ежедневно в течение 5 дней). Результаты испытаний представлены в табл.2.

Наблюдения за животными проводили на протяжении 5 суток после окончания курса инъекций или перорального введения. В этот период все животные оставались активными, хорошо поедали пищевые рационы, прибавляли в весе, физиологические отправления и поведенческие реакции у них не изменялись. Полученные данные свидетельствуют о безопасности штамма Bacillus subtilis P1.

Штамм Bacillus subtilis P1 использовали для получения протеолитического фермента.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Штамм выращивали путем периодического гомогенного глубинного культивирования в ферментере АК-10 с объемом питательной среды - 8 л. Для выращивания штамма Bacillus subtilis P1, с целью получения протеазы используют синтетическую питательную среду, содержащую минеральные соли, в качестве источника азота - мочевину, в качестве источника углерода - мальтозу.

Посевной материал получали выращиванием штамма Bacillus subtilis P1 во флаконах при температуре 37^oС в течение 16-18 ч в жидкой питательной среде того же состава, что и для культивирования. Полученный посевной материал, вносят в объеме 1% от объема питательной среды в ферментере. Ферментацию ведут при температуре 37^oС с аэрацией в течение 24 ч. В результате культивирования получено 6 л ферментсодержащей культуральной жидкости с активностью протеазы 28-32 ПЕ/мл и удельной активностью (20,0±2,0) ПЕ/мг белка.

Пример 2. Штамм выращивали путем периодического гомогенного глубинного культивирования в реакторе Биор-100 с объемом питательной среды - 70 л. Питательная среда и подготовка маточного штамма, как в примере 1.

Полученный посевной материал, вносят в объеме 1% от объема питательной среды в реакторе "Биор - 100". Ферментацию ведут при температуре 37^oС с аэрацией в течение 24 ч. В результате культивирования получено 60 л ферментсодержащей культуральной жидкости с активностью протеазы 30±2 ПЕ/мл удельной активностью (20,0±2,0) ПЕ/мг белка.

Источники литературы
1. А.с. 885253, кл. МКИ³ С 12 N 9/28, 30.11.81.

2. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения воспалительных процессов и аллергических заболеваний// Международная заявка. N 89/09607, WO, 19.10.1989.

3. Петрова И.С., Винцюнайте М.М. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробиологического происхождения //Прикладная биохимия и микробиология. - 1966. - N 2. -С. 322-327.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению нового штамма Bacillus subtilis P-1 - продуцента протеазы с высокой общей и удельной активностью в культуральной жидкости. Штамм получен селекцией из штамма Bacillus subtilis 534 путем многократного пересева через питательную среду с возрастающей концентрацией антибиотика. Размеры клеток (7-1,3)х((0,5) мкм, расположены отдельно или небольшими цепочками, образуют внутренние центральные споры овальной формы. Растет на различных питательных средах. Аэроб, грамположительный, обладает подвижностью, оптимальные условия роста при температуре 37^oС и рН 6,0-7,5. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза протеазы при сокращенной длительности культивирования. 2 табл., 1 ил.

Штамм бактерий Bacillus subtilis P-1 - продуцент протеазы.